Name: 时间推移荧光成像拟南芥根系生长的根环境的快速操作使用RootChip (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-07T11:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: 学习使用RootChip微流控平台培养拟南芥幼苗并进行根系成像的方法。该技术可在精确控制生长条件的同时，实现长达三天的连续显微观察，为植物根系发育研究提供稳定可靠的实验方案。

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感谢Philipp Denninger在视频制备方面的帮助，以及Bhavna Chaudhuri提供表达FRET传感器的植物品系。本工作获得了美国国家科学基金会（MCB 1021677）、美国能源部（DE-FG02-04ER15542）向W.B.F.提供的资助，以及美国国立卫生研究院和霍华德·休斯医学研究所向S.R.Q.提供的资助。G.G.获得了欧洲分子生物学组织（EMBO）长期博士后奖学金的支持。M.M.得到了亚历山大·冯·洪堡基金会的支持。

注意：所有准备步骤均需在无菌条件下进行。
1. 种子萌发用塑料锥形管的制备
<ol>
 <li> 在培养皿中加入含有1%琼脂的生长培养基，使培养基厚度达到5 mm，培养皿直径为10 cm。我们使用半强度改良Hoagland培养基4，但培养基的组成应根据具体的实验需求进行选择。 </li>
 <li> 在培养基仍处于液态时，使用多通道移液器从培养皿中吸取5 μl培养基，注入10 μl移液器吸头内。 </li>
 <li> 将装有培养基的吸头存放于吸头盒中，待培养基凝固后，切割成4 mm长的塑料锥形管，并将其垂直放置于含有固体生长培养基的培养皿中。 </li>
</ol>
2. 种子萌发与幼苗生长
<ol>
 <li> 将种子在5% NaOCl中表面灭菌5分钟，用无菌水清洗三次，然后将单粒种子放置于每个装有培养基的锥形管顶部。 </li>
 <li> 用Micropore胶带（3M）密封培养皿，并在4 °C下保存以同步萌发。 </li>
 <li> 三天后，将培养皿转移至生长培养箱以启动萌发。我们的生长条件为23 °C，光照周期为16小时强光/8小时黑暗（光照强度：100 μE m-2 s-1）。 </li>
 <li> 萌发后5至7天，幼苗应已准备好转移至RootChip。此时，根尖应接近塑料锥形管底部的出口。在解剖显微镜下检查幼苗健康状况、根长以及（如适用）荧光标记的表达情况。 </li>
 <li> 标记待转移至芯片的单个幼苗。建议选择约十株幼苗，以防转移过程中有幼苗受损。 </li>
</ol>

3. 将幼苗转移至RootChip上
<ol>
 <li> 为对 RootChip 进行长期实验的灭菌处理，需先用纸巾包裹该装置，放入玻璃培养皿中，然后进行高压灭菌。 </li>
 <li> 待 RootChip 冷却后，用液体培养基覆盖。RootChip 应完全浸没在培养基中，但液面高度不得超过 RootChip 表面以上 3 mm。 </li>
 <li> 使用 20 μl 移液器，通过根部入口和观察室出口吸取培养基，以使观察室充满培养基。 </li>
 <li> 将步骤 2.5 中选定的塑料锥形塞插入 RootChip 的入口中。锥形塞应紧密地插入入口。由于 RootChip 安装在一层薄的光学玻璃上，因此请勿对芯片施加过大压力。 </li>
 <li> 将 RootChip 装置于液体培养基中过夜培养。为防止漂浮，可在芯片上放置两片载玻片，加入磁力搅拌子后盖上培养皿盖。 </li>
 <li> 将整个装置转移至磁力搅拌器上，轻轻搅动培养基。 </li>
 <li> RootChip 的入口以 30° 角与通道相交，该角度相对于装置法线方向有利于根向通道内生长（图 1A）。为进一步促进根朝预期方向生长，可在培养皿底部出口侧的对侧下方垫一片载玻片，使装置略微倾斜。 </li>
 <li> 为维持光照/黑暗周期，使用连接定时器的环形灯对幼苗进行照射（光照强度：100 μE m-2 s-1）。 </li>
</ol>
4. 将根芯片连接至载具
<ol>
 <li> 次日，用液体培养基填充一个可密封、可加压的小瓶（图 1B）。</li>
 <li> 将芯片支架倒置并放置在稳定表面上。将RootChip从液体培养基中取出，使其PDMS面朝下插入芯片支架底部的开口中。调整芯片方向，使含有控制层入口的一侧朝向支架侧壁上压力管路连接管所在的一侧。</li>
 <li> 用纸巾轻轻吸干芯片底部盖玻片上的液体。用胶带将RootChip固定在支架上，并将整个组件恢复至正立位置。</li>
 <li> 管路连接管由切割成5 cm长的柔性塑料微孔管（TYGON，内径0.20" × 外径0.060"）与不锈钢微孔管（New England Small Tube，外径0.025" × 内径0.013" × 长0.75"）连接而成。使用注射器将水注入管路连接管中，并将每根连接管插入芯片上对应的控制层入口。这些水将随后填充控制层通道，并用于将压力传递至微机械阀门。</li>
 <li> 将管路的另一端插入培养液/溶液瓶中。使用空气注射器对溶液瓶加压，溶液瓶内增高的气压将推动液体进入管路。</li>
</ol>
5. 在显微镜上安装 RootChip
<ol>
 <li> 将载具放置到显微镜载物台上。为减少实验过程中因室内振动导致组件移位的可能性，载具应精确嵌入载物台插件的凹槽中。</li>
 <li> 芯片阀门及培养基在芯片内的流动由气压控制。从一条主气压管路分出两条带调压阀的支路——其中一条用于调节培养基在通道中的流动，另一条连接电磁气动阀，用于驱动控制层中的顶起式阀门。电磁阀通过计算机连接USB阀门控制器（由Rafael Gómez-Sjöberg，劳伦斯伯克利国家实验室开发）进行操作。在连接芯片前，请关闭两个压力调节阀。</li>
 <li> 向载具的储液槽中加入几毫升水，以维持组件内部的高湿度环境。在较长时间的实验过程中，应重复此步骤，防止植物样本干燥。加水量应保持较低，以尽量减少可能溢出到显微镜上的液体量。对于长期实验，可通过微孔管将芯片出口与载具的储液槽连接，从而将芯片出口流出的液体导流至储液槽中（参见步骤4.4）。或者，也可通过移液方式收集积聚在芯片表面的流出液。</li>
 <li> 使用透明塑料文件保护套（C-Line）裁剪成方形片材。用双面胶将透明塑料片固定在载具上，以维持组件内的高湿度环境。</li>
 <li> 将环形光源置于芯片上方，并维持光照/黑暗循环。在使用荧光标记的任何实验开始前，应关闭环形光源，因为直接照明会干扰图像采集。</li>
</ol>
6. 使用 LabView 界面操作 RootChip
LabView 软件平台的 RootChip 控制器接口可从我们的网站下载：<a href="http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip" target="_blank">http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip</a>。
<ol>
 <li> 通过向控制层施加压力来关闭芯片上的阀门，在本例中是通过打开电磁空气阀实现的。控制器界面允许通过点击阀门编号下方的按钮来驱动阀门。亮绿色表示已施加压力并关闭芯片阀门（图2B）。在打开压力调节器之前，先在控制器界面中激活所有三个溶液入口阀门。
 注意：控制器界面具有反馈回路功能，可用于监测系统状态。该功能可通过点击控制器界面上的“Readback”按钮来启用。</li>
 <li> 打开控制层的压力调节器，并初始设定为 15 psi，然后打开流体层的压力调节器，并初始设定为 5 psi。根据所需的流速，后续可对压力进行调整。</li>
 <li> 打开所选培养基的入口阀，以用培养基冲洗各个腔室。</li>
 <li> 在显微镜下检查流动路径。通常情况下，流道中会困有气泡，必须将其清除。此外，控制层的通道中仍含有空气，需通过管路连接件中的水将其排出并取代（盲端填充）。上述两项操作均可通过反复冲洗全部八个腔室数次（5 psi），直至所有空气被驱出通道并进入PDMS材料中（“脱气”）来完成。
 注意：控制器界面可编程以实现实验自动化。此类程序也可用于芯片的脱气处理。</li>
</ol>
7. 代表性结果
RootChip 的主要目的是将成像平台与灌流系统高度集成于单一装置中。为展示对根部微环境的操控能力，我们用深色食用色素（以水培培养基稀释 1:4）冲洗腔室，并测量腔室内液体的交换情况。在推荐的 5 psi 压力下，测得腔室内液体在约 1.5 μl/min 的计算流速下，10 秒内即可完成完全交换（图 3）。
我们还观察了幼苗的根系生长，本实验中幼苗在黑暗条件下培养，并提供10 mM葡萄糖作为外源能量来源（图4）。根据光照条件和培养基成分等生长条件的不同，可在RootChip中持续观察植物长达三天。
RootChip 已被用于监测表达基于荧光共振能量转移（FRET）的基因编码纳米传感器的根中葡萄糖和半乳糖的胞内水平5-7。芯片中的根部接受葡萄糖或半乳糖溶液的方波脉冲灌流（图5）。胞内糖水平的监测结果以受体荧光蛋白Citrine与供体ECFP荧光强度的比值表示。比值上升表明糖的积累。
<img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig1.jpg" alt="用于植物根系显微观察的RootChip装置示意图，显示流体流向和观察室。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
 图1. RootChip工作原理。
<ol class="ualpha">
 <li> RootChip 包含八个用于根系生长和成像的观察室。种子首先在塑料锥形管中萌发——这些锥形管由塑料移液枪头制成，并填充固体培养基。根尖穿过培养基，进入观察室，在此处连续流动的液体培养基可保持室内环境恒定。微机械阀门（红色）控制液体流动。芯片安装在光学盖玻片上。 
 示意图未按比例绘制。（经 Grossmann et al., 2011 Plant Cell 许可改编。）</li>
 <li> 带隔膜（红色）的可加压溶液瓶示意图。</li>
 </ol>
<img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig2.jpg" alt="微流控装置；通道网络示意图；用于DNA分析与分离的PCR系统。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
 图2. 根芯片的连接与安装。
<ol class="ualpha">
 <li>倒置显微镜上安装有完全连接的RootChip及其载体的顶视图。</li>
 <li> 阀门系统及控制器界面示意图。图中展示了一个将流体引导至单个腔室的阀门设置示例。阀门4至8作为独立阀门工作，而阀门0至3则以组的形式工作。通过该系统，可通过激活一组阀门组合来单独寻址某个腔室。</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig3.jpg" alt="通道中的流体可视化；高速相机序列；流体动力学；动态过程图。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
 图3. 观察室中溶液的交换。 利用染料溶液对观察室内液体交换过程进行可视化。该图像为明场图像与染料信号伪彩强度图的叠加图像。
<img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig4.jpg" alt="根系生长延时摄影、幼苗发育、实验结果、植物生物学研究、连续图像。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
 图4. 芯片上的根系生长。 对单根表达葡萄糖/半乳糖荧光FRET纳米传感器的生长根在20小时内的连续观察。时间格式：hh:mm；比例尺：100 μm。
<img src="/files/ftp_upload/4290/4290fig5.jpg" alt="使用FRET纳米传感器检测细胞内糖浓度的荧光显微镜图像及葡萄糖与半乳糖对代谢反应影响的图表。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 5"> 
 图5. 使用FRET纳米传感器测量细胞内糖浓度。
<ol class="ualpha">
 <li>传感器的量以根尖内的锦葵素荧光强度表示（左侧）。细胞内FRET纳米传感器对葡萄糖或半乳糖溶液施加的响应以比率成像显示。（改编自Grossmann et al.，2011年《植物细胞》，经许可使用。）比例尺：100 μm。</li>
 <li>追踪FRET比率在三次重复的葡萄糖（绿色）和半乳糖（红色）方波脉冲刺激下的变化。</li>
</ol>

<ol><li>Grossmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RootChip%3A+An+Integrated+Microfluidic+Chip+for+Plant+Science%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science.</a> Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).</li>
<li>Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolithic+microfabricated+valves+and+pumps+by+multilayer+soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography.</a> Science. 288, 113-116 (2000).</li>
<li>Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Imaging+with+Fluorescent+Biosensors%3A+Advanced+Tools+for+Spatiotemporal+Analysis+of+Biodynamics+in+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative Imaging with Fluorescent Biosensors: Advanced Tools for Spatiotemporal Analysis of Biodynamics in Cells.</a> Annu. Rev. Plant Biol. , (2012).</li>
<li>Loqué, D., Lalonde, S., Looger, L. L., von Wirén, N., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytosolic+trans-activation+domain+essential+for+ammonium+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A cytosolic trans-activation domain essential for ammonium uptake.</a> Nature. 446, 195-198 (2007).</li>
<li>Okumoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+approach+for+monitoring+cellular+metabolites+and+ions+using+genetically+encoded+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 21, 45-54 (2010).</li>
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<li>Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GLUT1+and+GLUT9+as+major+contributors+to+glucose+influx+in+HepG2+cells+identified+by+a+high+sensitivity+intramolecular+FRET+glucose+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1091-1099 (2008).</li>
<li>Chaudhuri, B., Hörmann, F., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+glucose+flux+impedance+using+FRET+sensors+in+wild-type+Arabidopsis+plants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Bot%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of glucose flux impedance using FRET sensors in wild-type Arabidopsis plants.</a> J. Exp. Bot. 62, 2411-2417 (2011).</li>
<li>Meier, M., Lucchetta, E. M., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+stimulation+of+the+Arabidopsis+thaliana+root+using+multi-laminar+flow+on+a+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Chemical stimulation of the Arabidopsis thaliana root using multi-laminar flow on a microfluidic chip.</a> Lab Chip. 10, 2147-2153 (2010).</li>
<li>Parashar, A., Pandey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant-in-chip%3A+Microfluidic+system+for+studying+root+growth+and+pathogenic+interactions+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Phys.+Lett%22%5BJournal%5D)">Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis.</a> Appl. Phys. Lett. 98, 263703-26 (2011).</li>
<li>Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+and+the+future+of+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The origins and the future of microfluidics.</a> Nature. 442, 368-373 (2006).</li>
<li>Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent+Compatibility+of+Poly%28dimethylsiloxane%29-Based+Microfluidic+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Solvent Compatibility of Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Devices.</a> Anal. Chem. 75, 6544-6554 (2003).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

与传统培养方法相比，RootChip 的主要优势在于其对显微镜观察的制备过程具有最小侵入性，能够可逆且重复地改变根部环境，并可在数天内持续观察发育能力完整且生理状态健康的组织。此前，幼苗在凝胶培养基上垂直生长，并在实验开始前立即转移至灌流系统，该方法每次仅能测量单个根系8。尽管已有微流控工具用于拟南芥研究，但其集成度较低9，或缺乏灌流控制能力10。RootChip 将高度集成性与通过精确流体引导实现实验自动化的能力相结合。该平台的另一优势是所有微流控装置共有的特性11，即即使在持续数天的实验中，也仅需极少量液体即可为根系提供必要的营养物质。RootChip 目前设计为一次性使用装置，但由于芯片生产成本较低，且试剂消耗量极少，因此仍具有很高的成本效益。
为确保幼苗健康，必须采取以下几个关键步骤：
塑料锥形容器中的液体体积仅为3-4 μl，暴露在空气中会开始蒸发。因此，必须迅速将锥形容器转移至芯片上，并保持高湿度环境，直到根系进入观察室，由观察室为其提供充足的水分。为防止幼苗干燥，步骤4.2至4.5应快速且连续地完成。
步骤 3.5 - 3.8 描述了芯片在液体培养基中的孵育过程，期间根系将生长进入观察室。此步骤可跳过，直接将芯片立即安装到载体中，并开始用生长培养基持续灌注。然而，我们建议在生长培养基中浸泡过夜，因其具有以下优势：1）可形成湿润环境，使幼苗在生长进入观察室过程中不易脱水；2）芯片浸泡于液体中，后续脱气（步骤 6.4）过程将更快。
使用溶质浓度较低的培养基非常重要。较高浓度的溶液可能会析出沉淀并堵塞通道，尤其是在芯片使用数天的情况下。
当设备连接到气压管路后，通过改变阀门中的液压来控制培养基的流动。为了确保微机械阀门能够完全闭合，选择的控制压力应约为流动压力的三倍。流动压力不应超过15 psi，否则液体将从根部入口被推出。过高的压力还可能导致芯片分层，从而使芯片无法使用。
RootChip 的一个局限性在于 PDMS 具有孔隙性和疏水性。尽管该材料对水溶液基本呈惰性，但可能吸收有机化合物12。这会干扰溶液的快速更换，因为即使在入口处停止供应该有机化合物后，其仍可能从材料中渗出。由于 PDMS 具有孔隙性，使用有机溶剂可能导致 PDMS 膨胀12。
我们正在持续优化根芯片并拓展其应用，例如用于农作物根系的研究。我们相信，通过改进对根系进行处理和观察的途径，诸如根芯片之类的微流控工具将为根系研究开辟新的维度。

<table><tbody><tr><td>芯片载体、软件及其他信息。</td><td>卡内基研究所 - 植物生物学系</td><td>载体制造的CAD和CNC文件、控制器软件以及更多信息可从以下网站下载：&lt;a href=&quot;http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip&quot; target=&quot;_blank">http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip&lt;/a&gt;。也可通过该网站订购芯片载体。</td><td></td></tr><tr><td>RootChip</td><td>斯坦福微加工中心</td><td>掩模设计和制造方案可根据要求提供。可直接使用的RootChips可从以下网址订购：&lt;a href=&quot;http://www.stanford.edu/group/foundry/&quot; target=&quot;_blank">http://www.stanford.edu/group/foundry/&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>芯片控制器</td><td>自制</td><td>自动阀门控制系统最初由劳伦斯伯克利国家实验室的Rafael G&amp;#243;mez-Sj&amp;#246;berg开发。有关如何自行搭建驱动阀门控制器的详细说明，请访问：&lt;a href=&quot;https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers&quot; target=&quot;_blank">https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers &lt;/a&gt;</td><td></td></tr></tbody></table>

利用rootchip快速调控根际环境对拟南芥根生长进行延时荧光成像

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

根作为植物的物理锚定器官，负责从土壤中吸收水分和矿质养分，例如氮、磷、硫酸盐以及微量元素。如果我们希望发展可持续的高产作物生产方式，就需要更深入地理解根的发育过程、对多种养分的吸收机制，以及其与共生和致病生物之间的相互作用。为了实现这些目标，我们需要能够在数分钟至数天的时间尺度上，对根进行显微层面的细致观察和研究。
我们开发了RootChip，一种基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）的微流控装置，可使拟南芥幼苗的根在生长过程中进行成像，同时在成像前处理时避免对根部造成任何物理损伤1（图1）。该装置包含一个具有微机械阀门的分叉通道结构，可将溶液入口的流体引导至八个观察室中的每一个2。该灌流系统能够精确且快速地控制和调节根部微环境。每个腔室的体积约为400 nl，因此仅需极少量的测试溶液。
本文提供了一种利用基于成像的方法并以实时分辨率在RootChip上研究根系生物学的详细实验方案。可通过延时显微镜对根系进行持续数天的分析。根系可灌注营养液或抑制剂，且最多可同时分析八株幼苗。该系统具有广泛的应用潜力，包括在有或无化学物质条件下分析根系生长、基于荧光的基因表达分析以及生物传感器分析，例如FRET纳米传感器3。

本文提供了一种在RootChip中培养拟南芥幼苗的实验方案。RootChip是一种微流控成像平台，可自动控制生长条件，同时实现根部的显微监测以及基于FRET的细胞内代谢物水平检测。

利用RootChip快速调控根际环境对拟南芥根生长进行延时荧光成像

根作为植物的物理锚定器官，负责吸收水分和矿质养分（如氮）等。

为了实现最大产量，植物需要获得一系列营养物质。营养缺乏、寒冷或极端高温等胁迫、干旱或病原体每年都会导致作物产量大幅下降。这些问题中的许多根源往往位于地下。根是植物的物理锚定器官，同时也是负责吸收水分以及氮、磷、硫酸盐和多种微量元素等矿物质养分的器官。若要开发可持续的高产作物种植方法，我们需要更深入地了解根系的发育过程、对多种养分的吸收机制，以及其与共生和致病生物的相互作用。为此，我们必须能够在显微水平上对根系进行研究。由于显而易见的原因，根系生物学的研究历来比植物地上部分的研究更具挑战性。由于根系通常隐藏在地下，因此不易于进行显微观察。从土壤中取出根系会造成根系严重损伤，因而不适合用于研究其行为。一种使根系更易于观察的方法是将其在琼脂或本示例中所示的水培培养基上进行培养。在凝胶培养基或水培培养基中培养植物已被广泛应用于许多根系研究，并取得了显著成功。然而，使用这些方法仍然很难对根系进行长时间的显微观察。为了尽可能接近生长中的根尖，并避免成像前样品制备所带来的任何物理应力，我们构建了一个平台，既可用于根系的培养与成像，又能以极高的精度和速度控制并调节根系的微环境。该平台被称为根芯片（root chip）。根芯片是一种由PDMS（一种硅基有机聚合物）制成的微流控装置。该芯片具有用于培养和成像兔耳芥幼苗根系的观察室。种子首先在由塑料移液枪头制成的塑料锥形容器中萌发，我们将固体培养基填充于其中。根尖随后穿过固体培养基，进入观察室，在此处持续流过液体培养基，以维持观察室内的培养条件。由斯坦福大学 Steve Quake 实验室研发的恒定微机械阀在此显示为红色控制。由于芯片安装在透明盖玻片上，通常用于显微镜观察，因此可在倒置显微镜下监测观察室内的所有过程。在显微镜下可观察到引导流体流动的分叉通道结构。根芯片由两层组成：一层是包含阀门的控制层，另一层是含有通道的流体层，培养基和测试溶液通过这些通道流入观察室。这些腔室的体积约为400纳升。这意味着仅需极少量的溶液，且可实现环境条件的快速改变。本方案描述了如何准备八株或更多拟南芥幼苗的活体根部，以便在根芯片上进行并行显微成像，并持续观察长达三天。首先，在10毫米培养皿中加入含有1%琼脂的生长培养基，此时培养基仍处于液态。使用多通道移液器，从培养皿中吸取培养基，将10微升移液器吸头中各填充5微升培养基。将装填好的吸头存放于移液器吸头盒中，直至培养基凝固。然后将塑料锥形管切割成四毫米长，直立放入含有固体培养基的培养皿中。表面灭菌后，将单粒种子放置在装有培养基的锥形管顶部。用微孔胶带密封培养皿，将培养皿置于四摄氏度环境中以同步萌发。三天后，将培养皿转移至生长培养箱中以开始萌发。本实验的生长条件为23摄氏度，光照周期为16小时光照、8小时黑暗。在萌发后5至7天，幼苗应已准备好进行转移，用于检测根芯片中幼苗的健康根长；若适用，应在体视显微镜下检查荧光标记的表达情况。当幼苗的根尖到达塑料锥体底部出口时，立即标记单株幼苗以准备转移到芯片上。应选取约10株植物幼苗，以防在转移至根芯片过程中有幼苗受损。对于长期实验，将装置用组织纸包裹，置于玻璃培养皿中并进行高压灭菌。该芯片刚刚经过高压灭菌。待芯片冷却后，实验时需在其表面覆盖液体培养基。芯片应被完全覆盖，但液面高度不得超过芯片表面三毫米。使用20微升移液器通过根部入口和腔室出口吸取培养基，以填充观察室。选择合适的塑料锥形接头，将其插入根芯片中。锥形接头应紧密贴合入口。由于根芯片安装在一层薄的光学玻璃上，因此必须小心，避免对芯片施加过大的压力。在此步骤中，芯片现已准备好在液体培养基中过夜孵育，以防止芯片漂浮。将两张载玻片（其中一张被切成两半）放置在芯片上，加入一个磁力搅拌子后盖上培养皿。随后将该装置转移至磁力搅拌器上，通过轻柔搅动培养基以促进根系向出口方向生长。根芯片的入口以一定角度打孔，以进一步支持根系向期望方向生长。通过抬高芯片上与出口相对的一侧，轻微倾斜装置。芯片由连接到定时开关的环形灯照射，以维持光照与黑暗的节律。经过过夜培养后，在可密封加压的小瓶中制备液体培养基。以下步骤应快速且不间断地进行，以防止幼苗干燥。将芯片从液体培养基中取出，倒置放入同样处于倒置状态的芯片载体底部孔洞中。芯片的放置方向必须确保含有控制层入口的一侧朝向压力管路一侧的两个大连接口。用纸巾轻轻吸干芯片底部的盖玻片，然后将其固定到载具上。用胶带将整个组件倒置。使用注射器将水注入管路连接器中，并将每个管路连接器插入相应的入口。在芯片上。将管路插入培养基和溶液中。然后通过注射器向溶液胆汁施加压力，以排出管路中的小瓶和空气，载体则用透明塑料覆盖。为了在组装过程中保持高湿度，将载片放置在显微镜载物台上，应恰好嵌入载物台的凹槽中。芯片阀门以及培养基在芯片内的流动均由气压控制。两条带调节器的管路从一条主压力管路分出。其中一条用于控制液体流动，另一条连接至电磁气动阀。这些电磁阀通过USB阀控制器由计算机操控，用于驱动芯片上的阀门。 连接芯片之前，应关闭两个压力调节器。现在将管路、接头和溶液瓶连接到相应的压力管线上。向载体的储液池中加入几毫升水。在较长时间的实验过程中，此步骤可能需要重复进行。为保持较高的湿度，应尽量减少液体体积，以最大限度降低液体溅到显微镜上的风险。将环形光源移至芯片上方的指定位置，以维持明暗循环，直至实验开始。通过施加压力来关闭芯片上的阀门，在本例中是通过打开电磁空气阀实现的。LabVIEW 界面允许通过点击阀门编号下方的按钮来控制阀门。亮绿色表示已施加压力并关闭芯片阀门。该示意图展示了阀门系统的布局，其中阀门四至八作为单个阀门工作，而阀门零至三则以组的形式协同工作。在此系统中，通过激活特定的阀门组合可以单独控制某个腔室。例如，若要将流体流动仅引导至顶部的第三个腔室，则必须关闭阀门零、三和四。此外，阀门六、七和八用于控制用于冲洗入口 A、B 和 C 的溶液；现在请激活所有三个溶液入口阀门以将其关闭。控制器界面具有一个反馈回路，可实现对系统状态的监测。通过单击读取反馈按钮可激活此功能。首先打开控制层的压力调节阀，并将其设定为 15 PSI。然后打开流体层的调节阀并设定为 5 PSI。打开所选培养基的进样阀，用培养基冲洗腔室，同时应在显微镜下检查流路情况。大多数情况下，通道内会残留气泡，必须将其排出。此外，对照气道中仍含有空气，必须通过管路连接件中的水将其排出并替换。这一过程称为末端填充。通过反复冲洗全部八个腔室数次，可同时完成这两个步骤，直至所有气道中的空气被完全压入PDMS中。该系统可编程以实现实验自动化。此类程序也可用于对芯片进行脱气处理。根芯片的主要目的是将成像平台与灌流系统集成于单一装置中。为了演示对根部微环境的操控，我们用染料冲洗腔室，并测量了腔室内的液体交换情况。在推荐的5 PSI压力下，我们测得在约1.5微升/分钟的计算流速下，10秒内即可完成全部液体交换。我们还观察了此情况下幼苗的根部生长，这些幼苗在黑暗中培养，并以10毫摩尔葡萄糖作为外源能量供给。根据光照和培养基成分等生长条件的不同，可在根芯片中观察植物长达三天。该系统已被用于监测表达基因编码纳米传感器的根中细胞内葡萄糖和半乳糖水平。这些基于荧光共振能量转移（FRET）的传感器由 Fromer 实验室开发。本实验中，芯片中的根部被施加了葡萄糖或半乳糖溶液的方波脉冲。细胞内糖的水平被监测并在此展示，左侧显示为受体荧光蛋白Citrine的荧光强度与供体ECFP荧光强度的比值。我们观察了根尖中部传感器Citrine的量或该比值的成像结果，右侧则追踪了糖含量对三次重复的葡萄糖（绿色）和半乳糖（红色）方波脉冲的响应。比值上升表明糖分积累。与传统培养方法相比，根芯片的主要优势在于：对显微观察的侵入性极小，能够可逆且重复地改变根部环境，以及可在数天内对具有发育能力且生理状态健康的组织进行连续观察。另一个非常重要的优势是，仅需极少量液体即可随时间向根部提供所有必需的营养物质。这使得根芯片具有很高的成本效益，尤其是在使用昂贵试剂的情况下。我们正在持续优化根芯片并拓展其应用范围，因为我们相信，通过使这一重要器官更易于进行处理和观察，诸如根芯片之类的微流控工具可能会为植物研究开辟新的维度。有关如何构建根芯片系统的更多信息，可访问我们的网站获取。芯片可从斯坦福代工厂订购。

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