Name: 的斑马鱼胚胎神经上皮通透性的测定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: 学习使用荧光示踪剂注射和显微成像技术定量测定斑马鱼胚胎神经上皮通透性。该方法通过测量荧光染料在神经管内的移动距离，帮助研究人员评估不同遗传背景和环境条件下的神经发育过程。

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本工作由国家心理健康研究所和国家科学基金会资助。特别感谢Sive实验室成员提供的许多有益讨论和建设性批评，以及Olivier Paugois在鱼类养殖方面的专业支持。

1. 显微注射前的准备
<ol>
 <li>使用 Sutter 仪器的拉针仪拉制毛细管，制备显微注射针。</li>
 <li>将荧光染料（FITC-葡聚糖）吸入显微注射针中。</li>
 <li>将注射针安装到显微操作器和显微注射装置上。</li>
 <li>使用镊子小心折断显微注射针尖端，使其开口宽度约为 2 μm，但具体尺寸可能因显微注射系统的设置而异。对于本实验所用的注射针，此开口位置对应于从针尖起第一个不发生弯曲的区域。</li>
 <li>在油中测量液滴大小，并调节注射时间和压力，使每次注射量为 1 nl。以 Harvard Apparatus 显微注射仪为例，推荐设置参数为：P balance = 1.4 psi，P out = 1.4 psi，P inject = 22.9 psi，P clear = 67.8 psi，注射时间为 0.4 至 0.7 秒。采用这些参数时，注射针的直径约为 2 μm。但具体参数需根据所用显微注射仪的型号及针头直径进行优化调整。</li>
</ol>
2. 胚胎的制备
<ol>
 <li>每种条件分别用1%琼脂糖水溶液包被2个培养皿，用1-200 μl移液器吸头在琼脂糖上打孔，并移除琼脂糖塞，然后向培养皿中加入胚胎培养基。</li>
 <li>使用镊子在体视显微镜下对18 hpf或更晚期的胚胎进行去壳处理。胚胎分期依据Kimmel et al.11 的标准。</li>
 <li>将去壳后的胚胎转移至第一个包被有琼脂糖的培养皿中。</li>
 <li>为麻醉胚胎，向培养皿中加入三卡因（0.1 mg/ml），直至胚胎停止活动（配制方法参照Westerfield12）。</li>
</ol>
3. 脑室注射
<ol>
 <li>将胚胎的尾部插入孔中，使其背侧朝上，以便观察。若显微操作仪位于右侧，则调整胚胎方向，使前脑朝左，后脑朝右。</li>
 <li>将针头置于后脑室最宽处。</li>
 <li>小心刺穿后脑室的顶板，注意不要刺入过深而穿透脑组织进入卵黄（Figure 1A）。</li>
 <li>向脑室中注射 1–2 nl 荧光染料，确保染料充满整个脑室系统。</li>
 <li>将胚胎转移至第二个涂有琼脂糖并含有胚胎培养基的培养皿中，并按照 2.4 步骤重新进行麻醉。</li>
 <li>立即开始成像，具体操作见第 4 节，以获取时间零点的图像。</li>
</ol>
4. 成像
<ol>
 <li>按照3.1节所述，将胚胎尾部朝向孔洞进行定位。</li>
 <li>使用具备透射光和荧光光源的体视显微镜拍摄胚胎背侧的明场图像。不同胚胎成像时应保持放大倍数一致，以便后续使用Image J（5.2–6）进行分析时可直接比较。</li>
 <li>在不移动胚胎、显微镜或培养皿的前提下，采集相应的荧光图像。</li>
 <li>在预定的时间点，对每个胚胎重复上述操作。</li>
</ol>
5. 染料迁移的定量分析
<ol>
 <li>按照 Gutzman 和 Sive10 之前描述的方法，在 Photoshop 中合并明场与荧光图像。</li>
 <li>使用可在 <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> 获取的 Image J 软件测量染料前沿移动的距离。</li>
 <li>在 Image J 中打开合并后的文件，并使用线条工具从前脑铰链点至染料前沿绘制一条与神经上皮成 10–20 ° 角的直线（图 1A）。选择该区域是因为它是染料从野生型神经上皮渗出的首个且最明显的位点。</li>
 <li>选择测量工具以计算该线段的长度。</li>
 <li>对每个时间点重复上述操作。</li>
 <li>通过从其他时间点的距离中减去 t=0 时的距离，计算染料前沿随时间推移的净移动距离。</li>
 <li>将结果绘制成图表。</li>
</ol>
6. 代表性结果
使用野生型胚胎进行神经上皮通透性检测所获得结果的一个示例如图1B-D所示。为了准确区分通透性的差异，建议使用不同分子量的染料进行测试，以确定在野生型或对照胚胎中仅有轻微渗漏的染料分子大小（如图2所示）。这有助于识别出能够增强或减弱通透性的遗传突变体或环境条件（如图1D中分别以绿色和红色线条表示）。对于24小时受精后（hpf）的斑马鱼神经上皮而言，70 kDa的FITC葡聚糖在2小时内缓慢渗漏，而2,000 kDa的则几乎不渗漏，10 kDa的则几乎立即完全渗出。因此，70 kDa是最适合用于检测神经上皮通透性增强或减弱条件的理想分子量。
如果针头未进入脑室腔，荧光会在 t=0 时出现在脑外（示例见 Gutzman 和 Sive，200910）。此类胚胎应予以弃用，因为注射的染料最初未被限制在脑内，无法对染料的移动及神经上皮的通透性得出明确结论。
最后，如果胚胎的脑室较小或脑室未充盈，可在注射荧光染料前先向脑室内预注射生理盐水。这一步骤可使脑室膨胀，从而在后续注射荧光染料时更易于观察脑室结构。必须设置适当的对照实验，以确定生理盐水的注射是否会影响神经管的正常发育。
<img alt="脑室染料注射示意图；FITC-葡聚糖示踪、时间推移、通透性数据图" src="/files/ftp_upload/4242/4242fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
 图1. 不同分子量染料的时间过程。 （A）实验示意图。首先将荧光染料注射至脑室。X = 注射针头位置。随后随时间采集背部图像。最后测量染料前沿从前脑铰接点移动的距离（以红线表示）。（B-C）22 hpf（t = 0 min，B）和24 hpf（t = 120 min，C）时明场与荧光背部图像的叠加图。白线表示染料前沿至前脑脑室的距离。（D）假设的通透性数据样本。蓝色 = 野生型或对照组，红色 = 相较于对照组通透性降低的样本，绿色 = 相较于对照组通透性增加的样本。
<img alt="鱼类组织成像；FITC扩散分析；不同分子量示意图；荧光研究。" src="/files/ftp_upload/4242/4242fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
 图2. 神经上皮对不同分子量染料通透性的测量。 （A–E）注射了以下分子量的FITC-葡聚糖后，22 hpf野生型胚胎在t=0 min时的背部明场与荧光叠加图像：10 kDa（A）、40 kDa（B）、70 kDa（C）、500 kDa（D）和2,000 kDa（E）。（A'–E'）同一胚胎在t=120 min（24 hpf）时的图像。头端朝左。F=前脑，M=中脑，H=后脑。星号=耳。

<ol><li>Harrington, M. J., Hong, E., Brewster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+neurulation%3A+first+impressions+do+not+count%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Reprod.+Dev%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of neurulation: first impressions do not count.</a> Mol. Reprod. Dev. 76, 954-965 (2009).</li>
<li>Lowery, L. A., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+of+vertebrate+neurulation+and+a+re-evaluation+of+teleost+neural+tube+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Strategies of vertebrate neurulation and a re-evaluation of teleost neural tube formation.</a> Mech. Dev. 121, 1189-1197 (2004).</li>
<li>Salehi, Z., Mashayekhi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+cerebrospinal+fluid+on+neural+cell+survival+in+the+developing+chick+cerebral+cortex%3A+an+in+vivo+study%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurol%22%5BJournal%5D)">The role of cerebrospinal fluid on neural cell survival in the developing chick cerebral cortex: an in vivo study.</a> Eur. J. Neurol. 13, 760-764 (2006).</li>
<li>Martin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+embryonic+brain+development+in+rats+requires+the+trophic+influence+of+cerebrospinal+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Early embryonic brain development in rats requires the trophic influence of cerebrospinal fluid.</a> Int. J. Dev. Neurosci. 27, 733-740 (2009).</li>
<li>Lehtinen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cerebrospinal+fluid+provides+a+proliferative+niche+for+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The cerebrospinal fluid provides a proliferative niche for neural progenitor cells.</a> Neuron. 69, 893-905 (2011).</li>
<li>Gato, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+cerebrospinal+fluid+regulates+neuroepithelial+survival%2C+proliferation%2C+and+neurogenesis+in+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec.+A.+Discov.+Mol.+Cell+Evol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic cerebrospinal fluid regulates neuroepithelial survival, proliferation, and neurogenesis in chick embryos.</a> Anat. Rec. A. Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 284, 475-484 (2005).</li>
<li>Lowery, L. A., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Totally+tubular%3A+the+mystery+behind+function+and+origin+of+the+brain+ventricular+system%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Totally tubular: the mystery behind function and origin of the brain ventricular system.</a> Bioessays. 31, 446-458 (2009).</li>
<li>Lowery, L. A., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+formation+of+zebrafish+brain+ventricles+occurs+independently+of+circulation+and+requires+the+nagie+oko+and+snakehead%2Fatp1a1a.1+gene+products%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products.</a> Development. 132, 2057-2067 (2005).</li>
<li>Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+neuroepithelial+barrier+by+Claudin5a+is+essential+for+zebrafish+brain+ventricular+lumen+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Establishment of a neuroepithelial barrier by Claudin5a is essential for zebrafish brain ventricular lumen expansion.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 1425-1430 (2010).</li>
<li>Gutzman, J. H., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+brain+ventricle+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Zebrafish brain ventricle injection.</a> J. Vis. Exp. , (2009).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203, 253-310 (1995).</li>
<li>Westerfield, M., Sprague, J., Doerry, E., Douglas, S., Grp, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Zebrafish+Information+Network+%28ZFIN%29%3A+a+resource+for+genetic%2C+genomic+and+developmental+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The Zebrafish Information Network (ZFIN): a resource for genetic, genomic and developmental research.</a> Nucleic Acids Research. 29, 87-90 (2001).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

我们展示了定量测定活体斑马鱼胚胎大脑通透性的能力，该通透性通过注射特定分子量的染料来确定。我们观察到斑马鱼胚胎神经上皮对不同分子量的染料具有差异性通透，这表明染料是通过细胞旁通透途径移动的。然而，我们不能排除观察到的通透性中存在跨细胞途径的贡献。只要能够观察到管状结构的内外部，并且能够向管腔内注射，该技术便可应用于其他任何管状结构。但是，其他器官最适分子量的确定仍需进一步研究，因为其可能因组织类型和发育阶段的不同而有所差异。
该检测方法将有助于进一步研究上皮通透性在管腔扩张过程中的作用以及管腔大小的调控机制。此外，该技术将有助于表征与脑积水和多囊肾病等疾病相关的上皮通透性改变。

<table><tbody><tr><td>葡聚糖，荧光素，阴离子型，赖氨酸可固定</td><td>Invitrogen</td><td>D7136, D7137, D1822, D1820, D1845</td><td></td></tr><tr><td>三卡因粉末</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>毛细管</td><td>FHC Inc.</td><td>30-30-1</td><td></td></tr></tbody></table>

斑马鱼胚胎神经上皮通透性检测方法

An Assay for Permeability of the Zebrafish Embryonic Neuroepithelium

脑室系统在脊椎动物中是保守的，由一系列相互连接的腔隙组成，这些腔隙称为脑室，它们在脑发育的最早阶段形成，并在动物的一生中持续存在。脑室系统存在于脊椎动物中，脑室在神经管形成后发育，此时中央管腔充满脑脊液（CSF）1,2。脑脊液是一种富含蛋白质的液体，对正常的大脑发育和功能至关重要3-6。
在斑马鱼中，脑室充盈始于受精后约18小时（hpf），此时神经管已闭合。脑室形成涉及多个过程，包括神经上皮的形成、调控通透性的紧密连接的形成以及脑脊液的产生。我们已证明，Na,K-ATP酶对脑室充盈至关重要，并影响上述所有过程7,8，而claudin 5a是紧密连接形成所必需的9。此外，我们还发现，通过抑制肌球蛋白来实现胚胎神经上皮的“松弛”，与脑室充盈相关。
为了研究斑马鱼脑室膨胀过程中通透性的调控机制，我们开发了一种脑室染料滞留检测方法。该方法利用活体斑马鱼胚胎的脑室注射技术（此技术此前由我实验室建立10），对脑脊液进行荧光标记。随后在一段时间内对胚胎进行成像，观察荧光染料在脑室和神经上皮中的移动情况。通过量化染料前沿随时间从神经上皮基底侧（非管腔侧）向外移动的距离，可评估神经上皮的通透性（图1）。我们观察到，分子量为70 kDa及以下的染料能够穿过神经上皮，并可在受精后24小时（24 hpf）于斑马鱼胚胎脑组织外被检测到（图2）。
该染料滞留实验可用于分析不同遗传背景下、发育不同阶段以及环境干扰后神经上皮的通透性。该方法也可用于研究脑脊液的病理性积聚。总体而言，该技术使研究人员能够分析通透性在发育和疾病过程中的作用及其调控机制。

我们描述了一种对活体斑马鱼胚胎大脑通透性进行定量测量的方法。该技术通过分析脑脊液及不同分子量分子在神经管腔内的滞留能力，并量化其从脑室向外移动的情况，可用于研究发育和疾病过程中上皮通透性及成熟度的差异。

脊椎动物的脑室系统具有保守性，由一系列相互连通的腔隙组成，这些腔隙称为脑室，其形成……

本实验的总体目标是定量分析斑马鱼胚胎神经上皮的通透性。首先向斑马鱼胚胎脑室中注射70千道尔顿的荧光标记葡聚糖，随后采集明场与荧光图像的时间序列。然后测量每个时间点荧光染料距离前脑铰链点的距离。最后计算随时间推移染料迁移的距离。最终，通过比较不同遗传背景或环境条件下的结果，可以获得显示神经上皮通透性变化的数据。本实验的总体目标是定量分析斑马鱼胚胎神经上皮的通透性。在准备注射时，将预先制备好的注射针吸入荧光染料，安装到显微操作器和显微注射装置上。使用镊子小心折断显微注射针尖端，使其直径约为两微米。在油中测量液滴大小，调整注射时间和压力，使每次注射输送一纳升。为准备胚胎，每种条件使用两皿涂有1%琼脂水溶液的培养皿，用200微升移液器吸头在琼脂中打孔并移除琼脂塞。在体视显微镜下用胚胎培养基填充培养皿。使用镊子对受精后18小时或更老的胚胎进行氯化处理。然后将胚胎转移至其中一个涂有农杆菌的培养皿中以麻醉胚胎。向培养皿中加入三卡因（trica），等待胚胎停止活动。通过将胚胎的尾部放入孔中，调整胚胎方向，使其背侧朝上。如果您的显微操作仪位于右侧，则移动胚胎，使前脑位于左侧，后脑位于右侧。将针头置于后脑室最宽处。接着，小心刺穿后脑室顶板，注意不要刺入脑组织过深而进入卵黄。然后向脑室中注射一到二纳升荧光染料，确保染料充满整个脑室。将胚胎转移至第二个含有胚胎培养基的培养皿中，并重新进行麻醉。立即进行成像以获取时间序列数据。使用零图像对胚胎进行成像。在具有透射光和荧光光的解剖显微镜下，像之前一样将胚胎的尾部朝向孔洞摆放。拍摄明场背侧图像。保持胚胎之间的放大倍数恒定，以便在不移动胚胎显微镜或培养皿的情况下进行直接比较。拍摄相应的荧光图像，并对每个胚胎及每个所需时间点重复此操作。为定量分析染料的移动情况，使用 Photoshop 将明场图像与荧光图像合并。然后，为了测量染料前沿移动的距离，使用 ImageJ 打开合并后的文件，并使用线条工具从端脑铰链点向染料前沿画一条线，该线与神经上皮成 10 至 20 度角，选择测量工具以计算该线条的长度。最后，计算净移动距离，即用其他时间点的距离减去零时刻的距离，得到染料前沿随时间的净移动距离。将运动情况绘制在所示的图表上。以下是使用野生型胚胎获得的神经上皮通透性结果示例。此处显示的合并明场图像分别是在受精后22小时和24小时拍摄的。白色线条表示D区前沿与前脑脑室之间的距离。该图表展示了假设的样本通透性数据，用以说明相对于蓝色的对照组胚胎，通透性增加（以绿色表示）或通透性降低（以红色表示）的情况。为了准确区分通透性的变化，建议使用不同分子量的染料进行测试，以确定在野生型或对照组胚胎中仅有轻微渗漏的分子尺寸。这使得能够鉴定出在受精后24小时内增加或降低野生型斑马鱼神经上皮通透性的遗传突变体或环境条件。70千道尔顿的荧光葡聚糖在两小时内缓慢渗漏，而20

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神经科学

的斑马鱼胚胎神经上皮通透性的测定

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