小鼠模型肠组织工程
2012年12月1日
本文及随附视频我们的协议，用于生成在小鼠小肠组织工程，使用类器官单位支架的方法。
该视频将演示我们在支架上使用类器官单元在小鼠中生成组织工程小肠的技术。在该实验中，根据机构动物护理和使用委员会和洛杉矶儿童医院 Savon 研究所动物护理设施指南对动物进行治疗。第一步是采购小鼠全肠。
人道安乐死的小鼠和器械用 70% 乙醇水溶液制备，并做一个中线切口以进入腹膜腔。小肠被挖出内脏，并在 Trites 韧带的远端分开。然后将其从肠系膜及其血管中尖锐而钝地解剖。
最后，回肠在回盲瓣近端横切 5 毫米。收获的小肠显示有鳞片。在这里，我们继续在含有 1 X 抗生素抗真菌溶液的 hank 缓冲盐水中沿抗肠系膜边界纵向打开肠道。
然后清除培养皿中的肠道粪便，然后用 HBSS 和试管重复洗涤 3 次。肠道组织沉到管的底部，漂浮的物质是间充质碎片，可以丢弃。用移液管小心地除去洗涤液。
然后用剪刀将肠子切成小于一毫米见方的块。用自动移液器收集切碎的材料。切碎的洗涤材料现在可以进行消化了。
消化液含有 DASE 0.125 毫克/毫升和胶原酶 800 单位/毫升的 HBSS 和抗生素抗真菌药。请注意，与含抗生素抗真菌剂的 HBSS 相比，消化液呈褐色。它是新鲜制备的，并在碎料中加入 10 毫升。
这是在 37 摄氏度下在旋转器上孵育 20 分钟的。如图所示，用移液管迭代进一步破坏组织。重复 20 到 50 次，直到获得均匀的外观。
10 mL 移液器吸头的尺寸经过优化。为此，用 3 毫升含 10% 胎牛血清的 4 度 DMEM 终止反应。将材料离心 10 分钟。
在 500 RPM 时，弃去上清液，将沉淀重悬于 10 毫升含 10% 胎牛血清的 4 度 DMEM 洗涤液中。然后以 800 RPM 离心 5 分钟，以回收除单细胞外的所有组织，这些细胞保留在 S 上清液中并被丢弃。颗粒包含类器官单元，较轻的材料位于顶部，由镊子和腰部材料表示。
在此层以下，用移液管除去含有血清的 DMEM。注意不要将沉淀悬浮在移液器中。使用一次性塑料移液器可以更安全地去除最后几滴。
这里显示的是实验中使用的聚乙醇酸或 PGA 聚合物支架。用无菌剪刀修剪一次性 1000 μL 移液器吸头的远端 2 毫米。我们将类器官单元加载到四个壁培养板中的聚合物中，以最大限度地减少材料从聚合物中扩散。
类器官单元用移液管首先加载到支架上，首先进入管腔，然后在外表面上。使用第二个镊子来确保对管腔进行足够的涂层处理，以免破坏聚合物的圆柱形。在转基因供体的情况下使用的宿主小鼠是免疫功能低下的非肥胖糖尿病患者。
严重联合免疫缺陷型 γ 链缺陷型 或 nod 滑型 γ 动物。否则，可以植入同源宿主进行植入。全身麻醉后，将腹部剃光、准备和覆盖。
做一个 0.5 厘米的中线切口。识别并小心地去除大网膜。负载的聚合物包裹在网膜中，并用 5 oh Monocryl 缝合线固定。
网膜不撕裂至关重要，否则细胞可能会泄漏到腹膜中。加载的聚合物 固定网膜被替换在腹部，腹部分层闭合。以中断方式使用四 oh Vicryl 缝合线闭合。
首先是肌肉层，然后是皮肤进行术后镇痛，每公斤 2 毫克。在植入后 4 周，将无菌水中的酮洛芬作为皮下轮注射到切口附近，对宿主动物进行人道安乐死并重新打开原始切口。组织工程结构被确定为球体，可能粘附在胃和腹腔内脏器上。
粘附被急剧去除，并回收组织工程肠道的类固醇。这里显示的是收获的类固醇与起始聚合物的直接比较。在这张图片中，工程化肠的管腔被急剧打开，露出其内部。
正如我们在其他出版物中所证明的那样，组织可以固定用于组织学分析或新鲜用于各种分子生物学分析。此处显示的是典型的成功组织工程小肠构建体的低倍血红素和伊红染色显微照片。左箭头表示内衬肠粘膜的管腔，右箭头表示宿主胰腺。
那已经坚持了 The construct.
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概述
本文和随附的视频介绍了一种在小鼠中使用支架上的类器官单元来生成组织工程化肠的协议。该视频展示了该技术并概述了该程序所需的必要步骤。
关键研究组成部分
科学领域
- 组织工程
- 器官再生
- 小鼠模型
背景
- 开发功能性肠组织的重要性。
- 在再生医学和疾病建模中的应用。
- 先前的方法及其局限性。
- 类器官技术的进展。
研究目的
- 建立一种生成组织工程化小肠的可靠方法。
- 增强对肠道发育和功能的理解。
- 为未来的胃肠道疾病研究提供平台。
使用的方法
- 获取整个小鼠肠。
- 用70%乙醇准备仪器。
- 中线切口以进入腹腔。
- 从系膜中取出小肠并进行解剖。
主要结果
- 成功分离出用于组织工程的小肠。
- 展示了支架上的类器官单元方法。
- 在研究和治疗中进一步应用的潜力。
- 遵守动物使用的伦理指南。
结论
- 该协议为生成工程化肠组织提供了基础。
- 未来的研究可以在各种应用中建立在此方法之上。
- 为再生医学领域做出贡献。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables preclinical evaluation of regenerative therapies for short bowel syndrome using a murine model, supporting target validation and mechanistic de-risking in gastrointestinal disease programs. The use of GMP-compliant reagents and immunocompromised hosts facilitates translational continuity toward human applications. It provides a scalable platform for assessing tissue-engineered constructs prior to IND-enabling studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by enabling functional assessment of engineered intestinal tissue in vivo.
- Operational Value: Supports biological de-risking through preservation of mucosal-mesenchymal interactions critical for stem cell niche maintenance.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, reproducible tissue constructs for quantitative evaluation of regenerative potential.
- Operational Value: Enables assay readiness via organoid unit isolation and scaffold loading protocols compatible with high-content analysis.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system for studying short bowel syndrome pathophysiology and repair mechanisms.
- Operational Value: Utilizes immunocompromised mouse strains to support human tissue xenografting and cross-species validation.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery biology through organoid derivation, advances to preclinical validation via implantation in immunocompromised hosts, and supports analytics through histologic and molecular readouts.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of intestinal regeneration pathways using transgenic tools available in murine models.
- Screening: Delivers standardized tissue constructs with quantifiable outputs for evaluating pro-regenerative compounds or genetic modifications.
- Analytics: Supports histological, molecular, and functional assessments that inform go/no-go decisions in therapeutic development.
- Translational Research: Bridges discovery to preclinical continuity by permitting human tissue testing in mouse xenograft models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for iterative design-test cycles in regenerative medicine programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence by modeling human intestinal structure and function in a physiologically relevant system.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized organoid isolation, scaffold seeding, and implantation techniques.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by enabling early evaluation of regenerative therapeutics in a validated disease model.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of intestinal regeneration candidates based on functional engraftment and tissue maturation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine surgery, organoid culture, and biomaterial handling.
- Dependent on sterile tissue culture facilities, centrifugation equipment, and microsurgical instruments.
- Necessitates cross-team standardization between biology, surgery, and histology groups for consistent outcomes.
- Involves adaptation considerations when scaling from murine to human tissue sources or alternative scaffold materials.
- Limited by the need for postoperative monitoring and euthanasia at defined endpoints for tissue harvest, as described in the protocol.
