时间推移荧光成像拟南芥根系生长的根环境的快速操作使用RootChip

本文提供中的RootChip的拟南芥幼苗栽培的协议，一个微成像平台，结合微观根监测和基于FRET的细胞代谢水平的测量与自动化控制生长条件。

为了提供最大的产量，需要为植物提供一套养分，养分缺乏、寒冷或极热等胁迫、干旱或病原体每年都会造成作物产量的巨大损失。许多这些问题的根源往往在地下。根是植物的物理锚点，但它也是负责水分吸收和矿物质营养物质（如氮、硫酸磷和许多微量元素）吸收的器官。

如果我们想开发可持续的方法来生产高作物产量，我们需要更好地了解根系是如何发育的，它如何吸收如此广泛的营养物质，以及它如何与共生和病原生物相互作用。要做到这一点，我们需要能够在微观层面上探索根源，原因显而易见。研究根的生物学一直比研究植物的地上部分更具挑战性。

由于根通常隐藏在地下，因此不容易进行显微镜研究。从土壤中去除会对根系造成严重损害，因此不是研究它们行为的好方法。使根更容易接近的一种解决方案是在 jeed 上种植它们，或者在此示例中以水培介质显示。

在果冻介质或水培介质中的生长计划已非常成功地用于许多根系研究，但是使用这些方法，仍然很难在微观细节中长时间研究根系，以尽可能接近生长的根系并避免因准备成像而产生的任何物理压力。 我们构建了一个平台，使我们能够生长和成像根，同时允许我们以非常高的精度和速度控制和修改根的微环境。我们称这个平台为 root chip。根芯片是由 PDMS（一种基于硅的有机聚合物）制成的微流体装置。

该芯片具有观察室，用于兔子 opsis 幼苗根的生长和成像。种子首先在由塑料移液器吸头制成的塑料锥体中发芽，我们用固体培养基填充塑料锥体。然后，根尖穿过介质生长并到达腔室，在那里它经历液体介质的连续流动，保持腔室中的条件。

斯坦福大学 Steve Quake 实验室开发的常数微型机械阀在这里以红色控件显示。由于芯片安装在通常用于显微镜的透明盖玻片上，因此观察室中的所有过程都可以在倒置显微镜上监测。在显微镜下可以看到引导流体流动的分叉通道结构。

根芯片由两层组成，一个控制层包含流动层中的阀门，该流动层包含生长培养基测试溶液流向观察室的通道。这些腔室的体积约为 400 纳升。这意味着只需要非常少量的溶液，并且可以非常迅速地改变条件。

该方案描述了如何制备八株或拟南芥幼苗的活根，以便在根芯片上进行平行显微镜成像，并观察长达三天，首先用含有 1% 琼脂的生长培养基填充 10 毫米培养皿，而培养基仍为液体。使用多通道移液器，将 10 微升移液器吸头中加入来自培养皿的 5 微升培养基。将装满的吸头存放在移液器吸头盒中，直到培养基成为固体。

然后切成 4 毫米长的塑料球果，直立放入含有固体生长培养基的培养皿中。表面灭菌后，将单个种子放置在填充培养基的球果顶部。然后用微孔胶带密封培养皿，并将板以 4 度储存以同步发芽。

三天后，将板转移到生长柜中开始发芽。在这个实验中，我们的生长条件是 23 度。在发芽后 5 到 7 天之间的 16 小时高光、8 小时黑暗周期中，幼苗应准备好转移到根芯片幼苗健康的根长，如果适用，应在解剖显微镜下检查荧光标记物的表达。

一旦幼苗的根尖到达塑料锥体的底部出口，就会标记出单个幼苗以转移到芯片上。应选择 10 株左右的植物幼苗，以防在转移过程中损坏，以对根片进行消毒。对于长期实验，将装置包裹在组织中，置于玻璃培养皿和高压灭菌器中。

这个芯片之前刚刚被高压灭菌过。冷却芯片后的实验与液体生长培养基叠加。切屑应完全覆盖，但液位不应高于切屑表面 3 毫米。

使用 20 微升移液器将培养基拉过 Root 入口和腔室出口。这填满了观察室。选择培养基后，塑料锥体现在插入根芯片。

蛋筒应紧贴入口。由于根芯片安装在一层薄薄的光学玻璃上，因此必须注意不要对芯片施加太大的压力。在此步骤中，现在准备在液体培养基中孵育芯片过夜，以防止芯片漂浮。

将两张载玻片（其中一张切成两半）放在芯片上。添加磁力搅拌棒并关闭培养皿。现在，组件转移到磁力搅拌中，磁力搅拌将轻轻搅动培养基，以促进根系向出口生长。

根芯片的。入口以一定角度冲孔，以进一步支持沿所需方向生长。提起与出口相对的芯片一侧，稍微倾斜组件。

芯片用环形灯点亮 连接到定时开关，以保持明暗节奏。过夜孵育后，在可密封的可加压小瓶中制备液体生长培养基。以下步骤应快速且不间断地执行，以防止幼苗干燥。

现在将芯片从液体介质中取出并倒置放入芯片载体的底部孔中，该孔也是倒置的。芯片的方向必须使包含控制层入口的一侧面向压力管线的一侧。载体侧壁上有两个大连接器。

用薄纸轻轻吸干芯片底部的盖玻片，然后贴在载体上。然后用胶带将整个组件倒置。使用注射器将管路接头注满水，并将每个管路接头插入相应的入口。

在芯片上。将管路插入介质和溶液中。然后，通过用空气注射器对溶液胆汁施加压力，将样品瓶和空气从管线中去除，载体上覆盖有透明塑料。

为了保持组件中的高湿度，将载体放置在显微镜载物台上。它应该完全适合舞台的 Notches。切屑阀以及通过切屑的介质流量由气压控制。

两条带有调节器的管线从主压力管路分叉出来。一个用于控制流体流动，另一个连接到电磁空气阀。这些阀门通过计算机通过 USB 阀门控制器进行作，并负责驱动芯片上的阀门。

在连接芯片之前，两个压力调节器都应关闭。管路、连接器和溶液样品瓶现在连接到相应的压力管路上。将几毫升水添加到载体的水箱中。

此步骤可能需要在较长的实验过程中重复。为了保持高湿度，请保持体积负载，以尽量减少可能溅到显微镜上的液体量。将环形灯移动到芯片上方的位置，以保持明暗循环，直到实验开始。

芯片上的阀门通过施加压力来关闭，在这种情况下，通过打开电磁空气阀。实验室视图界面允许通过单击阀编号下方的按钮来控制阀。亮绿色表示施加压力并关闭芯片阀。

该方案说明了阀门系统的组织，而 4 至 8 号阀充当单阀，0 至 3 号气门作用。在与该系统成组中，可以通过激活阀门组合来解决单个腔室的问题，例如，将流体流从顶部专门引导到第三个腔室，必须关闭 0 号、3 号和 4 号阀。此外，阀门 6、7 和 8 控制用于冲洗入口 A、B 和 C 的溶液现在激活所有三个溶液入口阀以关闭它们。

控制器接口具有反馈回路，可以监控系统的状态。此功能可以通过单击回读按钮来激活。控制层的压力调节器首先打开并设置为 15 PSI。

然后，流层的调节器打开并设置为 5 PSI。打开所选生长培养基的入口阀，用培养基冲洗腔室，应在显微镜下检查流路。在大多数情况下，空气被困在通道中，必须排出。

此外，控制空气的通道中仍然包含必须排出的空气，并由管道接头中的水排出。这个过程称为死胡同填充。这两项任务都是通过多次冲洗 8 个腔室中的每一个来实现的，直到所有空气都从通道中被迫进入 PDMS。

该系统可以编程以自动化实验。此类例程也可用于对芯片进行脱气。根芯片的主要目的是将成像平台和大量系统结合在单个设备中。

为了证明对根微环境的纵，我们用染料冲洗腔室并测量腔室内的液体交换。在推荐的 5 PSI 压力下，我们以大约 1.5 μL/min 的计算流速在 10 秒内测量了一次完全交换。我们还观察到幼苗的根系生长，在这种情况下，它们在黑暗中生长，并提供 10 毫摩尔葡萄糖作为外部能源。

根据生长条件，如光照和培养基的成分，植物可以在根片中观察长达三天。该系统已用于监测表达基因编码纳米传感器的根中的细胞内葡萄糖和半乳糖水平。这些基于第一或共振能量转移或 fret 的传感器是在 Fromer 实验室开发的。

在本实验中，用葡萄糖或半乳糖溶液的方脉冲灌注芯片中的根。监测细胞内糖的水平，如图所示，表示为受体氟四黄水晶的强度与左侧供体 ECFP 强度的比率。我们在根尖的中间或比率度量图像中观察传感器黄水晶的数量，在右侧，我们追踪糖的量作为对绿色葡萄糖和红色半乳糖的三个重复方形脉冲的响应。

比率的上升表明糖的积累。与传统生长方法相比，根芯片的主要优点是显微镜检查的微创准备，能够可逆地反复改变根环境，以及在几天内连续观察发育能力和生理健康组织的能力。另一个非常重要的优势是，随着时间的推移，只需要最少量的液体即可为根部提供所有必要的营养。

这使得 root chipp 非常经济高效，尤其是在使用昂贵的试剂时。我们继续优化根芯片并扩展其可用性，因为我们相信，通过使这个重要的器官更容易进行治疗和观察，像根芯片这样的微流体工具可能会开辟植物研究的新维度。有关如何构建根芯片系统的更多信息，请访问我们的网站。

芯片可以从 Stanford Foundry 订购。