的斑马鱼胚胎神经上皮通透性的测定
October 24th, 2012
我们描述了现场的整个动物的胚胎斑马鱼脑通透性的定量测量。该技术分析神经管的管腔内保留脑脊液和不同分子量的分子的能力，和它们的运动量化满分心室。此方法是非常有用的用于确定在上皮通透性和成熟发展和疾病过程中的差异。
该程序的总体目标是量化斑马鱼、胚胎、神经上皮的通透性。这是通过首先将 70 道尔顿的 fitzy 葡聚糖注射到脑室中来实现的。接下来，获取明场和荧光图像的时间进程。
然后测量荧光芯片在每个时间点与前脑铰链点的距离。最后，计算随时间变化的行驶距离。最终，通过比较不同的遗传背景或环境条件，可以获得显示神经上皮通透性变化的结果。
该程序的总体目标是量化斑马鱼胚胎神经上皮的通透性。为了准备注射加载先前准备好的带有荧光染料的注射针，请将针头安装在机械手和显微注射装置上。使用镊子小心地将显微注射针头折断至大约 2 微米宽。
测量油中的液滴大小，调整注射时间和压力，使每次注射提供 1 纳升为了准备胚胎，在每种情况下在两个培养皿中涂上 1% 的 agros 水溶液，并使用 200 微升移液器吸头，在 agros 上戳孔并取下塞子。在立体显微镜下用胚胎培养基填充培养皿。使用镊子对胚胎进行氯化，胚胎在受精后 18 小时或更长时间内。
然后将胚胎转移到其中一个涂有 agris 的培养皿中以麻醉胚胎。将 trica 加入培养皿中，等待胚胎停止移动。通过将胚胎的尾部放入孔中，将胚胎定向以查看它们的背侧。
如果您的微型纵器在右侧，则移动胚胎，使前脑在左侧，后脑在右侧。将针头放在后脑室最宽的点。接下来，小心地刺穿后脑室的顶板，确保不要穿过大脑的深度进入蛋黄。
然后将 1 到 2 纳升荧光染料注入脑室，确保染料充满大脑的整个长度。心室。将胚胎转移到第二个装满胚胎、培养基的 agros 培养皿中，并重新麻醉它们。立即进行成像以争取时间。
零图像对胚胎进行成像。像以前一样，在具有透射光和荧光的解剖显微镜下，将它们的尾巴放入孔中。拍摄明场背像。
在胚胎之间保持恒定的放大倍数，以便在不移动胚胎显微镜或培养皿的情况下进行直接比较。拍摄相应的荧光图像，对每个胚胎和所需的每个时间点重复。要量化染料运动，请使用 Photoshop 合并明场和荧光图像。
然后要测量染料前沿移动的距离，使用图像 J 打开合并到文件，并使用线条工具从前脑铰链点到芯片前沿画一条线，与神经上皮成 10 到 20 度角，选择测量工具计算线条的长度。最后，计算净距离。D 锋通过从其他时间点减去时间 0 处的距离来随时间移动。
在显示的图表上绘制走势。这是使用野生型胚胎的神经上皮通透性结果的示例。此处显示的合并明场图像分别在受精后 22 小时和 24 小时拍摄。
白线表示 D 前部与前脑室的距离。该图显示了假设的样品通透性数据，这些数据表明能够确定与蓝色对照胚胎相比，通透性的增加（绿色）或红色（红色）所示的通透性降低。为了准确区分通透性，测试不同分子量的染料以鉴定野生型或对照胚胎中仅轻微渗漏的大小是有用的。
这允许识别在 24 小时内增加或减少通透性的遗传突变体或环境条件。受精后，野生型斑马鱼神经上皮。70 kilodalton Fitzy 葡聚糖在两个小时内缓慢泄漏，而 2000 kilodalton 则不会，10 kilodalton 几乎立即泄漏出来。
因此，70 千道尔顿是鉴定增加和减少神经上皮通透性的条件的理想分子量。看完这个视频，你应该对如何量化胚胎斑马鱼的神经上皮通透性有一个很好的了解。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
本文描述了一种定量测量胚胎斑马鱼大脑通透性的方法。该技术评估了神经管腔内脑脊液和各种分子的保留情况，为发育和疾病期间的上皮通透性提供了洞察。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 斑马鱼模型
背景
- 斑马鱼是研究大脑发育的宝贵模型。
- 了解通透性对于洞察神经发育障碍至关重要。
- 通透性的变化可能表明成熟和疾病状态。
- 荧光成像技术提高了测量的准确性。
研究目的
- 量化胚胎斑马鱼神经上皮的通透性。
- 分析神经管内不同大小分子的运动情况。
- 比较不同遗传背景和环境条件下的通透性。
使用的方法
- 向脑室注射70千道顿的fitzy葡聚糖。
- 随时间获取明场和荧光图像。
- 测量荧光染料与前脑铰点之间的距离。
- 计算随时间的移动距离以评估通透性变化。
主要结果
- 获得了神经上皮通透性的定量数据。
- 根据遗传和环境因素观察到通透性的差异。
- 该方法提供了一种可靠的手段来评估大脑发育阶段。
- 结果有助于理解神经发育过程。
结论
- 所描述的方法对于研究斑马鱼的通透性是有效的。
- 研究结果可以为发育生物学和疾病研究提供信息。
- 未来的研究可能会扩展遗传和环境对通透性的影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of neuroepithelial permeability in zebrafish embryos enables early-stage de-risking of CNS target hypotheses and informs the selection of disease-relevant model systems. This assay provides predictive confidence for evaluating genetic and environmental modulators of barrier function, supporting translational continuity from discovery through preclinical research. Integration of permeability metrics into the discovery pipeline enhances portfolio decision-making for CNS-focused programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of neuroepithelial barrier integrity in genetically modified or perturbed embryos.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying the impact of candidate genes or compounds on permeability.
- Facilitates functional target validation for CNS barrier-related pathways.
- Provides quantitative outputs to inform predictive confidence in early-stage CNS programs.
Screening & Assay Development
- Establishes a reproducible, quantitative assay for neuroepithelial permeability using fluorescent dye retention.
- Standardizes measurement of dye movement to enable cross-condition and cross-genotype comparisons.
- Supports scalability for screening genetic backgrounds or environmental conditions affecting barrier function.
- Delivers quantitative readouts suitable for downstream compound evaluation workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant endpoints by modeling pathological CSF accumulation and barrier dysfunction.
- Enables continuity from discovery-stage findings to preclinical validation of CNS barrier modulators.
- Supports risk-adjusted advancement decisions for CNS-targeted therapeutic programs.
- Provides a platform for evaluating translational biomarkers of neuroepithelial integrity.
Pipeline & Workflow Integration
This ventricular dye retention assay positions within the early discovery to preclinical continuum for CNS drug development, enabling hypothesis testing and mechanistic de-risking prior to lead identification.
- Discovery Biology: Quantifies neuroepithelial permeability to clarify pathway function and support target validation.
- Screening: Provides standardized, reproducible outputs for comparing genetic and environmental conditions.
- Analytics: Delivers quantitative distance measurements and permeability rates for robust statistical analysis.
- Translational Research: Models disease-relevant barrier dysfunction and supports biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable assay platform for diverse CNS barrier research applications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS barrier studies.
- Operational Value: Enables assay standardization, reproducibility, and scalability across research teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing early quantitative readouts.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CNS-targeted assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish microinjection and live imaging techniques.
- Demands access to fluorescence microscopy and quantitative image analysis tools.
- Necessitates cross-team standardization of injection volumes and imaging parameters.
- Adaptation to other model systems may require protocol optimization for tissue structure and dye properties.
- Assay sensitivity depends on dye molecular weight selection and precise measurement of dye movement.
