使用LysoTracker检测及鉴别胚胎干细胞在胚胎细胞程序性死亡
2012年10月11日
我们提出了一个简单的协议，可视化地区的小鼠胚胎中的细胞程序性死亡（PCD）和鉴别胚胎干（ES）细胞培养，使用高度水溶性染料LysoTracker。
以下程序的目的是演示如何使用冻干示踪剂染料维持两种样品（小鼠胚胎和分化干细胞）的溶酶体以检测细胞死亡模式。为了制备胚胎样本，首先通过手术分离胚胎并放入培养皿中以制备分化细胞。胚胎干细胞用于制造胚胎体。
这些胚胎体在悬浮液中培养，然后在腔室载玻片上作为单层生长。胚胎都出售单层，可以在 ot tracker red 中孵育，然后冲洗并固定样品，然后可以拍照以检查和量化染色结果，获得显示 Liso Tracker 的染色结果。染色是一种简单的程序，可用于检测胚胎和培养细胞中的程序细胞死亡。
与隧道分析等现有方法相比，该技术的主要优点是，由于 OT 示踪染料是一种小分子，因此可以快速轻松地检测厚组织。虽然这种方法可以深入了解小鼠胚胎和分化培养物中的程序性细胞死亡模式，但它也可以应用于其他组织类型，例如鸡胚胎和分化成体干细胞。将年轻的雌性小鼠与雄性种鼠配对，在接下来的早晨，检查阴道塞，这表明已经发生了交配。
阴道栓出现当天的中午实际上是 0.5 天。在感兴趣的胚胎日发布 cotus，根据批准的方案对雌性实施安乐死，并用 Hank's BSS 将子宫取出至 10 厘米的培养皿中，并冲洗掉任何血液。分离胚胎并将其从子宫中取出。
去除多余的胚胎膜，并用 Hank's BSS 至少冲洗一次，以去除外来组织和血液。清洁时将解剖的胚胎放在冰上。其他人。
准备 5 毫升 Liso 追踪胚胎染色溶液。对于一个或两个胚胎收集来说，这个体积已经足够了。轻轻混合溶液以分散染料，均匀混合，然后将胚胎转移到溶液中，并在 37 摄氏度下孵育 45 分钟。
孵化后，在 Hank's BSS 中轻轻冲洗胚胎四次，每次洗涤 5 分钟。轻柔地冲洗很重要，以免损坏组织。取出液体，慢慢地密切注意娇嫩胚胎的位置，并始终留下一部分液体覆盖它们。
然后在第二天将胚胎固定在 4% 对甲醛中过夜。在 Hank's BSS 中冲洗胚胎一次 10 分钟以去除固定剂。现在通过甲醇系列对组织进行脱水，以消除背景染色。
此步骤提高了储存前成像过程中的信噪比。如果需要，从每个胚胎中收集组织样本进行基因分析。稍后，在基因分型之前对组织样品进行再水化。
将胚胎分成单独的试管中，并带有与组织样本匹配的标签。现在可以将分离的胚胎无限期地储存在零下 20 摄氏度的甲醇中。避光。
首先通过悬滴法准备胚胎体。三天后，以每 20 微升滴 500 个细胞的起始密度，将胚胎体转移到 10 厘米非贴壁培养皿上的悬浮培养物中。培养他们 5 天，5 天后每 2 天更换一次媒体。
将胚胎体转移到糊化的八个腔室载玻片上，在每个腔室中放置一个或两个胚胎体。将胚胎体再培养 10 天。10 天后每隔一天更换一次培养基，轻轻吸出现有培养基，并向每个腔室中加入 300 μL Lyo 追踪细胞染色溶液。
小心地手动移出介质，将移液器吸头放在腔室的角落。这样，您就不会意外地移除，仍然将每个身体从玻璃表面连接起来。再次添加回介质时，将移液器吸头放在腔室的角落，然后非常缓慢地将介质添加回去。
将腔室在 37 摄氏度下孵育 15 分钟。然后用 DPBS 冲洗两次，每次冲洗 5 分钟。现在，在室温下将细胞在 4% Paraldehyde 中固定 15 分钟。
然后用 DPBS 分两次 5 分钟冲洗去除固定剂。要安装胚胎，请将它们放置在深凹陷载玻片或小培养皿感染者防护罩中。通过吸出 DPBS 准备用于显微镜检查的细胞样品。
从载玻片上取下腔室，让它风干约 5 分钟。用箔纸覆盖以保护荧光剂。然后添加水性封固剂，例如带有 dappy 的 vector shield，并在顶部放置盖玻片。
现在载玻片已安装并准备好进行成像。使用配备棒状、domine 或 Texas 红滤光片的解剖或复合显微镜对样品进行可视化。染色通常非常明亮，因此在手动模式下通常不需要长时间曝光。
在相同的曝光条件下拍摄所有样品的数码照片。要量化图像，请在 Adobe Photoshop 或类似的成像程序中打开它们。要确定 lyo 追踪器染色的量，请选择红色通道。
请注意直方图函数显示的整个图像的像素计数。Next 阈值，则图像中使红色染色现在由白色像素表示。这会将图像转换为黑白图像。
选择一个阈值级别，并将此级别用于集中的所有图像。使用颜色范围工具选择白色像素，然后使用直方图函数获取白色像素总数。使用蓝色通道计算场中的细胞核数。
通过注释图像来记录计数、记录值并使用它们来计算每个细胞的平均染色水平可能很有用。对所有剩余图像使用相同的阈值设置重复此分析。为了采样，使用 ly o tracker 对声波刺猬突变胚胎进行染色。
由于 ly O 追踪器是整个胚胎表面深处的小、高度可扩散的分子区域，在 cotus 后 10.5 天染色，程序性细胞死亡或 PCG 在声刺猬无效突变胚胎中大大增加，特别是在肢体和可能的区域。以更高的放大倍率在孔中对肢芽进行成像，以评估整体模式。解剖部分也用振动微音切片。
箭头指向通过低温恒温器隧道染色获得的切片中声刺猬零远端尖端染色的增加，在这些切片中与 OT Tracker 结合使用，尽管 lyo tracker 和隧道染色之间没有严格的一一对应关系，但在较高放大倍率下，PCD 的一般区域重叠很大。可以看到隧道检测染色阳性的穿刺，但看不到仅用天琴模具染色的 otra 模具穿刺和具有重叠染色的穿刺。胚胎体培养 10 天后，细胞分化为多种细胞类型，包括神经元、肌肉细胞和心肌细胞。
在分化的 ES 细胞的正常培养中，有一些细胞经历了 PCD，如 lyo 追踪器和隧道测定所检测到的那样。接下来用过氧化氢处理细胞以诱导氧化应激细胞死亡。与不治疗相比，低剂量过氧化氢增加了 lyo 示踪剂和隧道染色。
与胚胎中的结果类似，两种染色都标记了常见和独特的细胞。高剂量的过氧化氢导致细胞收缩和更广泛的 OT 跟踪器和隧道阳性。为了进行比较，血清饥饿用于在血清饥饿 1 小时后诱导自噬。
OT 追踪器染色增加。然而，隧道阳性率仍处于正常水平。因此，虽然 reer 简单且有用，但重要的是在定量样品后进行其他检测以确定染色是否代表细胞凋亡或自噬。
使用前面演示的简单 Photoshop 方法，结果证实，增加过氧化氢浓度会导致更高水平的 lys 追踪器染色一旦掌握，如果按照此程序正确执行，可以在不到两个小时的时间内完成此染色程序。可以进行其他方法，如 NX in five 或 lc 3 免疫染色，以确认细胞死亡的类型。不要忘记，目前 Trecker green 仅适用于活细胞，因此 Reca red 是需要固定的样品的最佳选择。
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概述
本协议展示了一种使用LysoTracker染料在小鼠胚胎和分化的胚胎干细胞（ES）细胞培养物中可视化程序性细胞死亡（PCD）的方法。该过程包括分离胚胎和准备分化的干细胞以进行染色和分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 发育生物学
背景
- 程序性细胞死亡是发育过程中的关键过程。
- LysoTracker是一种用于染色细胞溶酶体的染料。
- 了解PCD模式可以提供对发育过程的洞察。
- 该方法可以应用于胚胎和培养的细胞。
研究目的
- 可视化小鼠胚胎中程序性细胞死亡的区域。
- 评估分化胚胎干细胞培养物中的PCD。
- 提供简单有效的染色协议。
使用的方法
- 小鼠胚胎的分离和分化干细胞的制备。
- 培养胚胎干细胞以形成胚体。
- 使用LysoTracker染料染色以可视化溶酶体。
- 拍摄染色样品以分析细胞死亡模式。
主要结果
- 成功在两种样本类型中可视化程序性细胞死亡。
- 用LysoTracker观察到清晰的染色模式。
- 证明了染色协议的有效性。
- 结果可以帮助理解发育生物学。
结论
- LysoTracker染色协议是研究人员的有价值工具。
- 它允许评估各种生物样本中的PCD。
- 进一步的研究可以在这些发现的基础上探索发育过程。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative detection of programmed cell death (PCD) using LysoTracker enables high-content analysis of cell viability and death patterns in complex embryonic and stem cell systems. This capability supports early discovery teams in de-risking developmental toxicity and mechanistic ambiguity, directly impacting target validation and translational model fidelity. Integrating robust PCD quantification informs portfolio triage and predictive confidence at critical inflection points in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cell death pathways in genetically modified or chemically treated embryonic models.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing apoptosis from autophagy-related cell death.
- Facilitates functional target validation through quantifiable lysosomal activity readouts.
- Improves predictive confidence in developmental toxicity assessments.
Screening & Assay Development
- Provides a scalable, reproducible assay for detecting PCD in thick tissues and multilayer cultures.
- Delivers quantitative, image-based outputs suitable for high-content screening platforms.
- Enables standardization of cell death detection across diverse sample types.
- Supports reliable evaluation of compound-induced cytotoxicity in differentiating stem cell systems.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro stem cell models with in vivo embryonic outcomes for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement decisions by quantifying developmental cell death in disease-relevant systems.
- Supports biomarker alignment through correlation of lysosomal activity with PCD phenotypes.
- Facilitates mechanistic studies of genetic or environmental perturbations in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
LysoTracker-based PCD detection integrates from early discovery through preclinical validation, bridging in vitro and in vivo model systems for comprehensive mechanistic insight.
- Discovery Biology: Quantifies cell death patterns to clarify pathway involvement and biological risk.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for assay development and compound profiling.
- Analytics: Enables image-based measurement and statistical comparison of PCD across experimental conditions.
- Translational Research: Connects stem cell differentiation models to embryonic phenotypes for biomarker validation.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly applicable, fixable staining protocol for diverse tissue and cell culture systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell death analysis.
- Operational Value: Standardizes PCD detection with a rapid, scalable, and robust workflow.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by de-risking early-stage models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of candidates with validated safety profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in embryology, stem cell culture, and fluorescence imaging.
- Needs access to standard fluorescent or confocal microscopy and image analysis software.
- Demands cross-team standardization of staining, imaging, and quantification protocols.
- Adaptable to various model systems, including embryos and differentiating adult stem cells.
- Interpretation must consider that increased lysosomal activity may reflect multiple PCD pathways.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:48
LysoTracker Staining of Mouse Embryos
4:53
LysoTracker Staining of Differentiating ES Cultures
6:51
Mounting Samples for Imaging
7:44
Viewing LysoTracker-stained Samples and Image Analysis
9:21
LysoTracker Staining in Shh Null Embryos and Cultured Cells
12:10
Conclusion
