一个简单的协议介导的血小板聚集恶性疟原虫受感染的红细胞在一个资源匮乏的设置
May 16th, 2013
此方法研究介导的血小板凝结的表型的恶性疟原虫感染红细胞（PRBC）临床分离株。这是由隔离和共同孵育富含血小板的血浆和猪红细胞的悬浮液。
该程序提供了一些标准化指南，用于对临床或实验室疟原虫假疟原虫分离株进行血小板介导的聚集测定。首先，从感染患者身上采集血液，通过离心收集寄生红细胞，然后培养和纯化无性成熟阶段。接下来，从健康供体收集血液，以便通过离心制备和标准化富含血小板的血浆。
将血小板和寄生红细胞混合进行聚集测定。假设免疫荧光显微镜检查的结果可以显示血小板介导的 P Fal sperum 团块。该技术专门用于测量疟原虫 sra.Clinical
isolates 在资源匮乏环境中的聚集表型。据报道，程序的最小变化会增加对现场结块酸结果的影响。因此，需要一个适用于资源匮乏环境的清晰易懂的方案，以在疟疾流行现场地点进行标准化。在柠檬酸钠中，vacutainer 从未感染疟疾的宿主那里收集大约 5 毫升全血，或从 CM 或 SM 疟疾患者那里收集大约 2.5 毫升血液。
在室温下以 250 G 离心全血 10 分钟。然后小心地将浑浊的上清液转移到干净的 15 毫升试管中。请记住，血小板很容易被温度、变化和物理冲击激活。
使用 annoy bower's 血细胞计数器计数 PRP 悬浮液，并用 PBS 调节至所需浓度，以在 1500 GS 离心 10 分钟，获得血小板贫血浆沉淀，大部分血小板来自一部分 PRP 组分。将 PRP 和 PPP 馏分在 4 摄氏度下储存长达 8 至 10 天。理想情况下，使用新鲜血小板进行凝集测定。
在培养瓶中用 5 至 10 毫升 RPMI 1640 洗涤沉淀的外周红细胞 3 次。用标准疟疾培养物、培养基和新鲜未感染的红细胞补充 PRBC，以达到 5% 的血细胞比容。用 92.5% 氮气、2.5% 氧气和 5% 二氧化碳的混合物渗透培养瓶。然后密封和培养来自患者 PB 的成熟寄生虫。
将培养瓶在 37 摄氏度的培养箱中以 5% 二氧化碳孵育 24 至 36 小时。将大约 10 至 15 微升血液放在平坦表面上的磨砂载玻片的一端。用第二张玻片的边缘接触血滴，直到血液均匀分布在第二张玻片的边缘，同时以 45 度角握住第二张玻片。
快速但轻柔地对第一张玻片施加太大的压力，将血液均匀地分布在第一张玻片上。然后风干血膜，用甲醇使标本区域脱水 10 秒。然后风干，然后用 2% keem 浸入试样中。
维持至少 10 分钟。彻底冲洗，直到水清澈并风干。在光学显微镜上的 100 x 油乳剂镜头下检查样品。
接下来，如文本方案中所述，纯化并同步成熟的 PFS parum PRBC。所有试剂均将培养物转移至干净、无菌的 15 mL 试管中。通过在室温下以 370 GS 离心 5 分钟来沉淀细胞。
现在小心吸出上清液，不要干扰沉淀。然后重悬细胞，使总体积的一半果冻熔合。下半部分的 1/3 是无蛋白培养基，下半部分的 2/3 是 PBCS。
将悬浮液转移到无菌的 15 毫升试管中，并在 37 摄氏度的培养箱中孵育 15 至 20 分钟，直到上下水平之间形成明确的界限。小心地将上层转移到新鲜的无菌 15 mL 试管中，并加入 10 mL新鲜的 RPMI 离心机，浓度为 370 至 430 GS，反应 5 分钟。然后小心丢弃上清液。
现在通过薄血涂片评估 parsit 和发育阶段，并在光显微镜下检查，如前所述。在新鲜的 1.5 毫升试管中，将血浆凝胶浮选后获得的 P RBC 悬浮液调整为每微升 P RBC 的 10 倍至第 8 分之一。我们以 5% 血细胞比容、橙或粥样斑块/毫升、终浓度和 PRP 悬浮于总体积的 10% 的 PBCS。
同样，准备以下对照未感染的红细胞以及 PRP 和 PRBC 与 PPP，以确定血小板在 PBC 聚集中的作用。现在将悬浮液转移到 2 mL 螺口盖样品瓶中。在室温下以 10 至 12 RRP 滚动，以 15 至 20 分钟的间隔取样，轻轻搅拌样品瓶，总共 120 分钟，以检查是否结块。
将 10 微升样品移液到载玻片上，并用玻璃玻片盖住，在荧光下检查，一个团块被认为是三个或更多感染红细胞的聚集体。该实验测定了大约 70% 的成熟阶段 p FALs parem 在被等离子凝胶浮选团块富集后，在显微镜下很容易发现，就像在正常光线下一样。它们表现为细胞聚集体，在荧光下表现为绿色或红色斑点。
当用 acro 和 orange 或 atry broide 染色时，分别死亡。孵育 120 分钟后，团块大小显著增加至平均每团大于 15 PBC，有些团块每团包含大量 PBC，无法目视计数。聚集表型的频率计算为在重复测定中计数的每 1000 个感染细胞中以团块形式存在的感染细胞数。
观看此视频后，您现在应该清楚地了解如何进行恶性疟原虫（血小板介导的凝集测定）。小心不要用生涩的动作和温度变化来激活血小板。该测定也可用于测量严重疟疾中血小板介导的聚集测定。
概览
本方法研究恶性疟原虫感染红细胞的血小板介导的团聚表型。该过程包括分离并共同孵育富含血小板的血浆与寄生红细胞的悬浮液。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 微生物学
- 临床研究
背景
- 血小板介导的团聚是疟疾病理学中的一个重要现象。
- 了解这种团聚可以帮助评估疟疾的严重程度。
- 标准化的方法对于研究的可重复性至关重要。
- 本研究聚焦于资源匮乏环境中的临床分离株。
研究目的
- 开发血小板介导的团聚测定的标准化协议。
- 测量恶性疟原虫的团聚表型。
- 促进疟疾流行地区的研究。
使用的方法
- 从感染患者和健康供体收集血液。
- 离心以分离寄生红细胞并制备富含血小板的血浆。
- 血小板与寄生红细胞共同孵育。
- 使用免疫荧光显微镜评估团聚。
主要结果
- 在临床分离株中成功测量了团聚表型。
- 确定了血小板活化条件以最小化变异。
- 结果显示孵育后显著的团聚形成。
- 团聚大小随时间显著增加，表明活跃的团聚。
结论
- 该测定为研究疟疾病理提供了可靠的方法。
- 标准化对于在不同环境中获得一致结果至关重要。
- 该方法可以适应用于资源匮乏的环境。
常见问题
Executive Industry Relevance
Platelet-mediated clumping of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes provides a measurable phenotype linked to malaria severity in endemic populations. Standardizing this assay enables consistent evaluation of parasite adhesion mechanisms across resource-limited field sites. This supports target validation and mechanistic de-risking in antimalarial therapeutic development by linking in vitro phenotypes to clinical outcomes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of host-parasite adhesion pathways involving CD36 and gC1qR/HABP1/p32 receptors.
- Operational Value: Provides a standardized method to assess clumping phenotype in clinical isolates without cryopreservation.
- Predictive Value: Links in vitro clumping frequency to disease severity in patient populations, supporting biomarker association studies.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Uses platelet-rich plasma and purified parasitized erythrocytes to generate quantitative clumping readouts.
- Reproducibility: Defines centrifugation, incubation, and sampling intervals to minimize variability in low-resource settings.
- Scalability: Requires minimal equipment (centrifuge, microscope) enabling deployment across malaria-endemic field sites.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Connects platelet-mediated clumping to severe malaria phenotypes observed in pediatric cerebral malaria cases.
- Translational Continuity: Allows progression from field isolate testing to mechanistic studies of adhesion receptor inhibition.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables prioritization of compounds or antibodies that disrupt platelet-mediated clumping in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the malaria discovery continuum from early target validation to preclinical evaluation of adhesion-blocking interventions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of parasite ligand-receptor interactions involved in sequestration and microvascular pathology.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs (clump frequency and size) for evaluating compound effects on platelet-mediated aggregation.
- Analytics: Generates measurable endpoints—clump frequency per 1000 infected cells and average clump size—enabling comparison across isolates and conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro phenotyping with ex vivo clinical correlations from severe malaria patient cohorts.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for assessing adhesion phenotypes across diverse Plasmodium falciparum strains and geographic isolates.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in parasite sequestration by quantifying a receptor-mediated adhesion phenotype.
- Operational Value: Ensures standardization through defined platelet preparation, parasite enrichment, and timed incubation steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in antimalarial programs by identifying compounds that inhibit pathogenic adhesion mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by linking in vitro clumping inhibition to potential reduction in severe malaria outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in parasitology, blood handling, and microscopy for accurate isolate preparation and clump detection.
- Dependent on centrifuge access for platelet-rich plasma preparation and parasitized erythrocyte purification.
- Necessitates standardization of agitation speed (10–12 rpm) and sampling intervals (15–20 min) across sites to ensure reproducibility.
- Must account for platelet sensitivity to temperature shifts and mechanical stress during isolation and assay setup.
- Limited to qualitative and semi-quantitative readouts unless paired with automated imaging or flow cytometry for high-throughput adaptation.
