考试流式细胞仪检测胸腺阳性和阴性选择

以下实验的总体目标是通过流式细胞术检测小鼠胸腺的发育情况。该目标通过制备来自小鼠胸腺和脾脏的单细胞悬液来实现。第二步，使用多种抗体混合物对胸腺细胞和脾细胞进行染色，以鉴定特定的胸腺细胞群体。

最终，可通过流式细胞术分析评估各种淋巴细胞群体的频率和数量。该方法有助于回答T细胞发育中的关键问题，例如哪些基因和信号通路对于生成具有功能且对自身细胞耐受的T细胞受体库至关重要。尽管该方法可揭示胸腺中T细胞发育的过程，也可应用于其他免疫细胞发育的研究。

通常，初次接触该方法的研究人员在设计流式细胞术所用的抗体混合液时会遇到困难。在开始解剖之前，将一个无菌的不锈钢网筛放入一个 60 × 15 毫米的培养皿中。然后向培养皿中加入 5 毫升 HBSS，并将培养皿置于冰上，以备胸腺的采集。

首先，使用一对镊子抬起胸骨的下端尖部，暴露膈肌。接下来，避开肝脏，剪开膈肌以分离胸廓，然后沿两侧向上剪开胸廓，注意避免损伤肺和心脏。

现在用镊子轻轻向后拉开肋骨。胸腺是位于心脏上方的白色双叶器官。用镊子的扁平边缘夹住叶状结构的底部。

然后轻轻将胸腺拉出，并放置在预先准备好的网筛之一上。为获取脾脏，需切开腹膜以暴露腹腔。脾脏呈红色，形状类似冲浪板，位于小鼠腹腔左侧，在肝脏下方。

然后使用一对镊子取出脾脏，并用另一对镊子分离结缔组织。接着将解剖好的脾脏置于独立的网筛上。现在使用一支3毫升注射器的推杆，在网筛上研磨每个器官，直至仅剩结缔组织和脂肪，然后将细胞和HBSS用移液管转移至15毫升锥形管中。

然后用新鲜的HBS缓冲液将每张网筛清洗3次。接着，在335 × g、4°C条件下离心5分钟，使细胞沉淀。在脾脏红细胞正在进行裂解的同时，吸除上清液后，将细胞重悬于500 µL CK裂解缓冲液中，在室温下孵育10分钟。

将胸腺细胞用 FACS 缓冲液重悬至每毫升 20 × 10⁶ 个细胞的浓度，置于冰上备用。现在加入 5 毫升 HBSS，使细胞在离心后恢复等渗状态，再次离心后，将去除红细胞的细胞沉淀用 FACS 缓冲液重悬至每毫升 20 × 10⁶ 个细胞的浓度。此步骤开始于 Ali Watting。

每份流式细胞术样品取4×10⁶个保留的胸腺细胞，加入至96孔板的各个孔中。接下来，将细胞加入96孔板的孔中，用于补偿对照。然后，在冰上用抗CD16/32抗体孵育10分钟，以阻断各细胞样品中的Fc受体。

现在将酶标板离心，然后将板子倒扣在水槽中轻甩一次，弃去孔中液体，再向每孔中加入200 µL封闭缓冲液重悬，重复洗涤一次。接下来，向实验样本中加入200 µL抗体混合液，或向用于补偿对照的样本中加入单一荧光素偶联抗体，均使用封闭缓冲液，在冰上避光孵育。

30分钟后，用fax缓冲液洗涤细胞两次，然后将细胞重悬于fax缓冲液中，将样品转移至生理性TCR转基因模型和野生型小鼠的fax管中。阳性选择始于双阳性亮阶段，随后进入双阳性暗阶段。在遇到抗原后，双阳性暗型胸腺细胞进入一个过渡性的CD4阳性CD8低表达阶段，之后成为CD4阳性细胞。

单阳性或CD8单阳性胸腺细胞成熟的单阳性胸腺细胞的特征是高表达TCR并丢失CD24。虽然通过CD8与CD4表达谱可揭示阳性选择中的缺陷，但检测TCRβ与CD69或CD5的表达可进一步明确缺陷所在的位置。CD69和CD5均在TCR刺激后上调表达，较强的相互作用可驱动这些标志物的表达水平更高。

在野生型小鼠的TCR beta与CD69图中，TCRβ低CD69阴性群代表前选择阶段的双阳性胸腺细胞群体；而TCRβ中等CD69阳性群代表TCR结合后的过渡群体，包含双阳性亮细胞，以及部分双阳性暗细胞和CD4阳性CD8低表达细胞；此处TCRβ高CD69阳性群则显示了经历阳性选择后的细胞群体，由双阳性暗细胞、CD4阳性CD8低表达细胞以及CD4单阳性细胞组成。

最后，该 TCRβ 高表达 CD69 阴性的胸腺细胞群体显示出更为成熟的细胞表型，主要由 CD4 和 CD8 单阳性细胞组成。TCRβ 中等表达 CD69 阳性及 TCRβ 高表达 CD69 阳性群体的缺失可能提示阳性选择过程存在缺陷。在 TCRβ 高表达 CD69 阴性群体中，CD4 单阳性与 CD8 单阳性细胞比例的变化可能提示谱系分化承诺发生改变。

TCR beta 高表达 CD69 阳性及 TCR beta 高表达 CD69 阴性群体的减少可能反映了阳性选择后存在的存活问题。通过 CD5 检测 TCR beta 表达是鉴定阳性选择前与阳性选择后群体的另一种策略。这两个最初的群体主要由双阳性亮型胸腺细胞组成。

TCR beta 低表达 CD5 低表达的细胞群代表选择前的双阳性胸腺细胞，而 TCR beta 中等表达 CD5 中等表达的细胞群则由启动阳性选择的细胞组成。该细胞群或前述细胞群生成减少提示阳性选择缺陷。然而，TCR beta 中等表达 CD5 高表达的细胞群代表正处于阳性选择过程中的胸腺细胞，主要由双阳性微弱表达（double positive dull）和 CD4 阳性细胞构成。

CD8低表达胸腺细胞。TCRβ高表达CD5高表达群体主要由阳性选择后的单阳性胸腺细胞组成。CD4单阳性与CD8单阳性的比例发生变化。

尽管前体细胞群正常，该细胞群中单阳性细胞的存在可能提示谱系定向发生改变。此外，该细胞群的缺失可能表明阳性选择后胸腺细胞存活减少，因为阴性选择涉及清除小部分抗原特异性细胞群。该过程中的缺陷最好通过TCR转基因小鼠进行观察，在HY CD4小鼠中，表达转基因H-Y-TCR的胸腺细胞可由单克隆抗体T3.7检测到。

H-Y-T-C-R 能够识别在 MHC I 类 db 分子中呈递的雄性特异性 HY 抗原。因此，在 HY CD4 雄性小鼠中，H-Y-T-C-R 阳性的胸腺细胞会经历阴性选择，表现为 T3.70 阳性双阳性胸腺细胞数量减少，以及 T3.7 阳性 CD8 单阳性胸腺细胞数量更显著地下降。相比之下，HY CD4 雌性小鼠则经历阳性选择，从而生成 T3.7 阳性 CD8 单阳性 T 细胞。

尽管双阳性胸腺细胞数量的减少提示存在阴性选择，但缺乏抗原特异性的单阳性胸腺细胞才是最准确的衡量指标。进一步检查HY CD4雄性小鼠中少量的T3.70阳性CD8单阳性胸腺细胞发现，其中大多数为CD24高表达的未成熟细胞。而在HY CD4雌性小鼠中，大多数T3.70阳性CD8单阳性胸腺细胞已达到成熟状态，表现为CD24低表达，这一结果进一步支持了阴性选择发生在HY CD4雄性小鼠中的结论。

TCR 转基因模型的一个局限性在于，由于在整个胸腺细胞发育过程中 TCR 表达水平较高，难以通过检测 TCR 与 CD69 或 CD5 的表达来进一步鉴定阳性选择的细胞群体。HY CD4 雌性小鼠中存在大量 T3.70 阳性的双阳性胸腺细胞，这些细胞经历阳性选择，表现为与野生型相比，CD69 阳性细胞群体比例升高。相比之下，阴性选择所需的 TCR 刺激亲和力高于阳性选择，这一点可通过 HY CD4 雄性小鼠中 T3.70 阳性双阳性胸腺细胞表面 CD69 表达水平更高、流式直方图峰向右偏移来证明。

在分析基因改造小鼠的胸腺选择时，CD5 表达也呈现出类似的趋势。通过检测 CD69 或 CD5 的表达，可以确定缺陷是源于 TCR 信号传导本身，还是 TCR 刺激的下游效应。一旦掌握该技术，细胞制备与染色可在两个半小时内完成，另需约一小时在流式细胞仪上进行数据采集。

若操作正确，每只额外的小鼠大约会增加30分钟。在进行此操作时，重要的是要记住轻柔处理胸腺细胞，并确保事先已规划好染色策略。请遵循本操作步骤。

还可以进行其他检测，例如杀伤实验或细胞因子产生实验，以回答更多问题，比如输出的胸腺细胞是否功能正常。观看本视频后，您应能够充分理解如何使用流式细胞术分析胸腺发育位点。