通过生物正交点击化学实现病毒表面的化学选择性修饰

本实验的总体目标是展示一种通过点击化学技术灵活改造病毒表面的方法。在该实验的第一步中，用人5型腺病毒感染人胚胎肾细胞，并在非天然氨基酸酸、高丙氨酸或乙酰基糖类似物N-乙酰乙酰基葡萄糖胺存在下进行培养。两天后，收集并纯化带有叠氮标记的腺病毒颗粒。

接下来，利用化学特异性的叠氮-炔环加成反应将荧光探针连接到这些颗粒的表面。如书面实验方案中所述，该步骤可通过两种可能的连接方法之一来完成：无铜催化的应变促进型或铜催化的叠氮-炔环加成反应。

在治疗应用中，这些连接物可包括多肽聚合物或小分子。本实验中使用荧光探针，以便通过SDS-PAGE证明探针与衣壳蛋白的连接。病毒作为基因递送载体的开发备受关注，尤其在治疗学、基因递送、肿瘤治疗及疫苗技术领域。

在这一背景下，调节病毒-宿主相互作用对于实现治疗性组织靶向免疫刺激所需的适当特性尤为重要。在调节宿主-病毒相互作用方面，还有许多其他因素具有重要意义。基于此，我们开发了一种两步标记方案。

第一步是将非天然氨基酸或非天然糖代谢引入细胞。这一步可安装一个锚定点，随后我们能利用高度特异性的化学反应进一步修饰，并将病毒连接上几乎任何所需的功能，同时不会显著干扰病毒的感染性或整体适应性——这是需要克服的主要障碍之一。在对超净台和实验设备进行灭菌后，准备11个直径100毫米的培养皿，其中培养HEK 293细胞，使用HEK生长培养基，在37°C条件下维持培养。

当细胞培养达到80%至90%融合度时，从其中一个培养皿中移除生长培养基，并用TD缓冲液洗涤一次。加入一毫升胰蛋白酶EDTA使细胞松脱，孵育一分钟。然后加入九毫升生长培养基，计数该培养皿中收获的细胞数量。

使用血细胞计数板，计算剩余10个培养皿中每个感染所需的腺病毒颗粒数量。缓慢吸除培养基，然后用5毫升TD缓冲液洗涤。加入1毫升感染缓冲液，并在此期间孵育1小时。

感染后每15分钟轻轻左右摇晃培养皿一次。向每个培养皿中小心加入9毫升HEK生长培养基，再继续孵育18小时。由HA和Sistine的浓缩储备液配制。

根据书面方案配制 HA 标记培养基。务必首先使用 0.2 微米规格的注射器滤器过滤这些储备液。以同样方式对对照组的甲硫氨酸储备液进行灭菌，然后小心地吸除生长培养基，并用五毫升 TD 缓冲液洗涤每一块培养皿。

用 10 毫升 HA 标记培养基替换原有培养基，并将感染的细胞继续孵育 6 小时。此时，病毒衣壳蛋白将在叠氮高丙氨酸存在而甲硫氨酸缺失的条件下进行翻译。随后，小心地将标记培养基替换为 10 毫升新鲜生长培养基，继续孵育 18 小时。

完成此步骤后，继续进行视频中第三步的纯化程序。或者，可通过含有 azi 的糖类引入 azi 标签，而非使用非天然氨基酸 a HA。在本方案中，使用与寄生虫相关的 n-乙酰乙酰基半乳糖胺——UDP-N-乙酰乙酰氨基葡萄糖胺的代谢前体，在含有该乙酰化糖的培养条件下培养寄生虫。

5型腺病毒仅在纤维蛋白上呈现叠氮基团，以进行糖标记。首先按照视频中的步骤一操作，直至出现屏幕提示。此步骤对应于书面方案中的步骤1.5。

首先将100微升ATO糖原液用移液枪加入Falcon管中，使甲醇挥发，以制备糖标记溶液。接着加入100毫升HEK生长培养基。用10毫升该糖标记培养基覆盖每个培养皿中的细胞，并在37摄氏度下孵育44小时。

进入第三步进行纯化。将培养皿中含感染细胞的培养基转移至两个锥形管中，在4摄氏度下以2000 G离心10分钟。

去除上清液，然后在37°C水浴中使用液氮将每个沉淀重悬于四毫升TD缓冲液中。进行三次冻融循环以裂解感染的细胞。每次循环之间使用涡旋振荡器混匀悬浮液。

在 2000 G 条件下离心解冻后的悬液 10 分钟，以沉淀细胞碎片，因为在第一步感染中使用的腺病毒含有 GFP 报告基因，此时观察到荧光活性可证实病毒 DNA 的转导与表达。从 1.25 克/毫升至 1.4 克/毫升小心制备氯化铯密度梯度。将裂解细胞的上清液加至密度梯度上，于 15 摄氏度下以 126,000 G 离心 1 小时。

离心后，离心管中应出现一条浓而宽的条带，即为叠氮修饰的病毒。使用星形L针头穿刺管底，使内容物流出，逐滴小心收集该病毒。

两种连接方法均展示了应变促进连接的效果。应变促进法涉及更简单的反应条件，但其缺点是 commercially available 的探针选择范围较窄，可用于执行应变促进连接。将50微升叠氮修饰的病毒加入病毒储存缓冲液中，与0.25微升Tamara BCN标记溶液混合，用箔纸包裹管盖底部并轻弹混匀，于室温下旋转孵育过夜。

使用离心式凝胶过滤法纯化点击病毒。用病毒储存缓冲液平衡旋转柱。脱氧铜催化环加成反应具有更高的探针可用性，但缺点是需要专用设备以维持脱氧环境。

进行铜催化的连接反应。首先，在氮气手套箱中对所有反应材料和溶液进行六小时的脱氧处理。在此期间结束后，在手套箱内配制铜催化剂储备液以启动反应。取1微升该铜储备液，加入到含有病毒探针和螯合剂的50微升溶液中。

在手套袋中让标记反应过夜进行。按照步骤四的方法通过亲和过滤纯化产物。煮沸10分钟后，加入纯化的、已发生点击反应的病毒和上样缓冲液。

将已交联的病毒和对照样品加入加样孔中，进行电泳。电泳过程中用锡箔覆盖电泳槽，以保护荧光探针免受光照。一小时后，使用荧光凝胶成像仪扫描凝胶。

请注意，完整或未用碘标记的病毒不应导致流感血凝素（HA）的荧光标记发生显著位移，因为高浓度HA条件下产生的病毒由于HA掺入程度更高，其荧光标记更强。还需注意，糖标记病毒仅在纤维衣壳蛋白中表达叠氮标签。从80%汇合度的细胞开始，感染需两天，叠氮标记病毒的收获与纯化需五小时，点击反应需过夜，SDS-PAGE分析需两小时，总计约三天半。总之，本文已展示了两种叠氮标记方法及两种叠氮-炔基点击化学反应。

您的应用和资源应决定哪种方法最适合您的用途。尽管本方案中的所有材料均可商业获取，但我们发现，自行合成 HA 乙酰糖和 INE 探针在成本上显著更具优势，并且在病毒表面修饰方面提供了更大的灵活性。