考试流式细胞仪检测胸腺阳性和阴性选择
October 8th, 2012
我们提出了一种基于流式细胞仪的方法来研究T细胞发育
以下实验的总体目标是通过流式细胞术检查小鼠的发育情况。这是通过制备小鼠、胸腺和脾脏的单细胞悬液来实现的。作为第二步，用抗体混合物对胸腺细胞和细胞进行染色，以鉴定特定的 thy 群体。
最终，可以通过流式细胞术分析来评估各种淋巴细胞群的频率和数量。这种方法可以帮助回答 T 细胞发育中的关键问题，例如哪些基因和通路对于产生功能性但细胞耐受性强的 T 细胞库很重要。虽然这种方法可以提供对胸腺中 T 细胞发育的见解，但它也可以应用于检查其他免疫细胞的发育。
通常，刚接触这种方法的人在设计用于流式细胞术的抗体混合物时会遇到困难。在开始解剖之前，将无菌钢网筛放入 60 x 15 毫米的培养皿中。然后在培养皿中加入 5 毫升 HBSS，并将培养皿存放在冰上以收获胸腺。
首先，用一对镊子提起胸骨的底部尖端，露出隔膜。接下来，避开肝脏，切开隔膜以分离胸腔，然后在每侧向上切开胸腔。注意避开肺部和心脏。
现在用镊子轻轻地将肋骨向后拉。胸腺是位于心脏上方的白色双叶器官。使用镊子的平坦边缘抓住裂片的底部。
然后轻轻拉出胸腺并将其放在先前准备好的网状筛网上。要收获脾脏，请在腹膜上切开一个切口，露出腹腔。脾脏是一个红色冲浪板状器官，位于小鼠肝脏下方腹腔的左侧。
然后用一对镊子拉出脾脏，用另一对镊子梳理掉结缔组织。然后将解剖的脾脏放在单独的网状筛网上。现在使用 3 毫升注射器的柱塞将每个器官研磨到其网状筛网中，直到只剩下结缔组织和脂肪，将细胞和 HBSS 移液到 15 毫升锥形管中。
然后用新的 HBS S3 冲洗每个网孔 3 次。接下来，在 335 倍 G 和 4 摄氏度下将细胞沉淀 5 分钟。吸出上清液复苏后，在室温下将细胞悬浮在 500 μL CK 裂解缓冲液中 10 分钟，同时将脾红细胞置于复苏中。
在传真缓冲液中以 20 乘以 10 倍的浓度悬浮胸腺细胞至每毫升 6 个细胞，并将它们放在冰上。现在加入 5 毫升 HBSS 以使细胞在再次旋转细胞后恢复等渗性，在传真缓冲液中以 20 乘以 10 至第六个细胞/毫升的速度悬浮无红细胞沉淀。由 Ali Watting 开始此步骤。
将每个流式细胞术样品的 10 至 6 个保留的胸腺细胞的 4 次乘以 96 孔板的每个孔中。接下来，将细胞添加到 96 孔板的孔中以进行补偿对照。然后通过与抗 CD 1632 抗体在冰上孵育 10 分钟来阻断每个细胞样品中的 FC 受体。
现在旋转板，然后通过将板面朝下轻弹到水槽中来驱除孔中的液体，然后将每个孔悬浮在 200 微升传真缓冲液中并重复洗涤。接下来，将实验样品与 200 μL 抗体混合物或单荧光染料偶联抗体一起孵育，用于补偿对照。全部在黑暗中的冰上传真缓冲区中。
30 分钟后，用传真缓冲液洗涤细胞两次，然后在复苏后将细胞悬浮在传真缓冲液中，将样品转移到生理 TCR 转基因模型和野生型小鼠的传真管中。正选择从双正亮阶段开始，然后进入双正暗淡阶段。抗原遇到双阳性钝胸腺细胞后，再进入过渡期 CD 4 阳性 CD 8 低期后再变成 CD 4 期。
单阳性或 CD 8 个单阳性胸腺细胞成熟单阳性胸腺细胞的特征是 TCR 表达高和 CD 24 丢失。虽然 CD 8 x CD 4 的轮廓可以揭示阳性选择的缺陷，但通过 CD 69 或 CD 5 检查 TCR β 可以进一步了解缺陷所在。CD 69 和 CD 5 在 TCR 刺激后均上调，更强的相互作用驱动这些标志物的更高表达。
在野生型小鼠中通过 CD 69 的 TCR β 图中，TCR R β 低 CD 69 阴性步态代表一组预选双阳性胸腺细胞。而这种 TCR β 中间 CD 69 阳性步态代表 TCR 参与后的过渡群体，由双阳性明亮和一些双阳性钝细胞和 CD 4 阳性 CD 8 低细胞组成。这里 TCR R β 高 CD 69 阳性步态说明了正选择后直接出现的细胞群，它由双阳性钝 CD 4 阳性、CD 8 低和 CD 4 单阳性细胞组成。
最后，这种 TCR β 高 CD 69 阴性步态显示更成熟的细胞群，主要由 CD 4 和 CD 8 单阳性细胞组成。TCR R β 中间体 CD 69 阳性和 TCR R β 高 CD 69 阳性群体的缺失可能表明 CD 4 单阳性与 CD 8 比率的阳性选择变化受损。TCR β 高 CD 69 阴性群体中的单个阳性细胞可能表明谱系定型发生变化。
TCR β 高 CD 69 阳性和 TCR β 高 CD 69 阴性群体的丢失可能反映了阳性选择后的生存问题。通过 CD 5 检查 TCR beta 是另一种识别阳性选择前和后阳性选择人群的策略。前两个群体主要由双阳性明亮胸腺细胞组成。
TCR β low CD five 低群体代表预选双阳性胸腺细胞，TCR β 中间 CD 5 中间群体由启动阳性选择的细胞组成。这个或上一个群体的生成受损表明正选择有缺陷。然而，TCR R β 中间体 CD 5 高群体代表处于正选择过程中的胸腺细胞，主要由双阳性钝细胞和 CD 4 阳性组成。
CD 八个低胸腺细胞。TCR beta 高 CD 五高群体主要由阳性后选择组成。单个阳性胸腺细胞的比例变化为 CD 4，单个阳性与 CD 8 的比率变化。
尽管先前的群体正常，但该群体中的单个阳性细胞可能表明谱系定型发生了变化。此外，该群体的缺失可能表明阳性选择后胸腺细胞的存活率降低，因为阴性选择涉及小抗原特异性群体的缺失。在 HY CD 中使用 TCR 转基因小鼠最好地观察到这一过程中的缺陷，可以用单克隆抗体 T 3.7 检测四种表达转基因 H-Y-T-C-R 的小鼠胸腺细胞。
H-Y-T-C-R 识别 MHC 1 类 db 中出现的男性特异性 HY 抗原。因此，HY CD 4 雄性小鼠经历 H-Y-T-C-R 阳性胸腺细胞的负选择，如 T 3 点 70 阳性双阳性胸腺细胞数减少，以及 T 3.7 阳性 CD 8 阳性 1 个阳性胸腺细胞数减少更显着。相比之下，HY CD 4 只雌性小鼠经历阳性选择以产生 T 3.7 阳性 CD 8 个单阳性 T 细胞。
虽然双阳性 thy 数的减少表明负选择，但抗原特异性单阳性胸腺细胞的缺失是最准确的测量方法。进一步检查 HY CD 4 雄性小鼠中少数 T 三点 70 阳性 CD 8 个单阳性胸腺细胞，发现大多数是 CD 24 高未成熟细胞。虽然 HY CD 4 雌性中的大多数 T 三点 70 阳性 CD 八个单阳性胸腺细胞已经成熟并且 CD 24 低，提供了进一步的支持，但阴性选择发生在 HY CD 四雄性小鼠中。
TCR 转基因模型的一个警告是，由于在整个 CYTE 发育过程中 TCR 表达高，很难通过基于 TCR 和 CD 69 或 CD 5 表达来识别群体来进一步表征阳性选择，HY CD 4 雌性小鼠有大量 T 三点 70 阳性双阳性胸腺细胞进行阳性选择。如与野生型相比 CD 69 阳性群体的增加所示，负选择涉及比正选择更高的亲和力 TCR 刺激。在 HY CD 4 雄性小鼠中，CD 69 在 T 3 点 70 阳性双阳性胸腺细胞上的较高表达表明了这一点，导致直方图峰值向右移动。
在分析遗传作小鼠的胸腺选择时，CD 5 表达也观察到类似的趋势。检查 CD 69 或 CD 5 表达可以确定缺陷是与 TCR 信号传导有关 还是 TCR 刺激的下游结果。一旦掌握，该技术可以在两个半小时内完成细胞制备和染色，再加上一个小时在流式细胞仪上收集数据。
如果作正确，每增加一只鼠标将增加大约 30 分钟。在尝试此程序时，重要的是要记住轻柔地处理胸腺细胞，并确保您事先计划好了染色策略。遵循此过程。
可以进行其他检测，例如杀伤检测或细胞因子产生检测，以回答其他问题，例如输出的胸腺细胞是否功能正常。观看此视频后，您应该对如何使用流式细胞术分析胸腺部位发育有很好的了解。
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概述
本研究提出了一种基于流式细胞术的方法，利用基因操作小鼠检查体内T细胞发育。该方法允许评估各种淋巴细胞群体，为T细胞库生成的关键基因和通路提供见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 细胞生物学
- 流式细胞术
背景
- T细胞发育发生在胸腺中，对免疫功能至关重要。
- 了解T细胞发育可以揭示免疫耐受的机制。
- 流式细胞术是分析细胞群体的强大工具。
- 基因操作小鼠为研究T细胞发育中的特定通路提供了模型。
研究目的
- 检查体内T细胞发育。
- 使用流式细胞术识别特定T细胞群体。
- 研究基因和通路在T细胞库生成中的作用。
使用的方法
- 从小鼠胸腺和脾脏制备单细胞悬液。
- 用抗体混合物染色胸腺细胞。
- 流式细胞术分析以评估淋巴细胞群体。
- 应用该方法研究其他免疫细胞的发育。
主要结果
- 在胸腺中识别各种T细胞群体。
- 评估淋巴细胞群体的频率和数量。
- 对T细胞发育重要的基因和通路的见解。
- 该方法在研究其他免疫细胞中的潜在应用。
结论
- 流式细胞术方法对研究T细胞发育有效。
- 这种方法可以增强对免疫耐受机制的理解。
- 研究结果可能对免疫细胞发育研究有更广泛的影响。
常见问题
Executive Industry Relevance
Understanding thymic selection mechanisms is critical for de-risking T cell-targeted therapies by elucidating central tolerance pathways. Flow cytometric analysis of transgenic models enables predictive assessment of TCR specificity and cross-reactivity, supporting early target validation in immunotherapy development. This approach provides mechanistic insights into autoimmune and immunodeficiency disorder pathogenesis, informing portfolio prioritization for biologics targeting immune checkpoints or TCR signaling nodes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of TCR-pMHC affinity thresholds that govern positive versus negative selection outcomes.
- Operational Value: Facilitates functional validation of transgenic TCR models under physiological selection conditions.
- Predictive Value: Supports assessment of target-mediated T cell depletion or survival signals relevant to checkpoint modulator safety profiling.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative readouts of CD4/CD8 SP populations to measure selection efficiency in TCR transgenic systems.
- Operational Value: Establishes standardized antibody panels for reproducible immunophenotyping of DN, DP, and SP thymocyte subsets.
- Scalability Value: Enables high-throughput screening of genetic modifiers affecting thymocyte maturation kinetics.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Links selection defects to autoimmune phenotypes via quantification of autoreactive T cell escape.
- Preclinical Value: Provides biomarker-aligned endpoints (e.g., TCRβhiCD69hi) for evaluating immunomodulatory compound effects on central tolerance.
- Risk Mitigation: Identifies lineage commitment alterations that may predict off-target immune skewing in therapeutic settings.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology workflows by enabling hypothesis-driven assessment of TCR signaling strength and downstream transcriptional programs governing T cell fate decisions.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking of TCR-based therapeutics by mapping selection checkpoints in vivo.
- Screening: Delivers quantitative, multiparametric outputs for comparing selection efficiencies across genetic backgrounds or antigen doses.
- Analytics: Yields statistical comparisons of subset frequencies (e.g., CD4SP:CD8SP ratios) to detect selection biases or survival defects.
- Translational Research: Connects thymic output quality to peripheral T cell functionality through maturation markers like CD24 downregulation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable immunophenotyping platform applicable to diverse TCR transgenic and knockout models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in TCR signaling pathways by correlating antigen affinity with selection outcomes.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility through standardized cell preparation and staining protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by predicting clinical risks of autoreactivity or immunodeficiency from selection defects.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of immunomodulators based on central tolerance biomarkers.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine anatomy, flow cytometry compensation, and immunophenotyping panel design.
- Dependent on access to flow cytometers with sufficient laser and detector configurations for multicolor TCR/coreceptor staining.
- Necessitates standardization across laboratories for gating strategies defining DP bright/dull and transitional subsets.
- Involves adaptation considerations when applying antibody cocktails to non-HY TCR transgenic models with differing marker expression patterns.
- Limited by the physiological relevance of exogenous antigen models compared to endogenous self-antigen systems like HYcd4.
