Name: 手动排水的斑马鱼胚胎脑室 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-16T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: 学习手动引流斑马鱼胚胎脑室中的脑脊液技术，用于分析液体成分及其在神经发育中的作用。该方法可监测细胞分裂与神经发生，为发育生物学研究提供重要工具。

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本工作由国家心理健康研究所和国家科学基金会资助。特别感谢Jen Gutzman博士、Amanda Dickinson博士以及Sive实验室其他成员提供的许多有益讨论和建设性批评，感谢Olivier Paugois在鱼类饲养方面提供的专业支持。

1. 制备显微注射针和细胞转移管
<ol>
	<li>根据制造商的说明，用矿物油填充 Eppendorf CellTram 油微注射装置。</li>
	<li>使用 Sutter 仪器的拉针仪拉制毛细管，制备微注射针。</li>
	<li>将注射针安装到与 Eppendorf CellTram 相连的显微操作器上。</li>
	<li>小心折断针尖。为确保针尖尺寸一致，可用千分尺测量，或与参考针进行比较。</li>
	<li>使用 CellTram 将油推入针的全长以充满整个针管，注意避免产生气泡。</li>
</ol>
2. 胚胎的制备
<ol>
	<li>用1-200 μl移液枪头在1%琼脂糖包被的培养皿上戳孔，并移除琼脂糖塞。用胚胎培养基（按Westerfield25方法配制）填充培养皿。</li>
	<li>在体视显微镜下，用镊子去除胚胎的卵膜。</li>
	<li>将去卵膜的胚胎转移至琼脂糖包被的培养皿中。</li>
	<li>为麻醉胚胎，向琼脂糖培养皿中加入Tricaine（0.1 mg/ml），直至胚胎停止运动（按Westerfield25方法配制）。</li>
</ol>
3. 引流脑脊液
<ol>
	<li>将胚胎的尾部置于琼脂糖小孔中，使其后侧靠近显微操作仪，以便观察脑的背侧。</li>
	<li>将针头定位在菱脑节0/1的铰接点或后脑室最宽处（图1A）。</li>
	<li>小心刺穿后脑室的顶板，注意不要穿透脑组织进入卵黄。</li>
	<li>使用CellTram排出脑外液（eCSF），并将液体收集至显微注射针头中。注意避免吸入任何细胞。</li>
</ol>
4. 收集脑脊液用于成分分析
<ol>
	<li>一旦在针头中收集到脑脊液（eCSF），请小心停止CellTram的吸力。</li>
	<li>将培养皿从针头下方移开，并小心地将针头移至含有所需缓冲液的离心管中。</li>
	<li>使用CellTram将针头中的eCSF排入缓冲液中，尽量避免将油滴带入溶液造成污染。</li>
	<li>为了去除与eCSF一同吸入的细胞，将eCSF在10,000 × g条件下离心。收集未受污染的eCSF（上清液），并于-80 °C保存，直至进行后续分析。</li>
</ol>
5. 特定因子的重新引入
<ol>
	<li>在所需时间段内每2小时排空一次脑脊液（eCSF），因为该液体在此期间内会得到补充。在两次排液时间点之间，取出针头并将胚胎保存在28.5 °C或所需温度下。</li>
	<li>用待测因子加载第二根微移液针。</li>
	<li>将针头放入连接至显微注射仪的显微操作器中。</li>
	<li>通过测量油中液滴大小并调整注射时间和压力，将注射体积调节至1 nl。</li>
	<li>按照先前所述方法26向脑室注射1–2 nl。</li>
</ol>

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<li>Kramer-Zucker, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia-driven+fluid+flow+in+the+zebrafish+pronephros%2C+brain+and+Kupffer%27s+vesicle+is+required+for+normal+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis.</a> Development. 132, 1907-1921 (2005).</li>
<li>Lowery, L. A., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+formation+of+zebrafish+brain+ventricles+occurs+independently+of+circulation+and+requires+the+nagie+oko+and+snakehead%2Fatp1a1a.1+gene+products%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Initial formation of zebrafish brain ventricles occurs independently of circulation and requires the nagie oko and snakehead/atp1a1a.1 gene products.</a> Development. 132, 2057-2067 (2005).</li>
<li>Lowery, L. A., De Rienzo, G., Gutzman, J. H., Sive, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+classification+of+zebrafish+brain+morphology+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec.+%28Hoboken%29%22%5BJournal%5D)">Characterization and classification of zebrafish brain morphology mutants.</a> Anat. Rec. (Hoboken). 292, 94-106 (2009).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

采用该技术手动抽取斑马鱼脑室中的胚胎脑脊液（eCSF），将有助于确定eCSF在发育过程中的必要性。此外，该技术可实现对胚胎发育过程中eCSF蛋白质谱的系统描述。在此期间鉴定出的不同蛋白质将推动对脑脊液功能及其在脑发育中潜在作用的进一步研究。在羊膜动物中，已在eCSF中鉴定出一些因子（如IGF2、FGF2、视黄酸和载脂蛋白），已被证实参与神经上皮细胞的存活、增殖及神经发生13,17,20,23,27,28。然而，在脉络丛形成后获取的eCSF中似乎存在数百种尚未表征的蛋白质，其采集时间晚于本研究中所示的时间点。此外，本实验室及其他研究团队已鉴定出具有异常脑室大小或脑部缺陷的斑马鱼突变体29-31，这些突变体可能在eCSF的组成和功能上存在异常。本方法可便捷地用于分离并检测来自突变体或不同环境条件下的潜在异常eCSF。
斑马鱼系统的一个强大应用是：在去除脑脊液（eCSF）后，通过向脑室注射来替换特定因子，从而检测这些因子在脑发育过程中的功能。可测试经遗传或化学干预后获得的小分子、蛋白质以及eCSF。将来自其他物种的eCSF重新引入，将有助于跨物...

<table><tbody><tr><td>Eppendorf CellTram Oil</td><td>Eppendorf</td><td>516 000.025</td><td></td></tr><tr><td>矿物油</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>三卡因粉末</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>毛细管</td><td>FHC 公司</td><td>30-30-1</td><td></td></tr></tbody></table>

斑马鱼胚胎脑室的手动引流

Manual Drainage of the Zebrafish Embryonic Brain Ventricles

脑脊液（CSF）是一种富含蛋白质的液体，存在于脑室系统内。它在脊椎动物胚胎发育早期即已出现，并持续存在于整个生命周期。成体脑脊液被认为具有缓冲大脑、清除代谢废物以及运输分泌分子的功能1,2。在成体及较晚期的胚胎中，大部分脑脊液由脉络丛产生，脉络丛是一组高度血管化的分泌结构，位于脑室附近3-5。在斑马鱼中，脉络丛在受精后144小时（hpf）完全形成6。在此之前，在斑马鱼以及其他脊椎动物胚胎（包括小鼠）中，均已存在大量胚胎期脑脊液（eCSF）。这些数据以及在鸡胚中的研究表明，在发育早期，神经上皮具有分泌功能，可能在脉络丛发育之前是eCSF的主要来源7。
胚胎脑脊液（eCSF）所含蛋白质约为成人脑脊液（CSF）的三倍，提示其在发育过程中可能发挥重要作用8,9。在鸡和小鼠中的研究表明，eCSF中的分泌因子、流体压力或二者共同作用，对神经上皮中的神经发生、基因表达、细胞增殖和细胞存活具有重要意义10-20。对人、大鼠、小鼠和鸡的eCSF进行的蛋白质组学分析已鉴定出多种可能对脑脊液功能至关重要的蛋白质，包括细胞外基质成分、载脂蛋白、调节渗透压的蛋白质，以及参与细胞死亡和增殖的蛋白质21-24。然而，eCSF的复杂功能在很大程度上仍不明确。
我们建立了一种从斑马鱼脑室中移除胚胎脑脊液（eCSF）的方法，从而能够鉴定eCSF的成分，并分析其在发育过程中的必要性。尽管其他具有较大胚胎的脊椎动物体系可收集到更多的eCSF，但斑马鱼可在发育的最早阶段收集eCSF，并可在导致脑室体积或形态异常的遗传或环境条件下进行收集。eCSF的移除与收集使其可用于质谱分析、eCSF功能研究，以及将特定因子重新引入脑室以检测其功能。因此，斑马鱼早期胚胎的可及性为深入分析eCSF在发育过程中的功能提供了便利。

排空脑室的示例见图1B-C。由于缺乏脑室外液（eCSF），脑室呈现塌陷状态（图1B 与 C）。从背侧图像可见（图1B-C 及 图2A-D），后脑神经上皮仍保持其特征性形态，尽管缺乏eCSF，腔体似乎仍开放，这可能是由于存在坚固的铰链点所致。然而，侧视图（图2A'-D'）显示后脑脑室已被排空，这与存在一层薄而柔韧的顶板上皮、其向腹侧塌陷的表现一致。在野生型胚胎中，eCSF会持续生成，并在排空后2-3小时重新充满脑室（图2）。因此，在感兴趣的时间段内需要持续耗尽脑脊液（CSF）。
尽管在24 hpf时移除脑脊液不会破坏整体形态或发育，但在更长的发育阶段持续移除脑脊液可能对整体发育产生不利影响。在评估注入脑室的因子的有效性时，应考虑这一因素。此外，为了确定发育缺陷是由脑脊液的缺失引起，还是由针头穿刺脑组织所致，一个重要的对照实验是将针头插入脑内但不移除脑脊液。
<p class=...

我们介绍了一种收集脑脊液（CSF）并在胚胎斑马鱼脑室系统中创建缺乏脑脊液环境的方法。这使得能够进一步研究脑脊液的成分及其在胚胎脑发育过程中的必要性。

脑脊液（CSF）是一种富含蛋白质的液体，存在于脑室系统内。它在脊椎动物胚胎发育早期即已出现，并……

本实验的总体目标是建立一个在胚胎脑室系统中缺乏脑脊液（CSF）的体系。该目标首先通过人工引流斑马鱼脑室中的胚胎脑脊液（ECSF）来实现，随后收集ECSF以进一步分析其成分。然后将潜在因子重新引入排空的脑室中。最后，分析清除脑脊液（ECSF）以及重新引入因子对大脑发育的影响。最终，通过监测大脑发育的各个方面（如细胞分裂、细胞死亡和神经发生）来揭示斑马鱼脑脊液（ECSF）的功能。此外，可以通过质谱法测定脑脊液（ECSF）的成分。利用该技术，我们可以开始研究胚胎期脑脊液在发育过程中的功能。该方法也可应用于其他系统，以进一步了解改变脑脊液成分和体积的疾病，例如脑积水。首先，根据制造商的说明，用矿物油填充油注射装置。拉制显微注射针后，将针安装到连接油注射装置的显微操作器上。小心地折断针尖，以获得均匀的口径。使用千分尺测量，或与参考针进行比较。使用油注射器将油注入针内，使油沿针的全长推进。用200微升移液器吸头在1%琼脂糖包被的培养皿上打孔，并移除琼脂糖塞。在体视显微镜下用胚胎培养基填充培养皿。使用镊子去除胚胎的卵膜，并将其转移至涂有琼脂糖的培养皿中。通过向培养皿中加入三卡因（trica）以麻醉胚胎，并排出脑脊液（ECSF）。将胚胎的尾部朝向琼脂糖的孔洞，并使其后侧最靠近显微操作器，以便观察脑部的背侧。将针头置于后脑室最宽处，即Therom OMERE零斜杠一铰链点。接着，小心刺穿后脑室的顶板，注意不要刺入过深而穿透脑组织进入卵黄。使用油注射器装置引流ECSF，并将液体收集到微注射针中。注意避免吸入任何细胞。一旦ECSF被收集到针头中，应小心停止油注射器的吸力。在预定的引流时间点之间，每两小时排出一次更新的ECSF。移除针头，并将胚胎置于28.5摄氏度或所需温度下保存。以收集ECSF用于进一步分析。首先，将培养皿从针头下方移开，并小心地将针头插入含有所需缓冲液的离心管中。使用油注射器将针头中的细胞外脑脊液（ECSF）排入缓冲液中，注意避免油污染溶液，以分离ECSF中的细胞。在10,000 ×g条件下离心，收集未被污染的上清液，并于-80°C保存，直至进一步使用。为了重新引入选定的因子，使用第二个针头装载待测因子，并向脑室中注射一到二纳升。此处显示的是引流前后脑室的示例。由于缺乏ECSF，引流后的脑室发生塌陷。这些背侧图像显示，尽管缺乏ECSF，后脑的神经上皮仍保持其特有的形态，并且似乎保持开放状态，这可能是由于存在坚固的铰链点所致。然而，侧位观察显示，后脑室已排空，这与存在一层薄而柔韧的顶板上皮一致，该结构在野生型胚胎中会向腹侧塌陷。脑脊液（ECSF）会持续产生，并在排空后两到三个小时内重新充满脑室。因此，在关注的时间段内需要持续清除脑脊液（CSF）。ECSF 的蛋白质谱与全胚胎提取物不同，在 SDS-PAGE 蛋白质凝胶上的分析表明，可以从斑马鱼 ECSF 中收集到可

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神经科学

手动排水的斑马鱼胚胎脑室

在本视频中，我们演示了一种利用共聚焦显微镜在单细胞分辨率下对活体斑马鱼胚胎中发育中的脊椎动物大脑进行分析的方法。该方法包括对单细胞斑马鱼胚胎进行显微注射，随后对发育中的大脑进行固定和成像的技术流程。...

活体斑马鱼胚胎大脑的共聚焦显微镜成像

神经管形成后，神经上皮发生收缩和折叠，同时神经管内充满胚胎期脑脊液（eCSF），从而形成胚胎脑室。我们开发了这种脑室注射技术，以更清晰地在活体胚胎中区分液体充盈的空间与神经上皮的形态。...

斑马鱼脑室注射

我们描述了一种对活体斑马鱼胚胎大脑通透性进行定量测量的方法。该技术通过分析脑脊液及不同分子量分子在神经管腔内的滞留能力，并量化其从脑室向外移动的情况，可用于研究发育和疾病过程中上皮通透性及成熟度的差异。...

斑马鱼胚胎神经上皮通透性检测方法

本视频介绍了从成年斑马鱼中进行脑组织显微解剖的技术。该方法有助于获取源自全脑的神经球，以便进一步研究。...

斑马鱼脑解剖：一种鱼类神经生物学技术

本视频展示了初级神经球的生成与分化过程。在生长因子存在条件下，斑马鱼的神经干细胞增殖形成具有自我更新能力的悬浮神经球，随后这些神经球可分化为胶质细胞和神经元。...

斑马鱼神经干细胞原代神经球的生成与分化

来源：Schramm, P. et al. 通过去除头骨和皮肤实现清醒斑马鱼幼体和稚鱼全脑组织的活体成像. J. Vis. Exp.

活体成像斑马鱼幼体大脑以可视化小脑神经元

介绍了对幼年斑马鱼脑血管发育进行成像的方法。同时提供了促进三维成像以及利用化学处理手段调控脑血管发育的技术。...

斑马鱼胚胎中脑血管结构的成像与三维重建

斑马鱼脊髓中的增殖、模式形成、分化和轴突导向等发育过程可被便捷地建模。本文介绍一种优化斑马鱼胚胎固定的方法，以实现对这些事件的清晰可视化。...

斑马鱼胚胎的解剖与侧向封片：脊髓发育分析

本文提供了一种可重复的方法，用于通过源自成年斑马鱼全脑或端脑、中脑或小脑区域的神经球实验来检测成年神经发生。此外，我们还描述了在斑马鱼神经球中操控基因表达的操作步骤。...

成年斑马鱼脑源性神经球的分离与培养

本文描述了对斑马鱼胚胎和幼鱼脊髓神经元进行电生理记录的方法。该制备方法可维持神经元 原位 并且通常涉及最少的解剖操作。这些方法可用于对多种脊髓神经元进行电生理学研究，从早期幼体阶段开始即可记录其初始的电兴奋性。...

斑马鱼脊髓感觉和运动神经元电生理记录的 in situ 脊髓制备

活体成像是一种强大的工具，可用于研究神经系统发育背后的细胞机制。本文介绍了一种利用延时共聚焦显微镜实时观察斑马鱼发育过程中大量多色Brainbow标记细胞的技术。...

利用Brainbow技术和活体斑马鱼延时共聚焦成像可视化大脑发育过程

学习手动引流斑马鱼胚胎脑室中的脑脊液技术，用于分析液体成分及其在神经发育中的作用。该方法可监测细胞分裂与神经发生，为发育生物学研究提供重要工具。

斑马鱼胚胎脑室的手动引流

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