Name: 糖基谱研究植物细胞壁聚合物，用微阵列 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: 学习使用糖基微阵列技术分析植物细胞壁聚合物组成。该方法结合单克隆抗体与高通量微阵列平台，可快速比较不同植物组织和物种中的糖链分布特征，为植物生物学研究提供可靠的糖组学工具。

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IEM 感谢丹麦研究理事会（FTP 和 FNU）提供的资金支持。ERL 感谢澳大利亚研究委员会（ARC）DP 项目资助的支持。AB 感谢澳大利亚研究委员会植物细胞壁卓越中心项目资助的支持。

1. 组织采集与制备
<ol>
	<li>采集每种目标植物组织的新鲜组织至少三份，每份取100 mg鲜重（干重不少于10 mg）。以下步骤描述了从营养组织中制备细胞壁材料的方法。对于贮藏组织，需先通过酶法去除不需要的淀粉，再进行细胞壁多糖的提取，方法如前所述13。</li>
	<li>使用液氮和Qiagen TissueLyser II（配备24孔适配器和3 mm碳化钨珠）将样品研磨成细粉（30 Hz，2 × 30秒）。若仅处理少量样品，可使用研钵和研杵。</li>
	<li>将研磨后的样品转移至10 ml塑料锥形管中。</li>
	<li>在室温下用10 ml 80% v/v乙醇洗涤样品，并剧烈涡旋振荡2分钟，以制备细胞壁材料。</li>
	<li>在3,500 × g离心，弃去上清液。重复用70%乙醇洗涤至少三次，或直至上清液澄清，特别是含叶绿素的组织需更彻底洗涤。</li>
	<li>最后用100%丙酮进行一次洗涤，并将含有醇不溶残渣（AIR）的沉淀在室温下静置过夜，使其自然干燥。</li>
	<li>使用0.4 mm2孔径的筛网对AIR样品进行过筛，以获得细而均匀的粉末，并去除研磨不充分而残留的较大颗粒。</li>
	<li>称取10 mg AIR样品至微量离心管中，每管加入一颗3 mm玻璃珠，以助样品混合均匀。</li>
</ol>
2. 细胞壁多糖的提取
<ol>
	<li>将500 μl的50 μM CDTA（pH 7.5）加入各样本中，以提取果胶及与果胶相关的多聚物。</li>
	<li>短暂涡旋振荡管子以确保溶剂与样品充分接触，然后在8 Hz条件下使用TissueLyser混合3小时。</li>
	<li>在 12,000 x g 条件下离心样品，小心移除上清液并置于 4 °C 保存。</li>
	<li>用1 ml去离子水重悬沉淀，以稀释并去除残留溶剂，涡旋混匀后在13,000 × g条件下离心。重复此步骤一次，注意勿扰动沉淀，每次均彻底移除管中液体后再进行下一步操作。</li>
	<li>用 500 μl 含 0.1% w/v NaBH4 的 4M NaOH 溶液，按照步骤 2.1–2.4 中所述 CDTA 提取的相同程序，从剩余的细胞壁沉淀中依次提取交联多糖。NaBH4 用于将多糖还原端的醛基（或酮基）还原为醇基，从而 防止 多糖的碱性剥脱。</li>
	<li>离心后，再次移除上清液并置于4 °C保存，沉淀物用去离子水洗涤两次，然后进行下一步提取。</li>
	<li>作为可选步骤，可使用与步骤 2.1 - 2.4 相同的操作流程，用 500 μl 镉乙二胺溶液（体积分数为 31% 的 1,2-二氨基乙烷与 0.78 M CdO 混合液）提取残留的聚合物（如纤维素）。或者，可采用乙酸/硝酸法测定剩余沉淀中的总纤维素含量（见讨论部分）。</li>
</ol>
3. 打印微阵列
<ol>
	<li>将含有提取细胞壁多糖的上清液在13,000 × g条件下离心，以去除任何颗粒物。</li>
	<li>使用预先设计的自定义布局，将每个样品50 μl加入聚丙烯384孔微孔板中，样品按组织类型和提取类型排列。</li>
	<li>用去离子水将细胞壁多糖样品进行0、5倍和25倍的系列稀释。</li>
	<li>在控制微阵列仪的软件中设置针头高度、收集时间、停留时间以及洗涤步骤等参数。</li>
	<li>打印室的湿度控制在60%，以防止样品蒸发。</li>
	<li>使用LabNEXT软件及对应微阵列布局的程序启动打印任务。</li>
	<li>机器人使用毛细管通道针将样品板中的溶液点样到固定于机器平板上的20 × 20 cm硝酸纤维素膜上。阵列上的每个点包含15 nl溶液，并以三份重复形式点样。</li>
	<li>相同的微阵列在膜上并排打印，打印完成后切割成单独的阵列。</li>
	<li>在每次实验中，可根据需要调整阵列以容纳更多或更少的样品、稀释度或重复数。</li>
</ol>
4. 糖芯片的探针检测
<ol>
	<li>打印后，在室温下用含5% w/v脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液（MPBS）封闭各微阵列2小时，以减少非特异性结合。</li>
	<li>在MPBS中加入针对细胞壁多糖表位的单克隆抗体，孵育微阵列2小时。大多数针对细胞壁多糖的单克隆抗体可从三家公司商业购得：Biosupplies（<a href="http://www.biosupplies.com.au" target="_blank">www.biosupplies.com.au</a>）、Carbosource Services（<a href="http://www.carbosource.net" target="_blank">www.carbosource.net</a>）和PlantProbes（<a href="http://www.plantprobes.net" target="_blank">www.plantprobes.net</a>）。</li>
	<li>设置阴性对照，即仅加入MPBS而不加一抗的微阵列。</li>
	<li>用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤微阵列3次，每次5分钟，以去除非特异性结合。</li>
	<li>在MPBS中加入与辣根过氧化物酶（HRP）偶联的二抗，孵育微阵列2小时。大多数针对细胞壁多糖的单克隆抗体需使用抗小鼠或抗大鼠的二抗。</li>
	<li>重复用PBS缓冲液洗涤3次，每次5分钟，以去除非特异性结合。</li>
	<li>使用显色底物（3,3-二氨基联苯胺）或化学发光底物（鲁米诺）显影微阵列。</li>
</ol>
5. 定量分析
<ol>
	<li>显色完成后，使用高分辨率（1,200 dpi）台式扫描仪扫描各个微阵列，并将图像保存为负片模式的16位TIFF文件（图3）。</li>
	<li>使用配备自动网格工具的Xplore图像处理软件（LabNEXT）计算每个点的积分光密度。每个点的积分光密度值来源于围绕该点的网格区域内所有像素值的总和。</li>
	<li>每个微阵列的网格数据以txt文件格式导出，可手动导入Excel电子表格进行分析。已开发一种在线工具（<a href="http://arraytemplates.charliehart.com.au/" target="_blank">http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/</a>），可自动转换和处理单个txt文件中的数据。</li>
	<li>通过对打印重复点和稀释梯度取平均值，计算得到每个样本的“平均点强度”值（图2）。或者，也可仅使用阵列上对应单一稀释度的点信号来量化各样本中糖链表位的相对丰度。</li>
	<li>不同样本间的相对平均点强度可通过Excel中的条件格式或在线热图工具（<a href="http://bar.utoronto.ca/welcome.htm" target="_blank">http://bar.utoronto.ca/welcome.htm</a>）以热图形式展示（图4）。每种抗体类型的数据均标准化至100，并设定5%的截断值，以消除背景信号和假阳性结果。</li>
</ol>

<ol><li>Carpita, N. C., Gibeaut, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+models+of+primary+cell+walls+in+flowering+plants%3A+consistency+of+molecular+structure+with+the+physical+properties+of+the+walls+during+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth.</a> Plant J. 3, 1-30 (1993).</li>
<li>Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofuels%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Biofuels.</a> Curr. Biol. 17, 115-119 (2007).</li>
<li>Willats, W. G., Orfila, C., Limberg, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+degree+and+pattern+of+methyl-esterification+of+pectic+homogalacturonan+in+plant+cell+walls.+implications+for+pectin+methyl+esterase+action%2C+matrix+properties%2C+and+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Modulation of the degree and pattern of methyl-esterification of pectic homogalacturonan in plant cell walls. implications for pectin methyl esterase action, matrix properties, and cell adhesion.</a> J. Biol. Chem. 276, 19404-19413 (2001).</li>
<li>Doblin, M. S., Pettolino, F., Bacic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+cell+walls%3A+the+skeleton+of+the+plant+world%5BTitle%5D)+AND+%22Functional+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Plant cell walls: the skeleton of the plant world.</a> Functional Plant Biology. 37, 357-381 (2010).</li>
<li>Carpita, N., Tierney, M., Campbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+the+plant+cell+wall%3A+searching+for+the+genes+that+define+structure%2C+architecture+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of the plant cell wall: searching for the genes that define structure, architecture and dynamics.</a> Plant Molecular Biology. 47, 1-5 (2001).</li>
<li>Sarria, R., Wagner, T. A., O'Neill, M. A., Faik, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+family+of+Arabidopsis+genes+related+to+xyloglucan+fucosyltransferase1%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a family of Arabidopsis genes related to xyloglucan fucosyltransferase1.</a> Plant Physiol. 127, 1595-1606 (2001).</li>
<li>Somerville, C., Bauer, S., Brininstool, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+systems+approach+to+understanding+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Toward a systems approach to understanding plant cell walls.</a> Science. 306, 2206-2211 (2004).</li>
<li>Willats, W. G. T., Knox, J. P. Molecules in context: probes for cell wall analysis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWillats%2C+WGT+%22The+Plant+Cell+Wall%22">The Plant Cell Wall</a>. Rose, J. K. C. , Blackwell. 92-110 (2003).</li>
<li>Pattathil, S., Avci, U., Baldwin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+Toolkit+of+Plant+Cell+Wall+Glycan-Directed+Monoclonal+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive Toolkit of Plant Cell Wall Glycan-Directed Monoclonal Antibodies.</a> Plant Physiology. 153, 514-525 (2010).</li>
<li>Moller, I. E., Sørensen, I., Bernal, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+mapping+of+cell-wall+polymers+within+and+between+plants+using+novel+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+J%22%5BJournal%5D)">High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays.</a> The Plant J. 50, 1118-1128 (2007).</li>
<li>Sørensen, I., Willats, W. G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+characterization+of+plant+cell+walls+using+carbohydrate+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Screening and characterization of plant cell walls using carbohydrate microarrays.</a> Methods Mol. Biol. 715, 115-121 (2011).</li>
<li>Moller, I. E., Licht, D. eF. ine, Harholt, H. H., J,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+plant+cell-wall+polysaccharide+decomposition+in+leaf-cutting+ant+fungus+gardens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The dynamics of plant cell-wall polysaccharide decomposition in leaf-cutting ant fungus gardens.</a> PLoS One. 6 (3), e17506(2011).</li>
<li>Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+procedures+for+the+determination+of+polysaccharide+composition+of+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chemical procedures for the determination of polysaccharide composition of plant cell walls.</a> Nature Protocols. , In Press (2012).</li>
<li>Clausen, M. H., Willats, W. G. T., Knox, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+methyl+hexagalacturonate+hapten+inhibitors+of+anti-homogalacturonan+monoclonal+antibodies+LM7%2C+JIM5+and+JIM7%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydrate+Res%22%5BJournal%5D)">Synthetic methyl hexagalacturonate hapten inhibitors of anti-homogalacturonan monoclonal antibodies LM7, JIM5 and JIM7.</a> Carbohydrate Res. 338, 1797-1800 (2003).</li>
<li>Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+complexity+of+arabinan+polysaccharides+and+their+processing+in+plant+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls.</a> Plant J. 59, 413-425 (2009).</li>
<li>Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNIT+12.10+Preparation+and+Analysis+of+Glycan+Microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">UNIT 12.10 Preparation and Analysis of Glycan Microarray.</a> Current Protocols in Protein Science. , (2011).</li>
<li>McCartney, L., Blake, A., Flint, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+recognition+of+plant+cell+walls+by+microbial+xylan-specific+carbohydrate-binding+modules%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Differential recognition of plant cell walls by microbial xylan-specific carbohydrate-binding modules.</a> PNAS. 103, 4765-4770 (2006).</li>
<li>Caño-Delgado, A. I., Metzlaff, K., Bevan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eli1+mutation+reveals+a+link+between+cell+expansion+and+secondary+cell+wall+formation+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The eli1 mutation reveals a link between cell expansion and secondary cell wall formation in Arabidopsis thaliana.</a> Development. 127, 3395-3405 (2000).</li>
<li>Manabe, Y., Nafisi, M., Verhertbruggen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss-of-Function+Mutation+of+REDUCED+WALL+ACETYLATION2+in+Arabidopsis+Leads+to+Reduced+Cell+Wall+Acetylation+and+Increased+Resistance+to+Botrytis+cinerea%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Loss-of-Function Mutation of REDUCED WALL ACETYLATION2 in Arabidopsis Leads to Reduced Cell Wall Acetylation and Increased Resistance to Botrytis cinerea.</a> Plant Physiology. 155, 1068-1078 (2011).</li>
<li>Updegraff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semimicro+determination+of+cellulose+in+biological+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Semimicro determination of cellulose in biological materials.</a> Anal. Biochem. 32, 420-424 (1969).</li>
<li>21Moller, I., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+monoclonal+antibodies+against+plant+cell+wall+glycans+by+hierarchial+clustering+of+their+carbohydrate+microarray+binding+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconjugate+Journal%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchial clustering of their carbohydrate microarray binding profiles.</a> Glycoconjugate Journal. 25, 37-48 (2007).</li>
<li>Sørensen, I., Pettolino, F. A., Wilson, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+linkage+%281%E2%86%923%29%2C%281%E2%86%924%29-%CE%B2-D-glucan+is+not+unique+to+the+Poales+and+is+an+abundant+component+of+Equisetum+arvense+cell+walls%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Mixed linkage (1→3),(1→4)-β-D-glucan is not unique to the Poales and is an abundant component of Equisetum arvense cell walls.</a> Plant J. 54 (13), 510-521 (2008).</li>
<li>Domozych, D. S., Sørensen, I., Willats, W. G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+cell+wall+polymers+during+antheridium+development+and+spermatogenesis+in+the+Charophycean+green+alga%2C+Chara%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The distribution of cell wall polymers during antheridium development and spermatogenesis in the Charophycean green alga, Chara.</a> 2104, 1045-1056 (2009).</li>
<li>Singh, B., Avci, U., Eichler Inwood, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specialized+outer+layer+of+the+primary+cell+wall+joins+elongating+cotton+fibers+into+tissue-like+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A specialized outer layer of the primary cell wall joins elongating cotton fibers into tissue-like bundles.</a> Plant Physiol. 150, 684-699 (2009).</li>
<li>Øbro, J., Sørensen, I., Derkx, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+of+Erwinia+chrysanthemi+pectin+methylesterase+variants+using+carbohydrate+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening of Erwinia chrysanthemi pectin methylesterase variants using carbohydrate microarrays.</a> Proteomics. 9, 1861-1868 (2009).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

CoMPP 是一种快速且灵敏的方法，可在数天内对数百种植物来源样品的聚糖组成进行分析。该方法补充了已有的细菌或哺乳动物聚糖芯片平台，可用于高通量筛选碳水化合物与聚糖结合蛋白（如凝集素、受体和抗体）之间的相互作用16。由于存在大量可用于检测细胞壁聚糖的探针，因此有可能获得有关植物细胞壁中所有主要多糖类别聚糖表位的详细信息8,9。然而，这些探针仅涵盖已鉴定聚糖结构中的一小部分8,9，在某些情况下限制了CoMPP的全面解析能力。尽管如此，近年来通过使用针对植物聚糖的碳水化合物结合模块（CBMs）17，以及针对由非糖基残基（如酚类18和乙酰基残基19）修饰糖基残基所形成的表位的CBMs，已进一步拓展了这一技术的能力，这些修饰残基在聚糖功能中发挥着重要作用。
尽管CoMPP可测定一组样品中糖类的相对含量，但通过将特定样品中的结合信号与已知标准品的信号进行比较，仍有可能对连续提取物中的表位水平进行定量（图3B和C）。虽然基于微阵列...

<table><tbody><tr><td>3 毫米碳化钨珠</td><td>Qiagen</td><td>69997</td><td></td></tr><tr><td>收集用微量离心管（1.2 毫米）</td><td>Qiagen</td><td>19560</td><td>也可使用 1.5 毫升微量离心管</td></tr><tr><td>Qiagen TissueLyser II</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>3 毫米玻璃珠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z143928</td><td></td></tr><tr><td>CDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34588</td><td></td></tr><tr><td>氧化镉</td><td>Sigma Aldrich</td><td>202894</td><td></td></tr><tr><td>1,2-二氨基&amp;#8211;乙烷</td><td>Sigma Aldrich</td><td>03550</td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜（0.22 &amp;mu;m 孔径）</td><td>GE-water process technologies</td><td>EP2HY00010</td><td>不同孔径的膜适用于不同类型的点样针</td></tr><tr><td>Xact II 微阵列点样机器人</td><td>Labnext</td><td>001A</td><td>Xact II 机器人配备了一个定制的 20 × 20 厘米陶瓷板，用于固定硝酸纤维素膜</td></tr><tr><td>Xtend RM 微阵列点样针</td><td>Labnext</td><td>0037-350</td><td>点样针必须适用于在膜上点样</td></tr><tr><td>384 孔微量滴定板（聚丙烯）</td><td>Greiner</td><td>781207</td><td></td></tr><tr><td>抗聚糖单克隆抗体</td><td>Plant Probes/&lt;br/&gt; CarboSource/Biosupplies</td><td></td><td>相关网站：PlantProbes（&lt;a href=&quot;http://www.plantprobes.net&quot; target=&quot;_blank">www.plantprobes.net&lt;/a&gt;）、Carbosource（&lt;a href=&quot;http://www.carbosource.net&quot; target=&quot;_blank">www.carbosource.net&lt;/a&gt;）和 Biosupplies（&lt;a href=&quot;http://www.biosupplies.com.au&quot; target=&quot;_blank">www.biosupplies.com.au&lt;/a&gt;）。</td></tr><tr><td>抗大鼠 IgG（全分子）- 辣根过氧化物酶标记山羊抗体</td><td>Sigma</td><td>A9037</td><td>二抗的类型取决于所用的一抗（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;由大鼠、小鼠、山羊等动物制备）。</td></tr><tr><td>SIGMA&lt;em&gt;FAST&lt;/em&gt; 3,3'-二氨基联苯胺片剂</td><td>Sigma</td><td>D4293</td><td>显色试剂的类型取决于所用的二抗及检测方法（比色法或化学发光法）。</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico 化学发光底物</td><td>Thermoscientific</td><td>34080</td><td>参见上文</td></tr><tr><td>Xplore 图像处理软件</td><td>LabNext</td><td>008</td><td>目前有多种具备自动网格化工具的软件可用于测量微阵列点的像素值。</td></tr><tr><td>植物多糖</td><td>Sigma/Megazyme</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

利用微阵列对植物细胞壁多糖进行糖谱分析

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays 

植物细胞壁是由多种异质性多糖构成的复杂基质，在植物的生理和发育过程中发挥着重要作用，并为人类社会提供原材料（例如木材、造纸、纺织和生物燃料工业）1,2。然而，这些组分的生物合成及其功能的研究仍然具有挑战性。
由于构成细胞壁多糖的基本单元——糖基残基的复杂性，细胞壁多糖在化学结构和构象上具有高度多样性。这些糖基残基可在多个位置形成糖苷键，并在环状结构、异构体或异头构型上存在差异，此外还带有多种非糖残基的取代基。多糖的组成在不同细胞和/或组织类型中有所不同，甚至在同一细胞壁的不同亚区域也存在差异3。此外，其组成在发育过程中1或响应环境信号时4也会发生改变。
已有超过 2,000 个基因被预测参与拟南芥（Arabidopsis）细胞壁多糖的生物合成与修饰5。然而，其中仅有少数生物合成基因得到了功能表征4,5。由于这些基因在不同细胞类型间常常差异表达，且表达水平通常较低，因此采用反向遗传学方法研究较为困难6。此外，基因冗余或补偿机制往往会阻碍突变体研究，以确保细胞壁功能得以正常维持7。因此，亟需开发新的方法，以快速表征多种多样的多糖结构，并推动功能基因组学在细胞壁生物合成与修饰研究中的应用。
单克隆抗体（mAbs）8,9 已成为确定植物中聚糖结构与分布的重要工具。这些抗体可识别存在于主要类别的植物细胞壁聚糖中的特异性表位，包括果胶、木葡聚糖、木聚糖、甘露聚糖、葡聚糖和阿拉伯聚半乳聚糖。近年来，其应用已扩展到大规模筛选实验，以同时测定多种植物和组织类型中聚糖的相对丰度9,10,11。
本文介绍了一种基于微阵列的聚糖筛选方法，称为综合微阵列多聚物谱型分析（Comprehensive Microarray Polymer Profiling, CoMPP）（图1和图2）10,11，该方法利用微型化微阵列平台，减少试剂和样品用量，可实现对多个样品（约100个）进行高通量筛选。微阵列上的点信号可进行正式定量，从而获得有关聚糖表位出现情况的半定量数据。该方法特别适用于追踪复杂生物系统中聚糖的变化12，并在缺乏细胞壁组成先验知识的情况下，提供其整体组成概况。

利用CoMPP技术测定了Nicotiana alata花中六种组织类型（花药丝、花粉、子房、花瓣、萼片和柱头）中糖类的相对丰度。图3A显示了一个代表性微阵列，该阵列使用了单克隆抗体JIM5进行探针检测，JIM5特异性识别部分（低）甲酯化的同型半乳糖醛酸聚糖（HG），该表位存在于果胶多糖上14。JIM5表位在所有花组织的CDTA提取物中均被检测到，但在花粉中含量最高，在柱头组织中最低（图3A和4A）。有趣的是，JIM5表位在花粉的NaOH提取物中也有检出，但在其他组织中则未检测到（图3A）。
通过在微阵列上加入一系列纯化的多糖作为内标，可以获得有关目标糖链发生情况的定量信息（图3B）。用单克隆抗体 JIM5 检测不同组织提取物的斑点总强度，并与一系列稀释浓度的同型半乳糖醛酸聚糖（甲酯化程度为25%，DE）所产生的信号进行比对。在子房组织中，每个样品大约含有157 μg 含 JIM5 表位的同型半乳糖醛酸聚糖，约占总细胞壁残渣重量的1.5%（<...

本文介绍了一种称为综合微阵列多聚物谱型分析（Comprehensive Microarray Polymer Profiling, CoMPP）的技术，用于植物细胞壁多糖的表征。该方法结合了针对特定多糖表位的单克隆抗体的特异性与微型微阵列分析平台，可在多种生物学背景下对多糖的存在进行高通量筛选。

植物细胞壁是由多种异质性聚糖组成的复杂基质，在植物的生理功能和发育过程中发挥着重要作用，并提供了……

本实验的总体目标是利用聚糖微阵列技术，比较多种植物或组织类型之间的细胞壁多聚物组成。首先，采集目标植物组织。经均质化处理后，制备醇不溶性残渣。然后使用 CDTA 和氢氧化钠依次提取细胞壁多糖。接着利用机器人将细胞壁多糖提取物打印到微阵列上。用针对细胞壁多糖的单克隆抗体探针检测微阵列，并对微阵列上的信号斑点进行定量分析。最终，结果可用于确定目标样本集中聚糖表位的相对丰度。当我们意识到需要同时对多种植物组织类型提供细胞壁聚糖分布的全局概览并检测其组成差异时，开发了这种微阵列方法。与传统的单糖分析等方法相比，该技术的主要优势在于它是一个基于微阵列的平台，可同时筛选数百个样本。这是一种快速且全面的细胞壁组成分析方法。针对每种目标组织，使用液氮处理，从100毫克新鲜组织重量的三份重复样品开始操作。将样品研磨至细粉状，然后将匀浆转移至10毫升塑料锥形管中以制备细胞壁材料。用10毫升80%乙醇在室温下重悬匀浆，并剧烈涡旋振荡2分钟。以3,500 × g离心样品，并弃去上清液。用70%乙醇重复洗涤至少三次，或直至上清液澄清。然后用100%丙酮进行最后一次洗涤。将醇不溶性残渣置于空气中过夜晾干，得到细而均匀的粉末，再用孔径为0.4平方毫米的筛网对醇不溶性残渣样品进行过筛。接下来，将10毫克的醇不溶性残渣样品称取到含有一个3毫米玻璃珠用于混匀的微量离心管中。为提取果胶及与果胶相关的多糖，向每个样品中加入500微升50毫摩尔的CDTA，短暂涡旋混匀后，在8赫兹条件下使用组织研磨器混匀3小时。将样品在12,000 × g条件下离心。小心移除上清液，并在4°C下保存。用一毫升去离子水清洗沉淀物两次。从含有剩余细胞壁沉淀的离心管中彻底去除所有液体。使用500微升含0.1%氢化钠的4摩尔氢氧化钠溶液进行交联聚糖的提取。按照前述提取步骤操作，将含有交联聚糖的上清液在4摄氏度下保存。用去离子水将沉淀物清洗两次。然后使用 500 µL 的 Cain。通过离心去除残留的聚合物（如纤维素），收集含有提取细胞壁聚合物的上清液，以除去任何颗粒物质。随后，根据预先设计的自定义布局，将每个样品 50 µL 加样至聚丙烯 384 孔微孔板中，样品按照组织类型和提取类型进行排列。接下来，用去离子水稀释细胞壁聚合物样品，制备0.5倍和25倍的系列稀释液。设置微阵列的针头高度、收集时间、停留时间及洗涤步骤等参数。将打印室的湿度控制在60%，以防止样品蒸发。现在开始打印。机器人使用毛细管通道针将样品板中的溶液打印到固定在仪器平面上的硝酸纤维素膜上。芯片上的每个点样含有15纳升溶液，并以三份重复的形式打印。在膜上相邻位置打印相同的微阵列，并切割成单独的阵列。为降低非特异性结合，将每个微阵列在室温下用5%脱脂奶粉溶液封闭两小时。加入针对细胞壁多糖和表位的单克隆抗体，孵育两小时。为去除非特异性结合，用 PBS 洗涤微阵列三次，每次五分钟。随后，在经过三次五分钟的 PBS 洗涤后，加入与辣根过氧化物酶偶联的二抗探针，孵育两小时。使用显色或化学发光底物孵育微阵列。使用高分辨率台式扫描仪扫描各个微阵列。将图像保存为16位负片TIFF文件。使用配备自动网格工具的图像处理软件计算每个点的积分光密度，然后将每张微阵列的网格数据导出为文本文件。随后手动将数据文件导入 Excel 电子表格进行分析。对打印重复点和稀释度的积分斑点强度取平均值，以获得每个样本的平均斑点强度值。使用Excel中的条件格式或在线热图绘制工具，将不同样本间的相对平均斑点强度以热图形式展示。采用相应工具去除每种抗体类型的背景信号和假阳性结果，将数据校正至100，并设定5%的截断值。采用全面的微阵列聚合物分析技术，检测了烟草（nicotiana）六种组织类型中糖类的相对丰度，包括花药丝、花粉子房、花瓣基部、柱头等。在众多花卉组织中，利用特异性识别果胶多糖上某一表位的单克隆抗体 JIM5 对微阵列进行探针杂交。需要注意的是，JIM5 表位在所有花组织的 CDTA 提取物中均被检测到。然而，该成分在花粉中含量最高，在柱头组织中含量最低。有趣的是，JIM5表位也在花粉的氢氧化钠提取物中被检测到，但在其他组织的提取物中则未检测到。通过在卵巢组织微阵列上以不同纯化的多糖作为内标进行处理，生成标准曲线，从而获得定量信息。每个样品中含有 JIM5 表位的 hoog 约为 157 微克，占细胞壁残留物总量的约 1.5%；而在花粉组织中，含有 JIM5 表位的 hoog Ronin 约为 625 微克，占细胞壁残留物总量的约 6.25%。所有组织类型中 15 种聚糖表位的相对丰度以热图形式总结。颜色条带的强度与各样品经调整后的平均斑点强度成正比。该数据的图示化呈现有助于快速解读不同花组织间糖链表位分布的差异。这些结果表明，各个糖链表位在多种花类型中具有独特的分布模式。例如，LM13 表位在雄蕊花丝和 SE L 组织中的丰度显著高于其他组织。这种模式与单克隆抗体LM6优先识别的较短链表位的模式形成显著对比。交联多糖在多种花中的出现也具有不同的分布模式。例如，LM10表位在柱头组织中的含量较其他组织丰富，但在子房组织中则不存在。LM15 xog聚糖表位在花瓣和花药丝状体中的含量高于其他组织，而杂合甘露聚糖在花药丝状体中的含量最高。观看本视频后，您应能够充分理解如何提取并测定多种植物及不同组织类型中细胞壁聚糖的相对丰度。掌握微阵列技术后，该方法可在三天内完成。需要牢记的是，在执行本方案的每一步骤时，均应对样品和重复组进行一致性的处理。也可采用其他方法（如乙酸-硝酸法测定）来回答更多问题。例如，在使用 CDTA 和氢氧化钠依次提取果胶和半纤维素后，残留的纤维素绝对含量是多少？该技术在植物细胞生物学领域具有广泛的应用性，可用于快速比较模式植物（如拟南芥和Fisca、Nutella）以及其他植物（如棉花、小麦、桉树和烟草）中的聚糖分布情况。

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科研

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糖基谱研究植物细胞壁聚合物，用微阵列

植物生物质是一种主要的碳中性可再生资源，可用于生物燃料的生产。植物生物质主要由细胞壁组成，这是一种结构复杂的复合材料，称为木质纤维素。本文描述了一种对细胞壁来源的碳水化合物含量和组成进行全面分析的实验方案。...

植物细胞壁（木质纤维素生物质）的全面组成分析 第二部分：碳水化合物

本文描述了一种快速了解细胞外基质中多糖结构的方法。该方法利用了糖基水解酶的特异性和质谱技术的高灵敏度，可分析极微量的样品。此技术可直接应用于组织本身。...

细胞外多糖的寡糖质谱分析（OLIMP）

结晶纤维素是植物细胞壁的重要组成成分。然而，在细胞分辨率下对其进行定量在技术上具有挑战性。本文中，我们报道了利用偏振光技术结合根部横切片，以获取具有时空分辨率的细胞壁组分信息。...

高分辨率定量分析结晶纤维素的积累 拟南芥 监测组织特异性细胞壁修饰的根部方法

本方案描述了通过在酶解（内切木聚糖酶）前用2-氨基苯甲酰基标记还原端（RE），然后利用质谱（MS）和核磁共振（NMR）分析产生的寡糖，从而对异木聚糖的还原端及内部区域糖基序列进行结构表征的具体技术。...

利用酶法、化学（甲基化）及物理（质谱、核磁共振）技术测定植物细胞壁杂聚木聚糖序列

本文描述了一种以甘露聚糖为例，通过凝胶电泳（PACE）进行多糖结构分析的实验方案。...

利用PACE对植物细胞壁甘露聚糖的结构表征

我们介绍一种简单快速的方法，用于制备和分析不同品种萝卜（Raphanus...

使用PNGase H+分析萝卜（Raphanus sativus）品种的N-聚糖

本文介绍了一种用于制备13C,15N标记的真菌和植物样品的方案，适用于多维固态核磁共振波谱和动态核极化（DNP）研究。...

利用动态核极化固态核磁共振技术进行结构解析的真菌与植物材料制备

本方案详细描述了用于阿拉伯半乳聚糖蛋白和果胶免疫定位的植物材料如何进行固定、包埋于亲水性丙烯酸树脂中、切片并载于玻片上。我们将展示如何利用特异性抗体检测细胞壁相关的表位。...

植物组织细胞壁中阿拉伯半乳聚糖蛋白和果胶的荧光免疫定位

微阵列聚合物分析（MAPP）是一种用于生物样本中糖类成分分析的高通量技术。...

用于高通量聚糖分析的微阵列聚合物谱型分析（MAPP）

使用微阵列进行细菌基因表达分析

学习使用糖基微阵列技术分析植物细胞壁聚合物组成。该方法结合单克隆抗体与高通量微阵列平台，可快速比较不同植物组织和物种中的糖链分布特征，为植物生物学研究提供可靠的糖组学工具。

利用微阵列对植物细胞壁多糖进行糖谱分析

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