Name: 在Live哺乳动物细胞中质粒复制多代荧光显微镜监测 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: 学习利用荧光标记的lac阻遏蛋白在活细胞中追踪重组DNA分子，通过荧光显微镜实时观察质粒在多代细胞分裂中的分配行为，为研究病毒基因组动态提供有力工具。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）和美国癌症协会（ACS）的资助支持，包括项目编号T32CA009135、CA133027、CA070723和CA022443。Bill Sugden 是美国癌症协会研究教授。

1. 具有可见质粒的细胞的构建
<ol>
	<li>采用标准的限制性酶切或同源重组技术，将包含约250个乳糖操纵子序列（LacO）拷贝的DNA片段插入待观察的质粒中。我们的质粒为一个约170 kbp的BAC质粒，包含卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）的完整基因组，并编码潮霉素抗性12。</li>
	<li>使用Lipofectamine 2000将含LacO的质粒DNA转染至哺乳动物细胞中。我们使用10 μg纯化的质粒DNA、25 μl Lipofectamine 2000、0.5 ml OptiMEM和3.5 ml DMEM，在60 mm培养皿中对HeLa和SLK细胞进行4小时的转染。</li>
	<li>更换培养基为5 ml含10%胎牛血清的DMEM，继续培养细胞48小时。</li>
	<li>将细胞以低密度接种于大培养皿中，并在含有抗生素选择压力的培养基中培养，以筛选成功导入质粒的细胞；我们使用含10%胎牛血清和300 μg/ml潮霉素的DMEM培养基筛选3周。</li>
	<li>使用无菌的胰蛋白酶浸泡滤纸片，将具有潮霉素抗性的菌落转移至新的培养皿中。</li>
	<li>当转染的克隆生长至铺满培养皿时，提取DNA进行限制性酶切和Southern印迹分析，以确认LacO质粒聚合物均一且大小符合预期。</li>
	<li>若质粒未设计表达LacI融合蛋白，则用编码乳糖阻遏蛋白（LacI）与红色荧光蛋白（如LacI-tdTomato）融合的逆转录病毒感染合适的克隆。我们选择tdTomato而非更接近绿色荧光的蛋白，以尽量减少长时间多次曝光所引起的光毒性13。</li>
	<li>一旦引入LacI融合蛋白，需在含200 μg/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）的培养基中继续培养细胞，以阻止融合蛋白与DNA结合。</li>
	<li>继续培养细胞至少3天，以确保LacI-tdTomato蛋白充分表达。</li>
	<li>通过洗去IPTG并按如下所述观察细胞，筛选出LacI-tdTomato表达水平最佳的克隆，即能产生清晰信号且游离融合蛋白背景信号最低的克隆。</li>
</ol>
2. 成像系统的开发
我们的成像系统由配备电动载物台和 Plan-Apochromat 63x/1.4 油镜的蔡司 Axiovert 200M 显微镜组成。荧光激发光源来自 Colibri 系统的“中性白光”LED。发射光信号由 CascadeII:1024 EMCCD 相机检测。该相机为制冷型背照式相机，带有用于信号放大的增益寄存器；其暗电流为每像素每秒 0.061 个电子，量子效率大于 0.90。系统由 Axiovision 4.8 软件控制，包含 SmartExperiments 模块。在检测 tdTomato 时，我们使用蔡司滤光片组 75HE，该滤光片组可使 85% 的透射光激发荧光分子，并让 95% 的发射光通过发射滤光片。
<ol>
	<li>组装一个成像系统，该系统包括倒置显微镜和EMCCD相机，用于信号的高灵敏度检测；配备LED光源，用于特定激发和快速快门控制；配备电动载物台和电动调焦臂；并通过软件控制实现长时间内多z层图像的自动采集。该系统应置于气浮台上，以隔绝振动干扰。</li>
	<li>装配载物台顶部培养箱，以在加湿环境中维持细胞培养条件为37 °C、5–10% CO2。实验前应留出足够时间使系统达到稳定的温度，以最大限度减少实验过程中因温度变化引起的运动伪影。</li>
	<li>使用物镜加热套，防止物镜从样品中吸走热量。</li>
</ol>
3. 标记DNA的可视化
<ol>
	<li>将细胞以低于10%汇合度接种于35 mm玻璃底培养皿中，以便细胞对分裂形成的8-16个细胞的克隆之间不发生重叠。成像前至少24-48小时进行此操作，使活细胞有足够时间完成分裂。</li>
	<li>成像开始前1至3小时，用不含选择性药物和IPTG的培养基清洗培养皿3次。该步骤可去除非活细胞，并使LacI融合蛋白结合质粒中的LacO位点。</li>
	<li>将培养基更换为2 ml含10%胎牛血清和25 mM HEPES的DMEM培养基。</li>
	<li>将培养皿盖替换为固定在35 mm培养皿用安装环中的CultFoil膜。该覆盖物可抑制培养基蒸发，避免因盐浓度随时间升高而导致细胞死亡。</li>
	<li>使用微分干涉差（DIC）成像观察细胞，并在多个视野中确定细胞顶部和底部的焦平面。在每个视野中，将焦平面移至距细胞顶部约1/3深度处。将x、y、z坐标保存至已保存的载物台位置列表中。 
	注意：当使用适合LacI融合蛋白的波长LED照射细胞时，质粒信号可能无法通过目镜观察到。弱信号可能仅在使用EMCCD相机时可见，该相机可通过时间积分有效放大弱信号。</li>
	<li>在显微镜控制软件中，为每个已保存的载物台位置定义一个z轴层扫图像采集程序。选择0.35-0.50 μm的z轴步进尺寸，以实现z维度的奈奎斯特采样近似14。在细胞所在平面的上下方包含“额外”切片；这些切片有助于检测细胞周期中细胞移动后的信号，并可用于图像堆栈采集后的处理（去卷积）。根据细胞厚度不同，最终将获得包含40-60张图像的堆栈。</li>
	<li>在显微镜控制软件中，设置时间序列实验，以30分钟间隔采集z轴层扫的明场图像（用于长期追踪细胞分裂和迁移），并以10-60分钟间隔采集荧光图像（用于观察细胞内质粒）。实验过程中避免使用DIC成像，因其所需光照强度高于标准明场成像，可能在长时间实验中导致细胞光毒性暴露。</li>
	<li>启动软件控制的实验。确保实验过程中系统不受干扰（如碰撞、暴露于过强环境光等）。</li>
	<li>如有必要，在实验过程中补充加湿系统的水。</li>
</ol>
4. 图像采集后的处理
<ol>
	<li>检查每个z轴层叠图像和时间点的图像。裁剪掉图像中任何不需要的区域，以减少下一步的计算机处理时间。</li>
	<li>使用去卷积算法将每个z轴层叠图像中的信号强度重新分配至其原始像素位置15。虽然该去卷积过程可基于成像系统的理论点扩散函数进行，但更优的方法是通过成像荧光微球来测量特定系统的点扩散函数，并将此实测值用于去卷积算法中。我们测量了成像系统的点扩散函数，并在AxioVision软件（AxioVision软件描述，Zeiss）中应用了约束迭代最大似然算法。</li>
	<li>观察图像，追踪质粒在细胞周期中的强度变化和运动情况，以及质粒向子细胞的分配过程。</li>
</ol>

<ol><li>Cesarman, E., Chang, Y., Moore, P. S., Said, J. W., Knowles, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-related+body-cavity-based+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-related body-cavity-based lymphomas.</a> N. Engl. J. Med. 332, 1186-1191 (1995).</li>
<li>Chang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+herpesvirus-like+DNA+sequences+in+AIDS-associated+Kaposi%27s+sarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of herpesvirus-like DNA sequences in AIDS-associated Kaposi's sarcoma.</a> Science. 266, 1865-1869 (1994).</li>
<li>Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKnipe%2C+DM+%22Fields+Virology+2+volume+set%22">Fields Virology 2 volume set</a>. , Lippincott Williams & Wilkins. (2006).</li>
<li>Adams, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+of+latent+Epstein-Barr+virus+genomes+in+Raji+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Replication of latent Epstein-Barr virus genomes in Raji cells.</a> J. Virol. 61, 1743-1746 (1987).</li>
<li>Humme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EBV+nuclear+antigen+1+%28EBNA1%29+enhances+B+cell+immortalization+several+thousandfold%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">The EBV nuclear antigen 1 (EBNA1) enhances B cell immortalization several thousandfold.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10989-10994 (1073).</li>
<li>Verma, S. C., Choudhuri, T., Robertson, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+minimal+replicator+element+of+the+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+terminal+repeat+supports+replication+in+a+semiconservative+and+cell-cycle-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">The minimal replicator element of the Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus terminal repeat supports replication in a semiconservative and cell-cycle-dependent manner.</a> J. Virol. 81, 3402-3413 (2007).</li>
<li>Yates, J. L., Guan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epstein-Barr+virus-derived+plasmids+replicate+only+once+per+cell+cycle+and+are+not+amplified+after+entry+into+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Epstein-Barr virus-derived plasmids replicate only once per cell cycle and are not amplified after entry into cells.</a> J. Virol. 65, 483-488 (1991).</li>
<li>Ye, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+latent+nuclear+antigen+leads+to+abortive+episome+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Disruption of Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus latent nuclear antigen leads to abortive episome persistence.</a> J. Virol. 78, 11121-11129 (2004).</li>
<li>Robinett, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+localization+of+DNA+sequences+and+visualization+of+large-scale+chromatin+organization+using+lac+operator%2Frepressor+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition.</a> J. Cell Biol. 135, 1685-1700 (1996).</li>
<li>Nanbo, A., Sugden, A., Sugden, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+coupling+of+synthesis+and+partitioning+of+EBV%27s+plasmid+replicon+is+revealed+in+live+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">The coupling of synthesis and partitioning of EBV's plasmid replicon is revealed in live cells.</a> Embo. J. 26, 4252-4262 (2007).</li>
<li>Herndier, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+human+Kaposi%27s+sarcoma+cell+line+that+induces+angiogenic+tumors+in+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Aids%22%5BJournal%5D)">Characterization of a human Kaposi's sarcoma cell line that induces angiogenic tumors in animals.</a> Aids. 8, 575-581 (1994).</li>
<li>Zhou, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+infection+by+a+recombinant+Kaposi%27s+sarcoma-associated+herpesvirus+cloned+in+a+bacterial+artificial+chromosome%3A+application+for+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Efficient infection by a recombinant Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus cloned in a bacterial artificial chromosome: application for genetic analysis.</a> J. Virol. 76, 6185-6196 (2002).</li>
<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+monomeric+red%2C+orange+and+yellow+fluorescent+proteins+derived+from+Discosoma+sp.+red+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1567-1572 (2004).</li>
<li>Pawley, J. B. Points, pixels, and gray levels: digitizing image data. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+JB+%22Handbook+of+Biological+Confocal+Microscopy%22">Handbook of Biological Confocal Microscopy</a>. Pawley, J. B. , 3rd, Springer Science & Business Media, LLC. New York. 59-79 (2006).</li>
<li>Cannell, M. B., McMorland, A., Soeller, C. Image enhancement by deconvolution. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCannell%2C+MB+%22Handbook+of+biological+confocal+microscopy%22">Handbook of biological confocal microscopy</a>. Pawley, J. B. , 3rd, Springer Science & Business Media, LLC. New York. 488-500 (2006).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本文所述方法可用于在跨越多个世代的时间范围内追踪活体哺乳动物细胞中的质粒。通过限制对激发光的暴露，我们已利用这些技术将细胞从新分裂的成对细胞追踪至包含16-32个细胞的克隆群体，代表至少72小时和3次细胞分裂过程。这些实验提供了无法通过静态检测方法（如定量PCR、Southern印迹和FISH）获得的信息。
筛选具有均一结构质粒的细胞克隆至关重要，因为在使用含有重复序列（如串联的LacO重复序列）的质粒时可能发生重排。此外，优化逆转录病毒感染并筛选感染后细胞克隆以获得最佳信号强度也是必要的。表达LacI蛋白过多的细胞其细胞核内荧光背景会过高，而表达过少的细胞则信号微弱。最后，在标记视野区域以用于后续观察时，应注意细胞形态，并选择状态健康的细胞。
该技术可用于可视化几乎任何DNA分子，前提是能够通过基因工程使其包含LacO序列的串联重复。示例包括细胞染色体、天然存在的和人工的质粒，以及病毒颗粒中包装的病毒基因组。在类似于图3所示的实验中，我们发现来源于KSHV的质粒在细胞分裂过程中似乎随机分配。...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>GIBCO</td><td>31985</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Hyclone</td><td>SH30910.03</td><td></td></tr><tr><td>青霉素</td><td>Sigma</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>硫酸链霉素</td><td>Sigma</td><td>S9137</td><td></td></tr><tr><td>潮霉素</td><td>Calbiochem</td><td>400050</td><td>SLK细胞使用400 &amp;mu;g/ml；HeLa细胞使用300 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）</td><td>Roche</td><td>10 724 815 001</td><td>终浓度为200 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>GIBCO</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底培养皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-10-C</td><td></td></tr><tr><td>CultFoil</td><td>Pecon</td><td>000000-1116-08</td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 200M</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colibri</td><td>Zeiss</td><td>423052-9500-000</td><td></td></tr><tr><td>中性白光LED</td><td>Zeiss</td><td>423052-9120-000</td><td></td></tr><tr><td>滤光片组 75 HE</td><td>Zeiss</td><td>489075-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Plan-Apochromat 63x/1.4 物镜</td><td>Zeiss</td><td>440762-9904-000</td><td></td></tr><tr><td>CascadeII:1024 EMCCD相机</td><td>Photometrics</td><td>B10C892007</td><td></td></tr><tr><td>Tempcontrol mini</td><td>Zeiss/Pecon</td><td>000000-1116-070</td><td></td></tr><tr><td>Tempcontrol 37-2 数字型</td><td>Zeiss/Pecon</td><td>000000-1052-320</td><td></td></tr><tr><td>CTI Controller 3700 数字控制器</td><td>Zeiss/Pecon</td><td>411856-9903</td><td></td></tr><tr><td>物镜加热器</td><td>Zeiss/Pecon</td><td>440760-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>载物台加热插入件 P</td><td>Zeiss/Pecon</td><td>411861-9901-000</td><td></td></tr><tr><td>台式培养箱 S</td><td>Zeiss/Pecon</td><td>411860-9902-000</td><td></td></tr><tr><td>加湿系统</td><td>Zeiss/Pecon</td><td>000000-1116-065</td><td></td></tr></tbody></table>

通过荧光显微镜在活体哺乳动物细胞中监测质粒在多个世代中的复制

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

在哺乳动物细胞中能够稳定存在的天然质粒很少。其中一种是γ-疱疹病毒的基因组，包括爱泼斯坦-巴尔病毒（Epstein-Barr virus, EBV）和卡波西肉瘤相关疱疹病毒（Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus, KSHV），这些病毒可导致多种人类恶性肿瘤1-3。这两种病毒基因组均以受控方式复制，各自仅依赖一种病毒蛋白和宿主细胞的复制机制，并且尽管缺乏传统的着丝粒，仍可在细胞分裂时传递给子代细胞4-8。
已有大量工作采用Southern印迹和荧光in situ杂交（FISH）等方法对这些质粒基因组的复制进行表征。然而，这些方法存在局限性。定量PCR和Southern印迹可提供细胞群体中每个细胞所含质粒的平均数量信息。FISH是一种单细胞检测方法，能够揭示细胞群体中每个细胞的质粒平均数量及其分布情况，但该方法是静态的，无法提供被检测细胞的亲代或子代相关信息。
本文介绍了一种在活细胞中可视化质粒的方法。该方法基于荧光标记的乳糖阻遏蛋白与目标质粒中多个位点的结合9。目标DNA经过改造，包含约250个串联重复的乳糖操纵子（LacO）序列。LacO可被乳糖阻遏蛋白（LacI）特异性结合，该蛋白可与荧光蛋白融合。这种融合蛋白可由改造后的质粒表达，也可通过逆转录病毒载体导入细胞。通过这种方式，DNA分子被荧光标记，因而可通过荧光显微镜观察。在需要观察质粒之前，可通过在培养基中添加IPTG来阻止融合蛋白与质粒DNA结合。
该系统可对活细胞中质粒的多代行为进行监测，揭示其合成及向子代细胞分配的特性。理想的细胞应具有贴壁生长特性、易于转染，并拥有较大的细胞核。该技术已被用于确定，在每一代中，84%的EBV来源质粒被合成，其中88%新合成的质粒能够准确分配至HeLa细胞的子代细胞。在S期合成后，成对的EBV质粒被观察到与姐妹染色单体相连或相关联，直至在后期（Anaphase）姐妹染色单体分离时，这些质粒也随之分离10。目前，该方法正被用于研究KSHV基因组在HeLa细胞和SLK细胞中的复制。HeLa细胞是永生化的人上皮细胞，SLK细胞是永生化的人内皮细胞。尽管SLK细胞最初来源于KSHV病变组织，但HeLa和SLK细胞系均不天然携带KSHV基因组11。除了用于研究病毒复制外，该可视化技术还可用于探究各种DNA序列元件的添加、删除或突变对其他重组质粒DNA的合成、定位及分配的影响。

在代表性实验中获取的z轴层扫图像的最大强度投影如图3所示。质粒信号通常出现在z轴层扫的3-8个切片中，具体数量取决于信号代表的是单个质粒还是质粒簇。对于EBV和KSHV来源的质粒，其信号在细胞内缓慢移动，直至细胞进入有丝分裂阶段。在整个实验过程中，细胞本身会发生迁移，并在有丝分裂期间变圆并从培养皿上脱落。健康HeLa和SLK细胞的细胞周期约为24小时；完成细胞周期所需时间超过30小时的此类细胞应被视为不健康。子代细胞通常彼此靠近贴附，并在下一个细胞周期中同时进行分裂。仅应对能够明确完成一个完整细胞周期的细胞进行分析。
<img src="/files/ftp_upload/4305/4305fig1.jpg" alt="LacO 质粒示意图、融合蛋白显微图像、DNA 可视化实验结果。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
 图 1. 使质粒可见的示意图。（A）乳糖操纵...

本文描述了一种在活细胞中观察单个DNA分子的方法。该技术基于荧光标记的lac阻遏蛋白与已构建到目的DNA上的结合位点之间的结合。此方法可被用于在活细胞中随时间追踪多种重组DNA。

少数天然质粒可在哺乳动物细胞中稳定存在，其中包括γ-疱疹病毒基因组，如EB病毒（Epstein-Barr virus, EBV）……

本实验的总体目标是观察病毒基因组在分裂细胞中的分配情况。首先构建一种可通过荧光显微镜观察的质粒来实现这一目标。此处构建的质粒包含乳糖操纵子序列（LAC O）的串联重复序列。第二步是将该质粒导入正在分裂的细胞中，随后用一种编码乳糖阻遏蛋白（lac eye）与荧光蛋白融合蛋白的逆转录病毒来感染这些细胞。乳糖阻遏蛋白融合蛋白将特异性结合质粒中的乳糖操纵序列。通过荧光显微镜监测细胞，以追踪单个质粒在多次细胞周期中的行为。最终，对获取的图像进行处理，以确定病毒基因组在分裂细胞中是如何维持的。与现有的定量 PCR、Southern 印迹或荧光原位杂交等方法相比，该技术的主要优势在于能够对单个质粒在多个时间点进行观察。为了通过荧光显微镜可视化质粒，采用标准的分子克隆技术将一段包含约 250 个乳糖操纵子序列（lactose operator sequence）或 LAC O 拷贝的 DNA 片段插入质粒中。在本示例中，该质粒是一种大小约为 170 千碱基对的细菌人工染色体，包含卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）的完整基因组，并编码对潮霉素的抗性。通过转染法将含有质粒DNA的LAC O导入HeLa和SLK哺乳动物细胞中：在60毫米培养皿中，将细胞与10微克纯化质粒DNA、25微升Lipofectamine 2000、0.5毫升Opti-MEM以及3.5毫升DMEM共同孵育4小时。随后更换为含10%胎牛血清的DMEM培养基，继续培养细胞48小时使其恢复。随后将转染的细胞以低密度接种于大培养皿中，在含有10%胎牛血清和300微克/毫升潮霉素的DMEM培养基中培养三周，以筛选导入的质粒。使用无菌的吸头碎片和浸湿的滤纸片，将对潮霉素具有抗性的菌落转移至新的培养皿中。当转染的克隆经过一至两周生长至铺满培养皿时，将其置于培养箱中，分离DNA进行限制性酶切和Southern印迹分析，以确认LAC O质粒的聚合物均一且大小符合预期。此示例印迹结果显示，克隆1中的LAC O聚合物均一，并与阳性对照一致。在第七泳道中，如果质粒未被设计为表达乳糖阻遏蛋白LacI的融合蛋白，则用编码LacI与红色荧光蛋白（如TD番茄）融合的逆转录病毒转导合适的克隆。选择TD番茄而非更接近绿色荧光的蛋白，是为了尽量减少长时间多次曝光所导致的光毒性。一旦引入LacI融合蛋白，需在含有200微克/毫升IPTG的条件下培养细胞，以阻止融合蛋白与DNA结合。该实验流程中最关键的环节之一是获得具有适当荧光强度的克隆。应筛选大量克隆，以鉴定出具有最佳荧光表达的克隆。培养细胞至少三天，以使LAC eye TD番茄蛋白充分表达。筛选那些lac eye、TD番茄表达水平最佳的克隆，其信号清晰且未结合的融合蛋白背景信号最低。成像前24至48小时，将表达LAC I TD番茄蛋白的细胞接种于35毫米玻璃底培养皿中，密度低于10%汇合度。

monitoring-plasmid-replication-live-mammalian-cells-over-multiple

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

在Live哺乳动物细胞中质粒复制多代荧光显微镜监测

本方案展示了一种简单的单分子荧光显微镜技术，用于实时观察单个复制体进行的DNA复制过程。...

利用荧光显微镜观察单分子DNA复制

本文介绍了一种在siRNA转染后对活体哺乳动物组织培养细胞进行有丝分裂时间成像与定量分析的基本实验方案。...

siRNA 转染后有丝分裂的延时成像

基于FRET的报告分子正越来越多地用于监测活细胞中激酶和磷酸酶的活性。本文介绍了一种利用基于FRET的报告分子评估细胞周期依赖性靶蛋白磷酸化变化的方法。...

通过比率型FRET监测细胞周期中的激酶与磷酸酶活性

裂殖酵母的定量活细胞荧光显微镜分析

我们介绍一种活细胞成像方法，可揭示T细胞活化过程中蛋白质的动态变化。我们展示了T细胞铺展实验、共聚焦显微镜与成像分析相结合的使用方法，以获得定量结果，用于追踪T细胞活化全过程中的信号复合物形成。...

T细胞信号复合体形成的实时活体成像

该技术提供了一种方法，用于收获、标准化并定量在感染哺乳动物细胞之前，经天然原生动物宿主细胞预培养的细菌病原体的胞内生长情况。该方法可进行修改，以适用于多种不同的宿主细胞作为启动阶段的培养系统，以及不同类型的靶细胞。...

可操控的哺乳动物细胞感染实验：原虫预处理的细菌感染方法

本文介绍了一种基于活细胞荧光蛋白的方法，用于标记含有Chlamydia的细胞液泡（包涵体）。该策略可实现对样品中Chlamydia感染性的快速、自动化测定，并可用于定量研究包涵体的生长动态。...

利用荧光蛋白在活细胞中可视化并定量分析Chlamydia包涵体的生长动态

生物分子研究 体内 对于理解生物体系中分子功能至关重要。本文描述了一种新方法，可实现荧光生物分子（如 DNA 或蛋白质）向活体微生物内部的导入。对 体内...

通过电穿孔法将荧光生物分子导入活体微生物并进行观察

我们的实验方法提供了一种策略，用于追踪细菌群体中质粒丰度和抗生素抗性随时间的变化。...

实验进化方法中质粒介导的抗生素抗性定量分析

本文介绍了一种可及的、开源的微流控工作流程，用于并行分析细菌中的质粒保留情况。该方法利用荧光显微镜对凝胶微滴内单细胞微菌落中的质粒存在进行定量，为传统的平板计数法提供了一种精确、便捷且可扩展的替代方案。...

使用开源液滴微流控技术进行质粒稳定性分析

学习利用荧光标记的lac阻遏蛋白在活细胞中追踪重组DNA分子，通过荧光显微镜实时观察质粒在多代细胞分裂中的分配行为，为研究病毒基因组动态提供有力工具。

通过荧光显微镜在活体哺乳动物细胞中监测质粒在多个世代中的复制

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