小鼠复发性疱疹性间质性角膜炎，一种研究人类HSK的模型

本实验的总体目标是研究单纯疱疹病毒（HSV）的复发性感染。首先以特定方式感染小鼠，使其在不造成角膜损伤的情况下建立潜伏感染。在潜伏感染完全建立后，下一步通过暴露于中波紫外线（UVB）来重新激活病毒。最后一步是收集泪膜样本，以检测病毒脱落情况，并持续观察小鼠至少五周，以监测疾病进展。

最终，可通过评分疱疹性间质性角膜炎来评估小鼠中发生疾病的严重程度。这种疾病影响着全球许多人，是导致感染性失明的主要病因之一。

我们采用一种小鼠模型来模拟这种特定疾病。虽然还有其他模型也能模拟该疾病，但我们认为这一模型最能准确代表该疾病的特征。今天，我想花几分钟时间，向您介绍将在本视频中出现的各位人员。

这是与我一起工作了过去几个月的Chloe。这位是Nippo，一位在实验室工作的暑期学生。实验开始时，在T150培养瓶中将HSV-1在Vero细胞上培养三到四天，直至细胞融合度达到80%。

此时细胞已变圆，轻轻敲击培养瓶即可使细胞脱落。将细胞悬液转移至无菌的50毫升锥形管中，然后在台式离心机中于4°C、1,510 × g条件下离心15分钟。

接下来，将上清液转移至50毫升无菌橡树岭管中，然后将培养基总量的五毫升分装至每个锥形管中，用于重悬。重悬大颗粒沉淀后，将重悬的沉淀物以每32秒为一个脉冲，进行两次脉冲超声处理，每次持续一分钟。在高速落地式离心机中对上清液进行离心后，可获得少量病毒沉淀。

弃去上清液后，将沉淀与少量病毒颗粒混合，再次超声处理45秒。随后将超声处理后的细胞与病毒溶液在台式离心机中于280 × g、4 °C条件下再次离心5分钟，然后将上清液分装，作为病毒原液储存于-70 °C，用于后续滴度测定。

将病毒储存液上清从10⁰至10⁻⁸进行十倍系列稀释，取两组独立稀释液分别接种于12孔无菌培养板中的Vero细胞。开始感染程序前，先对小鼠实施麻醉。小鼠应持续完全麻醉20至30分钟，以确保在苏醒前病毒已被充分吸收。

然后在解剖显微镜下，使用30号针头划伤右眼角膜。现在通过耳缘打孔对动物进行编号。接下来，给小鼠注射一毫升混合人血清，以保护角膜在初次感染期间免受损伤。

然后使用20微升移液器将10的6次方空斑形成单位接种至划伤的眼部，并向另一只眼滴加5微升HBSS以保持湿润，同时动物处于麻醉状态以确认感染。用1毫升Vero培养基润湿一支无菌棉拭子。初次感染后三天，用该棉拭子擦拭感染眼，随后将拭子上的100微升培养液转移至培养于48孔板中的Vero细胞，这些细胞需在初次感染至少五周后使用。

如上所述，拭取麻醉小鼠的感染眼睛。在48孔板盖上标记拭取日期为第0天，以控制自发性闭眼的影响。然后将小鼠置于可发射峰值波长为302纳米UVB光的透射式紫外灯中，使仅单侧眼睛暴露于UVB光下，并给予每平方厘米250毫焦耳的UVB照射剂量。

然后从第1天到第7天每天对眼睛进行拭子取样。对于经UVB照射后含有传染性病毒的拭子样本，使用12孔板通过标准蚀斑实验定量病毒量，以评估小鼠的临床眼部疾病。将小鼠置于双目解剖显微镜下。

角膜混浊程度按0到4级进行评分，其中0级表示基质清晰透明，1级表示基质轻度混浊。2级表示中度混浊，虹膜结构仍可辨认；3级表示重度混浊，除瞳孔边缘外，虹膜细节消失；4级表示完全混浊，无法观察到眼后部结构。

新生血管化通过将角膜分为四个相等的象限，并评估每个象限内血管化的程度，按1至8级进行评分。在本第一幅图中，潜伏感染的小鼠经UVB照射诱导病毒再激活，随后对小鼠角膜混浊情况进行为期35天的监测。这些数据表明，雄性C57BL/6小鼠的角膜混浊程度显著低于雌性C57BL/6小鼠，因为在第14至35天期间，雌性C57BL/6小鼠中病毒诱导的疾病显著更严重。

同样，在相同实验条件下评估角膜新生血管形成时，雄性小鼠角膜中的新生血管生长显著少于雌性小鼠；并且在第14至28天期间，雌性C57黑六小鼠的病毒诱导疾病程度再次显著更重。在进行该操作时，请务必对小鼠实施充分麻醉，使其处于睡眠状态20至30分钟。观看本视频后，希望您已了解如何利用小鼠复发性基质性角膜炎模型来研究这种人类疾病。