利用大单层囊泡研究BCL-2家族蛋白功能

这种生物化学定义的大型Ella囊泡模型系统可模拟线粒体外膜，用于在体外观察BCL-2蛋白的功能。首先，将脂质混合并在密封小瓶中形成脂质膜。然后制备新鲜的LUV溶液并溶解脂质膜。

接下来，挤出脂质溶液，并通过凝胶过滤纯化大体积的 Ella Les。最后一步是分析 LUVs 在去垢剂诱导下的荧光增强情况。最终，LUV 模型系统被用于评估膜通透性蛋白（如重组 BCL-2 蛋白）的功能与调控。

这种利用大型单层囊泡的方法相较于现有的线粒体等系统具有多项优势。由于这些囊泡是在无蛋白质条件下使用纯化脂质制备的，因此其组成和大小在生物化学上均具有明确的定义。

由于您所研究的蛋白质仅限于您添加的那些，因此可以对实验结果进行清晰的解释。该方法可提供关于BCL-2家族调控线粒体外膜完整性的机制性见解，也可应用于其他研究膜重塑和通透性活性的系统。

这包括线粒体动态调控机制或细菌成孔毒素。在通风橱内进行操作，并尽量减少光照。用氯仿冲洗 Hamilton Gast 型玻璃注射器。

然后，在一个1.5毫升的GL玻璃小瓶中，加入4毫克溶于氯仿的脂质。接着，通过通入惰性气体（如氮气或氩气）的温和气流去除氯仿。2至3小时后，在LUV缓冲液中检查小瓶底部和侧壁是否形成干燥的脂质膜。

配制500微升的多阴离子染料溶液和CAS离子猝灭剂涡旋混合液。将A NTS溶液与DPX溶液混合后涡旋1分钟，然后在超声水浴中进行超声处理，以确保溶液完全溶解且均匀。

现在将 A-N-T-S-D-P-X 溶液加入脂质膜中，并用封口膜密封小瓶，超声处理脂质膜 5 分钟。超声处理后，溶液将呈现乳白色。确保溶液完全溶解，因为残留的小脂质聚集体将对后续步骤产生不利影响。同时，检查小瓶的底部和侧壁，确保无残留的脂质膜。

根据制造商的说明，使用LUV缓冲液润湿滤膜支撑片和聚碳酸酯膜，然后拧紧挤出装置的外壳，确保挤出过程中无液体损失，但不要过度拧紧。为破坏膜结构，先用LUV缓冲液测试挤出器，确保无泄漏或其他问题。接着，将脂质溶液装入右侧注射器中，进行31次挤出，使大尺寸ELLA囊泡至少一次通过膜，并收集于左侧注射器中。最初几次挤出可能需要稍大的压力，若溶液突然快速通过膜，则表明已成功穿透。

检查膜是否破裂，必要时进行更换。将溶液一次性加入柱中，避免扰动凝胶界面。

让缓冲液从柱子中流出。当流速停止后，堵住柱子，轻轻加入LUV缓冲液，注意不要搅动凝胶珠。然后移除塞子，收集六份每份一毫升的馏分。

AUVs 通常在第三和第四组分中洗脱，可通过浑浊的外观进行鉴定，可回收柱洗液并在 4 摄氏度下保存。柱组分中的 UUVs 可通过荧光增强来检测，这是由于含有 CHAPS。请记住，所有 LUV 实验均需使用黑色不透光的 96 孔板。

用移液器将100微升LUV缓冲液或含0.5% CHAPS的LUV加入六个孔中。每个孔加入5微升相应的组分，并混合作用于Biotech H1 Synergy。打开Gen5 2.0软件，设定激发波长为355纳米，发射波长为520纳米。

在顶部125光学位置设置增益电压，读取高度为5.5毫米。现于37摄氏度读取酶标板，并鉴定含有LUV的组分。收集纯化的LUV组分。

这些实验旨在检测BCL-2蛋白直接诱导大单层囊泡（LUV）通透性的能力及其对通透性活性的调控作用。请按照添加顺序组合实验组分。有关BS和Bid蛋白滴定实验的详细信息，请参见随附的手稿。

将反应物在37摄氏度下孵育，以获取检测所需的时间点。将酶标板插入微孔板读数仪中，仪器将振荡酶标板并测量荧光，操作方式如前所述。本实验使用OG去垢剂激活的脂质体作为大单层囊泡（LUV）通透性的阳性对照。

值得注意的是，此处OG浓度低于0.025%时不会直接影响LUV的通透性。实验中还使用0.5% CHAPS处理以确定每次检测中LUV荧光的最大释放量。研究BCL-2家族蛋白对LUV通透性作用的一个必要起点，是确定促进最佳释放效果所需的Bax和Bid的浓度。

这些回滴曲线显示了背部和双向的最小背景释放及最佳协同效应。或者，可以对LUV通透性进行动力学测量。这些读数每两分钟进行一次，持续30分钟，每次读数前均以轻微振板2秒钟。

本实验旨在确定一种抗凋亡蛋白对Bax和Bid依赖性大单层囊泡（LUV）通透性的影响。BCL-XL以剂量依赖的方式抑制Bax和Bid的活性。在竞争性抑制实验中，通过添加后续的BH3-only蛋白可逆转该抑制作用。

例如，puma beta 会结合 BCL-xl，从而促使 Bax 和 Bid 协同作用并诱导膜通透化。一旦掌握生成大型 ELLA 囊泡的技术，即可在生化定义明确、类似于线粒体外膜的环境中，高效快速地分析 BCL-2 家族蛋白、多肽及小分子。重要的是，该检测方法能够利用终点和动力学参数，对数百种条件进行快速分析。

请注意，UUVs 和 BCL 两种蛋白质都极易受到去垢剂诱导的人为假象影响。应使用洁净且无去垢剂的设备，以确保结果的可重复性。