Name: 病毒遗传背景明确的神经回路跟踪 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 6 s
Description: 了解利用TVA受体特异性进行跨突触病毒追踪神经元回路的新方法。该技术通过病毒感染表达TVA受体的神经元，实现高通量神经回路分析，为神经科学研究提供可靠工具。

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我们感谢Sean Whelan在拯救重组VSV变异体方面提供的帮助，以及Didem Goz和Ryan Chrenek提供的技术协助。本工作由HHMI（CLC）和#NS068012-01（KTB）资助。

<ol><li>Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Marshel, J. H., Mori, T., Nielsen, K. J., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+single+neuronal+networks+for+gene+expression+and+cell+labeling+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeting single neuronal networks for gene expression and cell labeling in vivo.</a> Neuron. 67, 562-574 (2010).</li>
<li>Wall, N. R., Wickersham, I. R., Cetin, A., De La Parra, M., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+circuit+tracing+in+vivo+through+Cre-dependent+targeting+and+complementation+of+modified+rabies+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic circuit tracing in vivo through Cre-dependent targeting and complementation of modified rabies virus.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 21848-21853 (2010).</li>
<li>Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+restriction+of+transsynaptic+tracing+from+single%2C+genetically+targeted+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic restriction of transsynaptic tracing from single, genetically targeted neurons.</a> Neuron. 53, 639-647 (2007).</li>
<li>Yonehara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+asymmetric+reorganization+of+inhibition+establishes+a+motion-sensitive+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatially asymmetric reorganization of inhibition establishes a motion-sensitive circuit.</a> Nature. 469, 407-410 (2011).</li>
<li>Stepien, A. E., Tripodi, M., Arber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+rabies+virus+reveals+premotor+network+organization+and+synaptic+specificity+of+cholinergic+partition+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic rabies virus reveals premotor network organization and synaptic specificity of cholinergic partition cells.</a> Neuron. 68, 456-472 (2010).</li>
<li>Beier, K. T., Samson, M. E. S., Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+expression+of+the+TVA+receptor+allows+clonal+analysis+of+descendents+from+Cre-expressing+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Conditional expression of the TVA receptor allows clonal analysis of descendents from Cre-expressing progenitor cells.</a> Dev. Biol. 353, 309-320 (2011).</li>
<li>Seidler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Cre-loxP-based+mouse+model+for+conditional+somatic+gene+expression+and+knockdown+in+vivo+by+using+avian+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A Cre-loxP-based mouse model for conditional somatic gene expression and knockdown in vivo by using avian retroviral vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 10137-10142 (2008).</li>
<li>Beier, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anterograde+or+retrograde+transsynaptic+labeling+of+CNS+neurons+with+vesicular+stomatitis+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Anterograde or retrograde transsynaptic labeling of CNS neurons with vesicular stomatitis virus vectors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 15414-15419 (2011).</li>
<li>Whelan, S. P., Ball, L. A., Barr, J. N., Wertz, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+recovery+of+infectious+vesicular+stomatitis+virus+entirely+from+cDNA+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Efficient recovery of infectious vesicular stomatitis virus entirely from cDNA clones.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 8388-8392 (1995).</li>
<li>Fuerst, T. R., Niles, E. G., Studier, F. W., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+Transient-Expression+System+Based+on+Recombinant+Vaccinia+Virus+That+Synthesizes+Bacteriophage+T7+RNA+Polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic Transient-Expression System Based on Recombinant Vaccinia Virus That Synthesizes Bacteriophage T7 RNA Polymerase.</a> PNAS. 83, 8122-8126 (1986).</li>
<li>Young, J. A., Bates, P., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+a+chicken+gene+that+confers+susceptibility+to+infection+by+subgroup+A+avian+leukosis+and+sarcoma+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Isolation of a chicken gene that confers susceptibility to infection by subgroup A avian leukosis and sarcoma viruses.</a> J. Virol. 67, 1811-1816 (1993).</li>
<li>Madisen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+and+high-throughput+Cre+reporting+and+characterization+system+for+the+whole+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain.</a> Nat Neurosci. 13, 133-140 (2010).</li>
<li>Franklin, K., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFranklin%2C+K+%22The+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%22">The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates</a>. , Academic Press. San Diego, CA. (1997).</li>
<li>van den Pol, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+strategies+for+studying+the+brain%2C+including+a+replication-restricted+self-amplifying+delta-G+vesicular+stomatis+virus+that+rapidly+expresses+transgenes+in+brain+and+can+generate+a+multicolor+golgi-like+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Viral strategies for studying the brain, including a replication-restricted self-amplifying delta-G vesicular stomatis virus that rapidly expresses transgenes in brain and can generate a multicolor golgi-like expression.</a> J. Comp. Neurol. 516, 456-481 (2009).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

利用病毒研究神经环路是一种相对高通量的分析相连神经元的方法。然而，生成VSV和RABV病毒颗粒并非易事。尽管上述方案提供了从cDNA拯救病毒的步骤，但该过程仍属于低概率事件。N、P和L质粒各自的表达水平需要精细调整，并且必须进行多次试验和重复，以确保成功拯救病毒。包含完整VSV基因组RNA的核糖核蛋白颗粒的形成是一个低概率事件，因此可能需要多次尝试。该技术可能需要一段时间进行优化，但一旦优化完成，病毒拯救将变得容易得多。
当RGC树突树不重叠时，对单个RGC的病毒传播进行分析效果最佳（即 图4A）。注射病毒的剂量和注射坐标可根据最佳感染效果进行调整。此外，注射位置会影响被标记的RGCs的数量和类型（即 上丘或视交叉上核的标记将显示出与外侧膝状体注射不同数量和类型的视网膜神经节细胞（RGCs）。
与PRV和RABV相比，VSV具有多项优势。VSV的表达水平非常迅速，数小时内即可观察到9,15，从而允许更短的孵育时间。在本实验中，A/R...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;组织培养&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>幼仓鼠肾（BSRT7）细胞</td><td>可根据要求提供</td><td></td><td></td></tr><tr><td>痘苗病毒（vTF7-3）</td><td>可根据要求提供</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pN、pP、pl 质粒</td><td>可根据要求提供</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T 细胞</td><td>Open Biosystems</td><td>HCL4517</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 细胞培养处理培养皿</td><td>康宁</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; 带通气盖的矩形斜颈细胞培养瓶</td><td>康宁</td><td>430641</td><td></td></tr><tr><td>培养基：DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）</td><td>Invitrogen</td><td>12491-015</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES pH 7.4</td><td>Gibo</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>FBS：胎牛血清</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>PKS</td><td>Invitrogen</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2,000 转染试剂</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>注射器：5 ml 鲁尔锁式注射器</td><td>Sigma</td><td>Z248010-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>Nalgene</td><td>190-2520</td><td></td></tr><tr><td>PEI：高效线性PEI</td><td>Polysciences</td><td>23966</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;病毒离心&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Corning 150 ml 带管顶真空滤器系统，0.45 &amp;mu;微孔</td><td>康宁</td><td>430314</td><td></td></tr><tr><td>超薄管壁，超透明，38.5 ml，25 x 89 mm 超速离心管</td><td>贝克曼库尔特</td><td>344058</td><td></td></tr><tr><td>超速离心机</td><td>贝克曼库尔特</td><td>optima XL-80K</td><td></td></tr><tr><td>SW28 超速离心机转子</td><td>贝克曼库尔特</td><td>342207</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;小鼠注射&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>毛细玻璃微管</td><td>Drummond</td><td>5-000-2005</td><td></td></tr><tr><td>立体定位</td><td>Narishige</td><td>SR-5M</td><td></td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>Ump 注射器</td><td>World Precision Instruments</td><td>Sys-Micro4</td><td></td></tr><tr><td>四通道微控制器</td><td>世界精密仪器公司</td><td>UMP3</td><td></td></tr><tr><td>M.TXB 台式电机配 C.EMX-1 旋钮控制器，115 伏特</td><td>Foredom</td><td>M.TXB-EM</td><td></td></tr><tr><td>H.10 手柄，快速更换</td><td>Foredom</td><td>H.10</td><td></td></tr><tr><td>阶梯钻，0.5 mm</td><td>Foredom</td><td>A-58005P</td><td></td></tr><tr><td>显微技术&amp;#8211;电极夹</td><td>World Precision Instruments</td><td>MEH2S</td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮</td><td>Henry Schein</td><td>995-2949</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪</td><td>Henry Schein</td><td>4015809TV</td><td></td></tr><tr><td>布托啡诺</td><td>Henry Schein</td><td>1118217</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>Becton-Dickinson</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>30号注射针头</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>保护性眼膏</td><td>福斯特与史密斯医生</td><td>9N-014748</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Sigma</td><td>493511</td><td></td></tr><tr><td>碘</td><td>Sigma</td><td>PVP1</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;手术与解剖工具&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>91402-12</td><td></td></tr><tr><td>标准镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>精细镊子</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>万纳斯弹簧剪</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>手术刀柄</td><td>精细科学工具</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>手术刀片</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>缝合线</td><td>罗宾斯仪器</td><td>20.SK640</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;解剖与抗体染色&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>驴血清</td><td>杰克逊免疫研究实验室</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;抗体&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>抗体</td><td>millipore</td><td>AB144P</td><td></td></tr><tr><td>抗gfp</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>驴抗鸡Dylight 488</td><td>杰克逊免疫研究</td><td>703-545-155</td><td></td></tr><tr><td>驴抗鸡 Alexa Fluor 647</td><td>杰克逊免疫研究</td><td>705-605-147</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;强&gt;组织固定&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Superfrost plus 显微镜载玻片</td><td>Fisher</td><td>12-550-100</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 22 x 22，0 厚度</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>72198-10</td><td></td></tr><tr><td>硅酮弹性体</td><td>罗杰斯公司</td><td>HT-6220</td><td></td></tr><tr><td>透明指甲油</td><td>电子显微镜科学公司</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold 抗荧光淬灭剂</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content"> &lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

基因定义神经环路的病毒示踪

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

研究神经环路的经典方法通量较低。跨突触病毒，特别是伪狂犬病病毒（PRV）和狂犬病毒（RABV），以及近期的水疱性口炎病毒（VSV），在环路研究中的应用正日益广泛。这些高通量方法利用可在神经元之间以顺行或逆行方向传播的病毒。
最近开发了一种用于单突触逆向示踪的改良型狂犬病毒（RABV）。（图1A）。该方法中，病毒基因组中的糖蛋白（G）基因被删除，仅在目标神经元中重新提供。通过使用一种嵌合糖蛋白G（由ASLV-A糖蛋白的胞外域和RABV-G的胞内域组成的A/RG）替代正常的RABV-G1，实现感染的特异性。这种嵌合G蛋白可特异性感染表达TVA受体的细胞1。编码TVA的基因可通过多种方法递送2-8。当RABV感染表达TVA的神经元后，由于与TVA受体共递送的RABV-G的存在，该病毒能够以逆向方式跨突触传播至其他存在突触连接的神经元。该技术可标记出投射到特定细胞类型的相对大量输入神经元（5–10%）2，从而对某一特定起始细胞类型的所有输入通路进行取样分析。
我们最近改进了该技术，使用VSV作为跨突触示踪剂9。VSV具有多项优势，包括基因表达速度快。本文详细描述了一种新的基于VSV的病毒示踪系统，可用于以更高分辨率探究神经微环路。Wickersham 等4 和 Beier 等9 最初发表的策略允许标记所有投射到初始感染的TVA表达细胞上的神经元，而本文中VSV被改造为仅能传播至TVA表达细胞（图1B）。该病毒首先被假型化为携带RABV-G，以感染TVA表达神经元下游的神经元。在感染第一群细胞后，所释放的病毒只能感染TVA表达细胞。由于病毒的跨突触传播仅限于TVA表达细胞，因此可以高分辨率地探究特定细胞类型之间是否存在连接。这些实验的流程图见图2。本文展示了一个模型环路，即小鼠视网膜中的方向选择性环路。我们研究了星形无长突细胞（SACs）与视网膜神经节细胞（RGCs）之间的连接性。

介绍了一种追踪突触连接神经元的方法。我们利用上游细胞中TVA的特异性，检测目标细胞群体是否接收来自基因定义细胞类型的突触输入。

研究神经环路的经典方法通量相对较低。跨突触病毒，特别是伪狂犬病病毒（PRV）和狂犬病毒……

以下实验的总体目标是开发一种用于分析中枢神经系统微环路的新技术。该技术首先通过表达TVA受体来确定可被感染的神经元群体；第二步，将跨突触病毒注射入中枢神经系统，从而感染特定的初级神经元。接下来，病毒将仅通过突触传播至表达TVA受体的连接神经元。为了检验这些神经元是否相互连接，需获得相关结果，以证明该技术可用于分析微环路，其依据是对已知连接微环路标记的有效性验证。与电生理学和显微镜等现有方法相比，该技术的主要优势在于，它是一种高通量分析神经环路的方法。我们最初是在阅读Wickersham及其同事关于单突触限制性病毒示踪的首项研究时，产生了本方法的构想。我们认为，病毒可被进一步改造，以新颖的方式研究存在连接的神经元。有关利用痘苗病毒T7系统通过CD NA恢复VSV并生成用于传代的细胞的详细步骤，请参阅书面实验方案。首先，从前一天接种的四个80%融合度的10厘米培养皿（TV800细胞）中吸出培养基，并更换为5毫升无血清的DMEM。根据标准操作，用5微克编码所选糖蛋白的质粒分别转染每个培养皿。转染约6小时后，更换培养基为添加10% FBS的DMEM，然后将培养皿置于设定为34°C、含5%二氧化碳的组织培养孵箱中过夜培养，以促进糖蛋白的表达及其在细胞表面的积累。孵育结束后，吸除培养基，每孔加入5毫升含10%FBS的DMEM，然后用含有MA狂犬病G嵌合糖蛋白的VSV以0.01至0.1的感染复数（MOI）感染各孔，于34摄氏度继续孵育过夜。24小时后，通过荧光显微镜检测各孔的感染水平。若超过50%的细胞被感染，则收集培养上清。加入五毫升新鲜培养基，然后将收集的培养基在负80摄氏度下冷冻。此后每24小时重复收集一次，持续三天，共进行四天的收集。在最后一次收集的等份样品于负80摄氏度完全冻结后，将每份收集的培养基等份样品分别冷冻。尽管此时所有收集的培养基等份样品均为37摄氏度，应共获得80毫升收集的培养基，并将收集的培养基在冰上通过0.45微米滤器过滤。然后将36毫升病毒液分装至贝克曼离心管中，在4°C条件下以80,000 × g超速离心90分钟，浓缩上清液。离心后务必确保转子已正确平衡，将离心管放入含10%次氯酸钠的废液缸中，并使用抽吸装置去除管壁液体。随后，在4°C条件下以120 rpm振荡含有病毒的离心管1小时，将病毒沉淀重悬于尽可能小的体积中，通常约为30微升。将病毒重新悬浮后，通过用1:10倍比稀释至1:100万的稀释系列感染24孔板中的293T细胞，并在感染后约两天进行滴定。根据标准操作流程，可通过荧光检测病毒感染的细胞。在这些实验中，使用正确的摩尔数（moline）非常重要。目标是使TVA受体在希望进行示踪的细胞类型中表达。这可以通过病毒介导的方式表达TVA受体，或通过转基因等位基因实现。本实验使用六至十周龄的三重转基因小鼠。将表达条件性TVA等位基因的小鼠与表达chat、Cree等位基因的小鼠进行杂交。随后，这些小鼠再与表达荧光TD番茄等位基因的小鼠品系杂交。最终获得的转基因小鼠在所有表达Cree的细胞（包括感兴趣的星形爆发型omicron细胞）中均表达TVA和条件性TD番茄等位基因。这种表达可以通过荧光显微镜进行观察。在小鼠脑图谱中核对目标区域的立体定位坐标，并通过打开微量注射控制器并将推杆和电极夹移动到位来准备立体定位装置。然后用矿物油回填针头，以提供与病毒的界面，再将针头放置在推杆上，确保针头中无气泡。将病毒置于冰上。设置显微注射仪为吸取模式，并将病毒管移至显微注射仪的毛细管下方。将毛细管尖端插入病毒液中，吸取实验所需的病毒量。给予动物术前剂量的丁丙诺啡后，应根据机构指南对其进行适当的麻醉。进行足趾夹捏测试，并确保无反射反应。在开始操作之前。将麻醉后的小鼠置于可移动支架上的加热垫上，以调整小鼠位置。在动物麻醉期间涂抹眼药膏，防止角膜干燥。随后，轻轻将耳杆插入小鼠耳道，将其固定于立体定位仪中。确保头部与体视显微镜的底座平行，且不发生侧向移动。接着，调整咬合杆以帮助固定头部。去除切口区域的毛发。然后用乙醇清洗该区域三次，再用碘液清洗三次。用剪刀在皮肤上做矢状切口以暴露颅骨后，使用自制的手术钩将皮肤推开。接着用BGMA吸取微毛细管，并调节旋钮将微注射器移至侧膝状核的坐标位置。确定外侧膝状体（LGN）位置后，在注射位点对应的颅骨上钻一个小孔。将毛细管置于孔口上方，缓慢下放至刚好位于脑表面背侧的位置，此位置即为背腹向坐标的零点。微毛细管应足够锋利，以刺穿小鼠的硬脑膜。因此，缓慢将其下降至深度2.75毫米处，并以约100升/分钟的速度注入所需剂量的病毒。让针头在脑内停留约七分钟，以使病毒从注射部位充分扩散，并防止病毒沿针道上移。在两分钟的时间内极其缓慢地撤出，将针头从注射部位拔出并离开脑组织。最后缝合手术切口，并监测动物直至其从麻醉中恢复。每12小时给予一次布托啡诺，持续两天。通常，在注射后约24小时可观察到VSV的跨突触扩散。然而，更长的等待时间将导致更广泛的扩散。通过吸入二氧化碳处死小鼠后，将眼球剥离并置于4%甲醛中固定，孵育1小时，确保眼球完全浸没。然后将眼球转移至含有PBS的培养皿中。使用一对55号镊子快速移除角膜，并将视网膜从其他组织中松解并分离。进行整体装片分析。将视网膜在载玻片上切开，使其平铺。在载玻片边缘放置硅胶间隔物，用长效金质封固介质固定，并使用零厚度玻璃盖玻片封片，以用于视网膜切片的分析。将视网膜置于含30%蔗糖的PBS溶液中，直至视网膜完全沉入溶液底部。然后将视网膜置于OCT与30%蔗糖溶液按1:1比例混合的溶液中，处理3小时。最后，迅速冷冻视网膜，并于-80摄氏度保存，直至准备切片。该图像显示了一项时间过程实验，用以证明VSV-A/rg对TVA 800细胞和293T细胞的感染能力。上排图像显示感染后6小时、1天和2天的TVA 800细胞。下排图像显示在相同时间点的293T细胞。病毒在表达TVA的细胞之间数小时内即可传播，而在不表达TVA受体的293T细胞中，尽管病毒仍可传播，但速度要慢得多。比例尺代表 100 微米。该图像显示了非 TVA 表达小鼠视网膜神经节细胞的代表性感染情况。将 vsv A/rg 病毒注射至小鼠外侧膝状体（LGN）中。用 R-A-B-V-G 进行假型化处理后，在注射两天后收获组织。此处可见稀疏感染，黄色箭头所示为视网膜神经节细胞。该图像显示感染更为密集。这可以通过使用更高滴度的病毒以及高质量的注射来实现，如图所示。根据形态学特征可以识别不同类型的视网膜神经节细胞，包括小树突神经节细胞、一类表达黑视蛋白的神经节细胞、方向选择性神经节细胞（DS GCs）以及ON-OFF方向选择性神经节细胞（ON-OFF DS GCs）。此处比例尺代表50微米，如下方来自表达TVA的小鼠图像所示。从on-off DS GCs到星burst细胞的VSVA slash RG跨突触传播遵循预期模式。图中白色箭头所示的on-off DS GCs（绿色填充）将病毒传递至多个由黄色箭头指示的星burst细胞。如图所示，所有非DS GCs的绿色细胞均与Cree报告基因共标记，表明它们是表达TVA的星burst细胞。白色箭头所示的DS GCs（绿色填充）以及黄色箭头所示的星爆型双极细胞（starburst omics），分别位于视网膜内丛状层（IPL）相应的分层中，病毒可传递至这些细胞，包括on和off通路的细胞。星爆型双极细胞（starburst omicron）。图中数字表示IPL的分层。一旦掌握该技术，若操作得当，整个实验可在一至两天内完成。VSV 的速度是采用此方法的主要优势之一。也可采用其他方法，如通道红、基于视蛋白的环路示踪，以验证病毒示踪的神经环路，并分析这些突触连接的特性。观看本视频后，您应能充分理解病毒示踪神经环路的各个主要步骤，包括病毒培养、体内注射，以及对荧光标记神经元的分析。

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科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

病毒遗传背景明确的神经回路跟踪

我们提供了一种示踪剂递送的实用指南 体内...

揭示多色标记中的神经环路拓扑结构

跨突触示踪已成为一种强大的工具，用于通过多突触环路分析调控外周靶标的中枢传出通路。本文介绍了一种利用跨突触伪狂犬病病毒识别并定位功能性脑环路的实验方案，随后结合经典示踪技术，验证该环路中已鉴定神经元群之间的特定连接。...

从外周靶向通过伪狂犬病病毒进行跨突触示踪，继而进行霍乱毒素与生物素化葡聚糖胺双标记

利用一种双元遗传策略，我们提供了一种详细的神经环路示踪实验方案，适用于在Cre介导的重组后表达互补性跨突触示踪剂的小鼠。由于细胞特异性的示踪剂表达由基因编码决定，本实验方法可在单细胞分辨率下研究小鼠胚胎脑发育过程中神经环路的形成与成熟。...

胚胎小鼠大脑中的条件性遗传跨突触示踪

本文介绍了一种基于慢病毒颗粒的方法，用于对成年动物脑内室-脑室下区神经发生微环境中神经干细胞和/或其邻近的室管膜细胞进行长期遗传修饰，从而能够分别分析细胞自主性及非自主性、依赖微环境的效应在神经干细胞中的作用。...

成年小鼠脑室-脑下室区细胞的稳定高效遗传修饰用于分析神经干细胞自主性与非自主性效应

我们介绍一种通过向脑核团注射顺行或逆行示踪剂来标记神经元及其突起的技术，该技术使用一种 体外 制备。我们改进了一种现有的i体外...

脑组织离体标本中的激光引导神经元示踪

本方案描述了通过表达荧光标记物的改良型狂犬病毒进行逆向感染标记后，对特定神经元群体进行的大规模重构，以及独立且无偏倚的聚类分析，从而实现对不同神经元亚类之间形态学参数的全面表征。...

基于形态学指标的大规模重建及无偏独立聚类以分类特定神经元群体

基于体外慢病毒工程技术对神经前体细胞进行改造，并将其共移植到野生型大脑中，结合对“实验”和“对照”衍生细胞的配对形态测量学分析，该方法能够以简单且经济的方式精确模拟体内基因对新皮层神经元形态的调控。...

用于体内神经结构研究的工程化神经前体细胞脑室内移植

本方案旨在利用脑内基于腺相关病毒（AAV）的病毒系统以及FLEX构型的突触素驱动型GFP报告基因，在体内直接重编程生成中间神经元，从而实现细胞的鉴定及后续的体内分析。...

通过脑内注射病毒载体将脑内胶质细胞直接重编程为中间神经元

本方案展示了一种追踪腹侧被盖区（VTA）谷氨酸能投射至海马体的简单方法。通过光刺激VTA谷氨酸能神经元并结合CA1区记录，以展示VTA谷氨酸能末梢如何在体内调节CA1区假定锥体神经元的放电频率。...

腹侧被盖区谷氨酸能神经末梢在海马中的体内解剖与功能联合示踪

本文介绍了一种通过光遗传学工具对特定脑区进行病毒转导的实验方案，以实现对急性啮齿类动物脑切片中特定突触的电生理特性进行表征。...

离体 光遗传学探究内侧前额叶皮层至外侧内嗅皮层的长程突触传递与可塑性

在大脑皮层发育过程中，神经元和胶质细胞起源于衬于脑室壁的室管膜区，并向脑表面迁移。许多基因参与了这一过程。本方案介绍了对迁移中的神经元和胶质前体细胞进行活细胞延时成像的技术。...

胚胎小鼠脑切片中迁移神经元和胶质前体细胞的延时成像

了解利用TVA受体特异性进行跨突触病毒追踪神经元回路的新方法。该技术通过病毒感染表达TVA受体的神经元，实现高通量神经回路分析，为神经科学研究提供可靠工具。

基因定义神经环路的病毒示踪

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