Name: 考试流式细胞仪检测胸腺阳性和阴性选择 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 29 s
Description: 学习使用流式细胞术检测小鼠胸腺T细胞发育的方法，通过抗体染色分析淋巴细胞群体频率与数量。该技术可揭示T细胞阳性选择与阴性选择的分子机制，为免疫耐受研究提供重要工具。

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作者谨此感谢 Bing Zhang 提供的技术支持。本工作由加拿大卫生研究院（Canadian Institutes for Health Research，资助号：MOP-86595）资助。T.A.B. 为加拿大卫生研究院新研究员和阿尔伯塔健康基金会（AHFMR）学者。Q.H. 获加拿大卫生研究院加拿大研究生奖学金（博士）和阿尔伯塔创新健康科学基金会（AIHS）全日制学生奖学金资助。S.A.N. 获伊丽莎白二世女王研究生奖学金资助。A.Y.W.S. 获自然科学与工程研究理事会（NSERC）研究生奖学金（博士）资助。

请参见图1，了解实验方案的整体示意图。
1. 解剖
<ol>
 <li>将无菌钢网筛放入60 × 15 mm的培养皿中。每个组织样本需使用一个单位。</li>
 <li>向每个培养皿中加入5 ml Hank's平衡盐溶液（HBSS）。将培养皿置于冰上保存。</li>
 <li>用CO2处死小鼠。</li>
 <li>将小鼠固定在解剖台上，腹面朝上。用70%乙醇喷洒小鼠体表以进行消毒，并确保毛发贴服。</li>
 <li>使用手术剪，从腹部生殖器上方开始，沿腹中线做一纵向切口，向上延伸至下颌。</li>
 <li>从腹中线开始，将切口沿四肢方向向下延伸。将松动的皮肤向后拉开，并用针固定在解剖台上。</li>
 <li>取材胸腺：
 <ol>
 <li>提起胸骨底部末端，进行切开。</li>
 <li>避开肝脏，剪断膈肌以分离胸廓，然后向两侧剪开肋骨。沿两侧向上剪开胸廓时，注意避免损伤肺和心脏。</li>
 <li>用镊子轻轻向后拉开肋骨。胸腺为位于心脏上方的白色双叶状器官。用镊子的平边夹住叶状结构的底部，轻轻取出胸腺并置于网筛上。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>取材脾脏：
 <ol>
 <li>脾脏为红色、冲浪板状的器官，位于小鼠腹腔左侧，肝脏下方。</li>
 <li>切开腹腔，用一对镊子轻轻拉出脾脏，同时用另一对镊子分离周围结缔组织。将脾脏置于另一个独立的网筛上。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
2. 细胞制备
<ol>
 <li>使用3 ml注射器的推杆，将器官在滤网筛上研磨，直至仅剩结缔组织和脂肪。用培养皿中的HBSS冲洗滤网三次。每个组织样本均需使用新的推杆。
 <ol>
 <li>也可采用其他组织匀浆方法替代本方法。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>使用血细胞计数板对细胞进行计数。</li>
 <li>在4 °C条件下，以335 × g离心5分钟，使细胞沉淀。</li>
 <li>将脾细胞重悬于500 μl ACK裂解缓冲液（0.15 M NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM Na2EDTA, pH 7.2）中，室温孵育10分钟。将胸腺细胞以20 × 106 个细胞/ml的浓度重悬于FACS缓冲液（PBS, 1% FCS, 0.02%叠氮化钠）中，并置于冰上备用。</li>
 <li>加入5 ml HBSS以恢复脾细胞的等渗环境。离心使脾细胞沉淀，然后以20 × 106 个细胞/ml的浓度重悬于FACS缓冲液中。若需保持细胞无菌，可使用无菌RPMI + 10% FCS。</li>
</ol>
3. 流式细胞术的细胞染色
本实验方案旨在概述利用野生型（WT）和HYcd4小鼠分析正向选择和负向选择的策略。关于流式细胞术实验设计、数据采集和分析的一般性考虑，我们推荐读者参考Tung et al.11撰写的一篇优秀综述。
<ol>
 <li>将每份流式细胞术样品 4 × 106 个胸腺细胞分装至 96 孔板的各个孔中，同时每份补偿对照加入 1 × 106 个野生型（WT）脾细胞。若使用转基因小鼠，实验中应包含一只野生型小鼠作为对照。</li>
 <li>在冰上用抗 CD16/32 抗体（克隆号 2.4G2）孵育细胞 10 分钟，以阻断 Fc 受体。</li>
 <li>在 4 °C 下以 335 × g 离心 5 分钟。取下盖子，将板倒扣于水槽中轻弹一次，去除孔中液体。每孔用 200 μl FACS 缓冲液重悬细胞，重复洗涤一次。</li>
 <li>按以下列表配制抗体混合液，根据每种抗体在每孔 200 μl FACS 缓冲液中的最佳稀释浓度进行添加。每种抗体的最佳浓度定义为能够使阳性与阴性细胞群分离最明显的最低浓度。若某抗体无明确的阴性细胞群，应包含同型对照抗体。如有需要，每孔总体积可按比例减少（例如减少至每孔 100 μl）。
 <ol>
 <li>野生型胸腺：抗 TCRβ、抗 CD4、抗 CD8、抗 CD69 或抗 CD5、抗 CD24</li>
 <li>HYcd4 胸腺：抗 HY TCR（T3.70）、抗 CD4、抗 CD8、抗 CD69 或抗 CD5、抗 CD24 
为更好地区分胸腺细胞中 CD69lo 与 CD69hi 细胞群，建议使用生物素标记的抗 CD69 一抗，随后用荧光染料偶联的链霉亲和素进行二抗染色。我们对 CD5 染色也采用相同策略。
 </li>
 </ol>
 </li>
 <li>在冰上避光条件下，用 200 μl 抗体混合液与细胞在 FACS 缓冲液中孵育 30 分钟。</li>
 <li>在进行抗体混合液染色的同时，使用单一荧光染料偶联的抗体对每个补偿对照进行染色。理想情况下，补偿染色应使用与抗体混合液中相同的抗体。然而，在检测多个抗原的大规模实验中，对每个单独抗原进行染色可能不可行。因此，建议选择表达水平较高的抗 CD4 或抗 CD8 抗体进行补偿染色，或使用补偿微珠。在冰上避光条件下用 FACS 缓冲液染色 30 分钟。保留一份补偿对照不进行染色。</li>
 <li>用 FACS 缓冲液洗涤细胞两次。</li>
 <li>将细胞重悬于 FACS 缓冲液中，并转移至流式管中。</li>
 <li>在流式细胞仪上获取样品数据。应包含 FSC-A 和 FSC-W 参数，以便区分单细胞与双联体细胞。</li>
</ol>
4. 流式细胞术数据分析——非 TCR 转基因小鼠
我们使用 FlowJo 进行流式细胞术数据分析。有关非 TCR 转基因小鼠的设门策略，请参见图 2A。
<ol>
 <li>使用FSC-A对SSC进行电子门控，圈出“淋巴细胞”群体。</li>
 <li>在“淋巴细胞”群体内，使用FSC-A对FSC-W进行电子门控，圈出FSC-Wlo群体，以排除细胞双联体和聚集体。此为“单细胞”门控。</li>
 <li>基于“单细胞”门控内的事件，绘制CD8对CD4的散点图。按照图2B所示，圈出DN、DP弱表达、DP强表达、CD4+CD8低表达、CD4SP和CD8SP群体。</li>
 <li>在CD4SP和CD8SP门控下，创建TCRβ对CD24的图。使用象限门控工具，按照图2C所示绘制门控。</li>
 <li>从“单细胞”门控创建一个新的图：TCRβ对CD69。按照图2D所示，绘制门控A、B、C、D。</li>
 <li>从“单细胞”门控再创建一个图：TCRβ对CD5。按照图2E所示，绘制门控i、ii、iii、iv。这是另一种分析阳性选择的策略。</li>
 <li>将来自“单细胞”门控下的DN、DP弱表达、DP强表达、CD4中等表达、CD4SP和CD8SP门控，应用于门控i、ii、iii、iv以及A、B、C、D（图2D, E）。</li>
 <li>通过将器官细胞总数乘以各后续门控的频率，计算特定亚群中的细胞数量，直至达到目标群体。例如，TCRβ高表达CD69- CD8SP胸腺细胞的数量可通过胸腺细胞总数 × %TCRβ高表达CD69-（D组分）× %CD8SP计算得出。
 <ol>
 <li>计数时已考虑活细胞与死细胞比例，因此在计算中无需包含“淋巴细胞”门控。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
5. 流式细胞术数据分析——TCR转基因小鼠
请参见图3A中的门控策略，适用于TCR转基因小鼠。
<ol>
 <li>按照前一节中的步骤 4.1 和 4.2 操作。</li>
 <li>在“单细胞”门内，创建一个基于 SSC 的 T3.70 图，并圈选 T3.70+ 细胞群以分析抗原特异性 T 细胞（图 3B）。在某些情况下，可能需要将该细胞群与非抗原特异性（T3.70-）T 细胞群进行比较。</li>
 <li>在 T3.70+ 细胞群内，圈选 DN、DP、CD4SP 和 CD8SP 门（图 3C）。
 <ol>
 <li>对于野生型对照样本，可在“单细胞”门下圈选这些门，或创建一个 T3.70- 门，因为 T3.70+ 细胞数量极少。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>在 CD8SP 门下，创建一个 T3.70 与 CD24 的散点图。使用象限圈门工具将细胞分为四个群体（图 3F）。</li>
 <li>创建叠加直方图，显示野生型小鼠 DP 区室与 HYcd4 小鼠 T3.70+ DP 区室中 CD69 的表达情况（图 4A）。重复此操作以检测 CD5 的表达（图 4B）。</li>
 <li>按照步骤 4.8 的方法，计算各目标亚群中细胞的绝对数量。</li>
</ol>

<ol><li>Liston, A., Lesage, S., Wilson, J., Peltonen, L., Goodnow, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aire+regulates+negative+selection+of+organ-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Aire regulates negative selection of organ-specific T cells.</a> Nat. Immunol. 4, 350-354 (2003).</li>
<li>Liston, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+dosage--limiting+role+of+Aire+in+thymic+expression%2C+clonal+deletion%2C+and+organ-specific+autoimmunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Gene dosage--limiting role of Aire in thymic expression, clonal deletion, and organ-specific autoimmunity.</a> J. Exp. Med. 200, 1015-1026 (2004).</li>
<li>Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+tolerance%3A+learning+self-control+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Central tolerance: learning self-control in the thymus.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 772-782 (2005).</li>
<li>Liston, A., Enders, A., Siggs, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unravelling+the+association+of+partial+T-cell+immunodeficiency+and+immune+dysregulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Unravelling the association of partial T-cell immunodeficiency and immune dysregulation.</a> Nat. Rev. Immunol. 8, 545-558 (2008).</li>
<li>Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+selection+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Positive and negative selection of T cells.</a> Annu. Rev. Immunol. 21, 139-176 (2003).</li>
<li>McCaughtry, T. M., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+tolerance%3A+what+have+we+learned+from+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+immunopathology%22%5BJournal%5D)">Central tolerance: what have we learned from mice.</a> Seminars in immunopathology. 30, 399-409 (2008).</li>
<li>Zhan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Without+peripheral+interference%2C+thymic+deletion+is+mediated+in+a+cohort+of+double-positive+cells+without+classical+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Without peripheral interference, thymic deletion is mediated in a cohort of double-positive cells without classical activation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 1197-1202 (2003).</li>
<li>Brewer, J. A., Kanagawa, O., Sleckman, B. P., Muglia, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymocyte+apoptosis+induced+by+T+cell+activation+is+mediated+by+glucocorticoids+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymocyte apoptosis induced by T cell activation is mediated by glucocorticoids in vivo.</a> J. Immunol. 169, 1837-1843 (2002).</li>
<li>Martin, S., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen-specific+and+nonspecific+deletion+of+immature+cortical+thymocytes+caused+by+antigen+injection%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen-specific and nonspecific deletion of immature cortical thymocytes caused by antigen injection.</a> European journal of immunology. 27, 2726-2736 (1997).</li>
<li>Baldwin, T. A., Sandau, M. M., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+timing+of+TCR+alpha+expression+critically+influences+T+cell+development+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The timing of TCR alpha expression critically influences T cell development and selection.</a> J. Exp. Med. 202, 111-121 (2005).</li>
<li>Tung, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+flow+cytometry%3A+a+practical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Clinics+in+laboratory+medicine%22%5BJournal%5D)">Modern flow cytometry: a practical approach.</a> Clinics in laboratory medicine. 27, 453-468 (2007).</li>
<li>Aliahmad, P., Kaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+all+CD4+T+lineages+requires+nuclear+factor+TOX%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Development of all CD4 T lineages requires nuclear factor TOX.</a> J. Exp. Med. 205, 245-256 (2008).</li>
<li>Kastner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl11b+represses+a+mature+T-cell+gene+expression+program+in+immature+CD4%28%2B%29CD8%28%2B%29+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bcl11b represses a mature T-cell gene expression program in immature CD4(+)CD8(+) thymocytes.</a> Eur. J. Immunol. 40, 2143-2154 (2010).</li>
<li>Albu, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCL11B+is+required+for+positive+selection+and+survival+of+double-positive+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">BCL11B is required for positive selection and survival of double-positive thymocytes.</a> J. Exp. Med. 204, 3003-3015 (2007).</li>
<li>Van De Wiele, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymocytes+between+the+beta-selection+and+positive+selection+checkpoints+are+nonresponsive+to+IL-7+as+assessed+by+STAT-5+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymocytes between the beta-selection and positive selection checkpoints are nonresponsive to IL-7 as assessed by STAT-5 phosphorylation.</a> J. Immunol. 172, 4235-4244 (2004).</li>
<li>Ueno, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7+signals+are+essential+for+cortex-medulla+migration+of+developing+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">CCR7 signals are essential for cortex-medulla migration of developing thymocytes.</a> J. Exp. Med. 200, 493-505 (2004).</li>
<li>Saini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Zap70+expression+during+thymocyte+development+enables+temporal+separation+of+CD4+and+CD8+repertoire+selection+at+different+signaling+thresholds%5BTitle%5D)+AND+%22Science+signaling%22%5BJournal%5D)">Regulation of Zap70 expression during thymocyte development enables temporal separation of CD4 and CD8 repertoire selection at different signaling thresholds.</a> Science signaling. 3, ra23(2010).</li>
<li>Hu, Q., Sader, A., Parkman, J. C., Baldwin, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bim-mediated+apoptosis+is+not+necessary+for+thymic+negative+selection+to+ubiquitous+self-antigens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Bim-mediated apoptosis is not necessary for thymic negative selection to ubiquitous self-antigens.</a> J. Immunol. 183, 7761-7767 (2009).</li>
<li>Kisielow, P., Bluthmann, H., Staerz, U. D., Steinmetz, M., von Boehmer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tolerance+in+T-cell-receptor+transgenic+mice+involves+deletion+of+nonmature+CD4%2B8%2B+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes.</a> Nature. 333, 742-746 (1988).</li>
<li>McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+deletion+of+thymocytes+can+occur+in+the+cortex+with+no+involvement+of+the+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla.</a> J. Exp. Med. 205, 2575-2584 (2008).</li>
<li>Derbinski, J., Schulte, A., Kyewski, B., Klein, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promiscuous+gene+expression+in+medullary+thymic+epithelial+cells+mirrors+the+peripheral+self%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Promiscuous gene expression in medullary thymic epithelial cells mirrors the peripheral self.</a> Nat. Immunol. 2, 1032-1039 (2001).</li>
<li>Anderson, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+of+an+immunological+self+shadow+within+the+thymus+by+the+aire+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein.</a> Science. 298, 1395-1401 (2002).</li>
<li>Kurts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+class+I-restricted+exogenous+presentation+of+self+antigens+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Constitutive class I-restricted exogenous presentation of self antigens in vivo.</a> J. Exp. Med. 184, 923-930 (1996).</li>
<li>Nitta, T., Nitta, S., Lei, Y., Lipp, M., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CCR7-mediated+migration+of+developing+thymocytes+to+the+medulla+is+essential+for+negative+selection+to+tissue-restricted+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CCR7-mediated migration of developing thymocytes to the medulla is essential for negative selection to tissue-restricted antigens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 17129-17133 (2009).</li>
<li>Bouneaud, C., Kourilsky, P., Bousso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+negative+selection+on+the+T+cell+repertoire+reactive+to+a+self-peptide%3A+a+large+fraction+of+T+cell+clones+escapes+clonal+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Impact of negative selection on the T cell repertoire reactive to a self-peptide: a large fraction of T cell clones escapes clonal deletion.</a> Immunity. 13, 829-840 (2000).</li>
<li>Gallegos, A. M., Bevan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+tolerance+to+tissue-specific+antigens+mediated+by+direct+and+indirect+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Central tolerance to tissue-specific antigens mediated by direct and indirect antigen presentation.</a> J. Exp. Med. 200, 1039-1049 (2004).</li>
<li>Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naive+CD4%28%2B%29+T+cell+frequency+varies+for+different+epitopes+and+predicts+repertoire+diversity+and+response+magnitude%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Naive CD4(+) T cell frequency varies for different epitopes and predicts repertoire diversity and response magnitude.</a> Immunity. 27, 203-213 (2007).</li>
<li>Bouillet, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BH3-only+Bcl-2+family+member+Bim+is+required+for+apoptosis+of+autoreactive+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BH3-only Bcl-2 family member Bim is required for apoptosis of autoreactive thymocytes.</a> Nature. 415, 922-926 (2002).</li>
<li>Suen, A. Y., Baldwin, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proapoptotic+protein+Bim+is+differentially+required+during+thymic+clonal+deletion+to+ubiquitous+versus+tissue-restricted+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Proapoptotic protein Bim is differentially required during thymic clonal deletion to ubiquitous versus tissue-restricted antigens.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2012).</li>
<li>Calnan, B. J., Szychowski, S., Chan, F. K., Cado, D., Winoto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+orphan+steroid+receptor+Nur77+in+apoptosis+accompanying+antigen-induced+negative+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">A role for the orphan steroid receptor Nur77 in apoptosis accompanying antigen-induced negative selection.</a> Immunity. 3, 273-282 (1995).</li>
<li>Zhou, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Nur77%2FNurr1+leads+to+inefficient+clonal+deletion+of+self-reactive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Nur77/Nurr1 leads to inefficient clonal deletion of self-reactive T cells.</a> J. Exp. Med. 183, 1879-1892 (1996).</li>
<li>Baldwin, T. A., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+analysis+of+clonal+deletion+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional analysis of clonal deletion in vivo.</a> J. Immunol. 179, 837-844 (2007).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文所述方案可用于研究非 TCR 转基因小鼠和 TCR 转基因小鼠中的阳性与阴性选择。该方案描述了表面抗原的染色方法。若需进一步分析分子机制，通常需要进行细胞内染色。对于大多数细胞内蛋白，我们使用 BD Biosciences 的 Cytofix/Cytoperm 试剂盒；对于转录因子，则使用 BD Biosciences 的 Foxp3 染色试剂盒。我们通常在染色后立即上机获取样本。然而，样本也可在含有 1% 甲醛的 FACS 缓冲液中于 4 °C 避光保存过夜。需注意，某些荧光染料和抗体可能与固定步骤不兼容。
对于阳性选择的分析，我们建议使用生物素标记的抗CD69或抗CD5抗体，以更好地分离阴性、中等表达和高表达的细胞群体（图2）。如代表性结果所述，该设门策略有助于区分阳性选择缺陷与谱系承诺异常，因为这两者可能需要不同的后续分析。除了产生成熟的单阳性（SP）胸腺细胞外，阳性选择还可通过IL-7Rα和CCR7的上调来确认。然而，与单阳性胸腺细胞相比，这些标志物在经历阳性选择后的双阳性（DP）胸腺细胞上表达水平较低15,16。...

<table><tbody><tr><td>HyClone Hank's 平衡盐溶液</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30030.02</td><td></td></tr><tr><td>金属网筛</td><td>Cedarlane</td><td>CX-0080-E-01</td><td></td></tr><tr><td>培养皿（60 × 15 mm）</td><td>Fisher Scientific</td><td>877221</td><td></td></tr><tr><td>注射器（3 ml）</td><td>BD Biosciences</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>锥形离心管（15 ml）</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Zeiss - Primo Star</td><td>415500-00XX-000</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Hausser Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>96 孔板</td><td>Sarstedt</td><td>82.1582.001</td><td></td></tr><tr><td>多通道移液器</td><td>Fisherbrand</td><td>21-377-829</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>PAA</td><td>A15-701</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025802</td><td></td></tr><tr><td>叠氮化钠</td><td>IT Baker Chemical Co.</td><td>V015-05</td><td></td></tr><tr><td>FcR 封闭试剂</td><td></td><td></td><td>克隆号 2.4G2</td></tr><tr><td>抗小鼠 HY TCR 抗体</td><td>eBioscience</td><td>XX-9930-YY*</td><td>克隆号 T3.70</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD4 抗体</td><td>eBioscience</td><td>XX-0042-YY*</td><td>克隆号 RM4-5</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD8&amp;alpha; 抗体</td><td>eBioscience</td><td>XX-0081-YY*</td><td>克隆号 53-6.7</td></tr><tr><td>抗小鼠 CD24 抗体</td><td>eBioscience</td><td>XX-0242-YY*</td><td>克隆号 M1/69</td></tr><tr><td>抗小鼠 TCR&amp;#946; 抗体</td><td>eBioscience</td><td>XX-5961-YY*</td><td>克隆号 H57-597</td></tr><tr><td>生物素标记的抗小鼠 CD69 抗体</td><td>eBioscience</td><td>13-0691-YY*</td><td>克隆号 H1.2F3</td></tr><tr><td>生物素标记的抗小鼠 CD5 抗体</td><td>eBioscience</td><td>13-0051-YY*</td><td>克隆号 53-7.3</td></tr><tr><td>链霉亲和素</td><td>eBioscience</td><td>XX-4217-YY*</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞仪</td><td>BD Biosciences - FACS Canto</td><td>338962</td><td></td></tr><tr><td>FACS 管</td><td>BD Biosciences</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>流式细胞术分析软件</td><td>TreeStar - Flowjo</td><td>FlowJo v7/9</td><td></td></tr><tr><td>HyClone RPMI - 1640 培养基</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content">*XX 根据荧光染料不同而变化，YY 根据瓶装规格不同而变化。&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

通过流式细胞术检测胸腺阳性与阴性选择

Examination of Thymic Positive and Negative Selection by Flow Cytometry

健康的免疫系统需要T细胞对外源性抗原产生应答，同时对自身抗原保持耐受。T细胞受体（TCR）α和β基因座的随机重排，产生出具有广泛抗原特异性的T细胞库，能够识别自身和外源抗原。在胸腺发育过程中对这一T细胞库进行选择，对于生成安全且具有功能的T细胞至关重要。胸腺选择过程中的缺陷可导致自身免疫性疾病和免疫缺陷病的发生1-4。
T细胞前体以不表达CD4或CD8共受体的双阴性（DN）胸腺细胞形式进入胸腺。αβTCR及两种共受体的表达发生在双阳性（DP）阶段。DP胸腺细胞的αβTCR与胸腺细胞所呈递的自身肽-MHC（pMHC）复合物之间的相互作用决定了其命运。高亲和力的相互作用导致阴性选择，从而清除自身反应性胸腺细胞；低亲和力的相互作用则引发阳性选择，促进发育为能够识别由自身MHC呈递的外来抗原的CD4或CD8单阳性（SP）T细胞5。
可通过观察成熟T细胞的生成来在具有多克隆（野生型）TCR库的小鼠中研究阳性选择。然而，由于阴性选择涉及抗原特异性细胞亚群的删除，这些小鼠并非研究阴性选择的理想模型。尽管已有多种模型系统被用于研究阴性选择，但它们在模拟生理过程方面的能力各不相同。6例如， 体外 胸腺细胞的刺激缺乏与选择过程密切相关的胸腺微环境，而外源性抗原的给予可能导致胸腺细胞的非特异性清除7-9目前，研究的最佳工具是 体内 阴性选择是指表达针对内源性自身抗原的转基因T细胞受体（TCR）的小鼠。然而，许多经典的TCR转基因模型在双阴性（DN）阶段即过早表达转基因TCRα链，导致过早发生阴性选择。本实验室已开发出HYcd4 模型中，转基因HY TCRα在双阳性（DP）阶段条件性表达，使得阴性选择可在DP向单阳性（SP）过渡期间发生，如同在野生型小鼠中所见10.
本文介绍了一种基于流式细胞术的实验方案，用于检测HYcd4小鼠模型中的胸腺阳性选择和阴性选择。尽管HYcd4小鼠中的阴性选择具有高度生理相关性，但这些方法也可应用于其他TCR转基因模型。我们还将介绍适用于任何基因修饰小鼠的、针对多克隆T细胞受体库中阳性选择的一般分析策略。

在生理性TCR转基因模型和野生型小鼠中，阳性选择始于DPbright阶段，在接触抗原后进入DPdull阶段。DPdull胸腺细胞随后进入一个过渡性的CD4+CD8lo阶段，之后分化为CD4SP或CD8SP胸腺细胞（图2B）。成熟的SP胸腺细胞的特征是TCR高表达并丢失CD24（图2C）。虽然CD8与CD4的表达谱可以揭示阳性选择中的缺陷，但分析TCRβ与CD69或CD5的表达关系可进一步明确缺陷发生的阶段。CD69和CD5均在TCR刺激后上调表达，较强的TCR相互作用会驱动这些标志物更高水平的表达。
在TCRβ与CD69图中，门控A（TCRβloCD69-）代表选择前的双阳性胸腺细胞群体，门控B（TCRβintCD69+）代表TCR结合后直接产生的过渡群体，门控C（TCRβhiCD69+）代表阳性选...

我们介绍一种基于流式细胞术的方法来检测T细胞发育 体内 使用遗传修饰小鼠，其背景为野生型或T细胞受体转基因型。

健康的免疫系统需要T细胞对外源性抗原产生应答，同时对自身抗原保持耐受。T细胞受体基因的随机重排……

以下实验的总体目标是通过流式细胞术检测小鼠胸腺的发育情况。首先从小鼠的胸腺和脾脏制备单细胞悬液。第二步，使用一组抗体混合物对胸腺细胞和脾细胞进行染色，以鉴定特定的胸腺细胞群体。最终，可通过流式细胞术分析评估各种淋巴细胞群体的频率和数量。该方法有助于回答T细胞发育中的关键问题，例如哪些基因和信号通路对于生成具有功能且对自身细胞耐受的T细胞受体库至关重要。尽管该方法可揭示胸腺中T细胞发育的过程，也可应用于其他免疫细胞发育的研究。通常，初次使用该方法的研究人员在设计用于流式细胞术的抗体混合物时会遇到困难。开始解剖前，将一片无菌钢网放入一个 60 × 15 毫米的培养皿中，然后向培养皿中加入 5 毫升 HBSS，并将培养皿置于冰上，以备胸腺的收集。首先，使用一对镊子提起胸骨的下端尖部，暴露膈肌。接着，避开肝脏，剪开膈肌以分离胸廓，然后沿两侧向上剪开胸廓，注意避免损伤肺和心脏。现在用镊子轻轻向后拉开肋骨。胸腺是位于心脏上方的白色双叶器官。用镊子的扁平边缘夹住叶状结构的底部。然后轻轻将胸腺拉出，并放置在预先准备好的网筛之一上。为获取脾脏，需切开腹膜以暴露腹腔。脾脏呈红色，形状类似冲浪板，位于小鼠腹腔左侧，在肝脏下方。然后使用一对镊子取出脾脏，并用另一对镊子分离结缔组织。将解剖好的脾脏置于独立的网筛上。现在使用一支3毫升注射器的推杆，在网筛上研磨每个器官，直至仅剩结缔组织和脂肪。将细胞和HBSS用移液管转移至15毫升锥形管中。然后用新鲜的HBS缓冲液将每张滤网清洗三次。接着，在335 × g、4°C条件下离心5分钟，使细胞沉淀。在脾脏红细胞正在进行裂解的同时，吸除上清液后，将细胞重悬于500 µL CK裂解缓冲液中，在室温下孵育10分钟。将胸腺细胞用FACS缓冲液重悬至浓度为20 × 10⁶ 个细胞/毫升，置于冰上备用。随后加入5毫升HBSS，使细胞在离心后恢复等渗状态；再次离心后，将去除红细胞的细胞沉淀用FACS缓冲液重悬至20 × 10⁶ 个细胞/毫升。此步骤起始时进行Ali Watting。每份流式细胞术样品取4×10⁶个保留的胸腺细胞，加入至96孔板的各个孔中。接下来，将细胞加入96孔板的孔中，用于补偿对照。然后，在冰上用抗CD16/32抗体孵育10分钟，以阻断各细胞样品中的Fc受体。现在将酶标板离心，然后将板子倒扣在水槽中轻甩一次，弃去孔中液体，再在每孔中加入200 µL封闭缓冲液重悬，重复洗涤一次。接下来，将实验样本与200 µL抗体混合液或用于补偿对照的单一荧光素标记抗体在封闭缓冲液中混合，置于冰上避光孵育。30分钟后，用fax缓冲液洗涤细胞两次，然后将细胞重悬于fax缓冲液中，将样品转移至生理性TCR转基因模型和野生型小鼠的fax管中。阳性选择始于双阳性亮期阶段，随后进入双阳性暗期阶段。在遇到抗原后，双阳性暗期胸腺细胞会先进入一个过渡性的CD4阳性CD8低表达阶段，之后成为CD4阳性细胞。单阳性或CD8单阳性胸腺细胞成熟的单阳性胸腺细胞以其高TCR表达和CD24的丢失为特征。虽然CD8与CD4的表达谱可揭示阳性选择中的缺陷，但检测TCRβ与CD69或CD5的表达可进一步明确缺陷所在的位置。CD69和CD5均在TCR刺激后上调表达，较强的相互作用可驱动这些标志物的更高表达。在野生型小鼠的TCR beta与CD69图中，TCRβ低、CD69阴性的门代表一群尚未经历选择的双阳性胸腺细胞。而TCRβ中等、CD69阳性的门代表T细胞受体（TCR）激活后直接产生的过渡性细胞群，主要由双阳性亮细胞组成，同时包含少量双阳性暗细胞以及CD4阳性、CD8低表达细胞。此处TCRβ高、CD69阳性的门则显示了经历阳性选择后直接产生的细胞群体，包括双阳性暗细胞、CD4阳性、CD8低表达细胞以及CD4单阳性细胞。最后，这种TCRβ高表达、CD69阴性的表型显示出更为成熟的细胞群体，主要由CD4和CD8单阳性细胞组成。TCRβ中等表达且CD69阳性以及TCRβ高表达且CD69阳性细胞群的缺失可能提示阳性选择过程存在缺陷。在TCRβ高表达、CD69阴性群体中，CD4单阳性与CD8单阳性细胞比例的变化可能提示谱系命运决定发生改变。TCRβ高表达CD69阳性与TCRβ高表达CD69阴性群体的减少可能反映了阳性选择后存在的存活问题。通过CD5检测TCRβ是鉴定阳性选择前和阳性选择后群体的另一种策略。前两个群体主要由双阳性亮型胸腺细胞组成。TCR beta低表达、CD5低表达的细胞群代表未经历选择的双阳性胸腺细胞，而TCR beta中等表达、CD5中等表达的细胞群则由启动阳性选择的细胞组成。该细胞群或前述细胞群生成减少提示阳性选择缺陷。然而，TCR beta中等表达、CD5高表达的细胞群代表正处于阳性选择过程中的胸腺细胞，主要由双阳性弱表达细胞和CD4阳性细胞构成。CD8低表达的胸腺细胞。TCRβ高表达且CD5高表达的细胞群主要由经历阳性选择后的单阳性胸腺细胞组成。CD4单阳性与CD8单阳性胸腺细胞的比例发生变化。尽管前体细胞群正常，该细胞群中单阳性细胞的存在可能提示谱系定向发生改变。此外，该细胞群的缺失可能表明阳性选择后胸腺细胞存活减少，因为阴性选择涉及清除小部分抗原特异性细胞群。该过程中的缺陷可通过使用TCR转基因小鼠进行最佳观察，在HY CD4小鼠中，表达转基因H-Y-TCR的胸腺细胞可利用单克隆抗体T3.7进行检测。H-Y-T-C-R 识别在 MHC I 类分子 db 中呈递的雄性特异性 HY 抗原。因此，HY CD4 雄性小鼠会发生 H-Y-T-C-R 阳性胸腺细胞的阴性选择，表现为 T3.70 阳性双阳性胸腺细胞数量减少，以及 T3.7 阳性 CD8 单阳性胸腺细胞数量更显著的下降。相比之下，HY CD4 雌性小鼠则经历阳性选择，生成 T3.7 阳性 CD8 单阳性 T 细胞。尽管双阳性胸腺细胞数量的减少提示发生了阴性选择，但缺乏抗原特异性的单阳性胸腺细胞才是最准确的衡量指标。进一步分析HY CD4雄性小鼠中少量的T3.70阳性CD8单阳性胸腺细胞发现，其中大多数为CD24高表达的未成熟细胞。而在HY CD4雌性小鼠中，大多数T3.70阳性CD8单阳性胸腺细胞已达到成熟状态，表现为CD24低表达，这一结果进一步支持了阴性选择发生在HY CD4雄性小鼠中的结论。TCR转基因模型的一个局限性在于，由于TCR在胸腺细胞发育全过程中的高表达，难以通过鉴定TCR、CD69或CD5的表达来进一步表征阳性选择。HY CD4雌性小鼠中存在大量T3.70阳性双阳性胸腺细胞，这些细胞经历了阳性选择。这表现为与野生型相比，CD69阳性细胞群增加。阴性选择所需的TCR刺激亲和力高于阳性选择，这一点可通过HY CD4雄性小鼠中T3.70阳性双阳性胸腺细胞上CD69的更高表达得以体现，表现为直方图峰值向右偏移。在分析基因改造小鼠的胸腺选择时，CD5的表达也呈现出类似的趋势。通过检测CD69或CD5的表达，可以确定缺陷是源于TCR信号传导，还是TCR刺激的下游效应。一旦掌握该技术，细胞制备和染色可在两个半小时内完成，另需一小时在流式细胞仪上进行数据采集。若操作正确，每只额外的小鼠大约增加30分钟。在尝试此操作时，重要的是要记住轻柔处理胸腺细胞，并确保事先规划好染色策略。遵循此操作步骤。还可以进行其他检测，例如杀伤实验或细胞因子产生实验，以回答更多问题，比如输出的胸腺细胞是否功能正常。观看本视频后，您应能够充分理解如何使用流式细胞术分析胸腺发育位点。

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小鼠胸腺上皮细胞单细胞悬液的制备及细胞内分子染色用于流式细胞术分析

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