一种血小板介导的聚集现象简易实验方案 恶性疟原虫资源匮乏环境下感染性红细胞的检测
2013年5月16日
本方法研究临床分离株中Plasmodium falciparum感染红细胞（pRBC）的血小板介导聚集表型。该实验通过分离富含血小板的血浆，并将其与pRBC悬液共同孵育来完成。
本实验方案为临床或实验室疟原虫假配子体分离株的血小板介导凝集试验提供了一些标准化操作指南。首先，采集感染患者的血液，通过离心收集寄生虫感染的红细胞，随后培养并纯化无性成熟阶段的疟原虫。接着，采集健康供体的血液，通过离心制备并标准化富含血小板的血浆。
将血小板和感染的红细胞合并，用于聚集试验。免疫荧光显微镜的结果可显示由血小板介导的恶性疟原虫聚集现象。该技术专门用于检测疟原虫 sra 的聚集表型。
在资源匮乏的环境下获取临床分离株。据报道，操作步骤中的微小差异可能会显著影响现场凝集酸试验的结果。因此，有必要制定一种清晰且易于遵循的操作方案，并使其适用于低资源环境，以便在疟疾流行地区的不同现场研究点之间实现标准化。使用含柠檬酸钠的真空采血管，从无疟疾感染史的宿主体内采集约 5 毫升全血，或从脑型疟疾（CM）或严重疟疾（SM）患者体内采集 2.5 毫升血液。
在室温下以 250 ×g 离心全血 10 分钟。然后小心地将浑浊的上清液转移至一个新的 15 毫升离心管中。请注意，血小板容易因温度变化和物理震荡而被激活。
使用血细胞计数板和Hemo细胞计数器对PRP悬液进行计数，并用PBS调整至所需浓度，通过在1500 × g下离心10分钟，从部分PRP组分中去除大部分血小板，从而获得血小板贫乏血浆（PPP）沉淀。将PRP和PPP组分在4°C下保存，可保存8至10天。进行聚集试验时，建议使用新鲜血小板。
将沉淀的外周红细胞在培养瓶中用5至10毫升RPMI 1640培养基洗涤三次。加入标准疟原虫培养基和新鲜未感染的红细胞，使红细胞压积达到5%。用含92.5%氮气、2.5%氧气和5%二氧化碳的混合气体饱和培养瓶。然后密封并培养以获得来自患者外周血细胞的成熟疟原虫。
将培养瓶置于37°C、5%二氧化碳的培养箱中孵育24至36小时。取一滴约10至15微升的血液，置于平放的磨砂玻片一端。用第二张玻片的边缘接触血滴，同时将第二张玻片保持在45度角，使血液均匀地分布在第二张玻片的边缘上。
快速而轻柔地将血液均匀推至第一张载玻片上，避免对第一张载玻片施加过大压力。然后将血液薄层自然晾干，用甲醇对样本区域脱水10秒。随后再次空气干燥，接着将样本浸入2%keem中。
持续至少10分钟。用大量水冲洗至水清澈，然后自然晾干。在光学显微镜下使用100倍油镜观察样品。
接下来，按照文中的实验方案纯化并同步成熟的恶性疟原虫（P. falciparum）红细胞内期寄生虫（PRBC）。将所有培养物转移至一个洁净、无菌的15毫升离心管中。在室温下以370 ×g离心5分钟，使细胞沉淀。
现在小心地吸去上清液，注意不要扰动沉淀。然后重悬细胞，使总体积的一半为琼脂糖融合液，另一半中三分之一为无蛋白培养基，另外三分之二为PBSCs。
将悬液转移至无菌的15毫升离心管中，在37摄氏度培养箱中孵育15至20分钟，直至上下层之间形成清晰的分界线。小心地将上层液体转移至新的无菌15毫升离心管中，并加入10毫升新鲜RPMI，在370至430 ×g条件下离心5分钟。然后小心弃去上清液。
现在通过薄血涂片评估寄生情况及发育阶段，并按照前述方法在光学显微镜下进行观察。将经血浆凝胶浮选后获得的P-RBC悬液用新鲜1.5毫升离心管调整至每微升含1×10⁸个P-RBC。我们将PBMC以5% hematocrit浓度悬浮于终浓度为20 µg/mL的碘化丙啶（propidium iodide）或溴化乙锭（ethidium bromide）中，PRP占总体积的10%。
同样，制备以下对照：未感染的红细胞、PRP 和 PRBC 与 PPP，以确定血小板在 PBC 聚集中的作用。现在将悬液转移至一个 2 毫升带螺口盖的小瓶中。将小瓶置于室温下轻轻振荡，以每分钟 10 至 12 转的速度滚动，每隔 15 至 20 分钟取样一次，共持续 120 分钟，观察是否有聚集体形成。
取10微升样品滴加到载玻片上，加盖盖玻片，置于荧光显微镜下观察。若出现三个或更多感染红细胞聚集在一起的团块，则视为一个聚集体。本实验在通过血浆凝胶浮选法富集后，检测到约70%的成熟阶段恶性疟原虫（p FALs）寄生红细胞。在普通光镜下，这些团块易于在显微镜下识别，表现为细胞聚集体；在荧光下则呈现为绿色或红色的亮点。
当分别使用acro和橙色或atherium bromide染料染色时，孵育120分钟后，细胞团大小显著增加，平均每个细胞团包含超过15个pbcs，部分细胞团中pbcs数量众多，无法通过肉眼计数。聚集表型的频率计算方法为：在重复实验中，每1000个被感染的细胞中存在于细胞团内的感染细胞数量。
观看本视频后，您现在应已清楚了解如何进行恶性疟原虫血小板介导的聚集试验。操作过程中需注意避免通过剧烈移动和温度变化激活血小板。该试验也可用于测量重症疟疾中的血小板介导聚集现象。
概述
该方法研究临床分离株中恶性疟原虫感染红细胞的血小板介导聚集表型。实验步骤包括分离富含血小板的血浆，并将其与寄生虫感染的红细胞悬液共同孵育。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 微生物学
- 临床研究
背景
- 血小板介导的聚集是疟疾病理学中的一个重要现象。
- 了解这种聚集有助于评估疟疾的严重程度。
- 标准化方法对于研究的可重复性至关重要。
- 本研究重点关注资源匮乏地区的临床分离株。
研究目的
- 建立血小板介导的聚集实验的标准化方案。
- 测量恶性疟原虫的聚集表型。
- 促进疟疾流行地区的研究工作。
使用的方法
- 从感染患者和健康供体采集血液。
- 通过离心分离寄生红细胞并制备富血小板血浆。
- 将血小板与寄生红细胞共同孵育。
- 使用免疫荧光显微镜评估聚集情况。
主要结果
- 临床分离株中的聚集表型已成功测定。
- 已确定血小板活化条件，以最大程度减少实验变异性。
- 结果表明，孵育后显著形成菌落聚集物。
- 聚集物尺寸随时间显著增大，表明存在活跃的聚集过程。
结论
- 该检测方法为研究疟疾病理学提供了可靠手段。
- 标准化对于在不同环境中获得一致结果至关重要。
- 该方法可经调整后用于资源有限的环境。
常见问题
行业重要性概述
血小板介导的恶性疟原虫感染红细胞的聚集现象是一种可量化的表型，与地方性流行人群中疟疾的严重程度相关。该检测方法的标准化可实现对不同资源有限的野外研究点中寄生虫黏附机制的一致评估，从而通过将体外表型与临床结果相联系，支持抗疟药物研发中的靶点验证和机制层面的风险排除。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：可研究涉及CD36和gC1qR/HABP1/p32受体的宿主-寄生虫黏附通路。
- 操作价值：提供一种标准化方法，用于评估临床分离株的聚集表型，无需冷冻保存。
- 预测价值：将体外聚集频率与患者群体的疾病严重程度相关联，支持生物标志物关联研究。
筛选与检测方法开发
- 检测准备：利用富血小板血浆和纯化的寄生红细胞生成定量的聚集读数。
- 可重复性：明确定义离心、孵育和采样时间间隔，以在资源有限的环境中最大限度减少变异。
- 可扩展性：仅需最少设备（离心机、显微镜），可在疟疾流行地区的野外现场广泛部署。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：将血小板介导的聚集与儿童脑型疟疾病例中观察到的重症疟疾表型联系起来。
- 转化连续性：可实现从野外分离株检测向黏附受体抑制机制研究的过渡。
- 风险调整后的推进：有助于在临床前模型中优先筛选可破坏血小板介导聚集的化合物或抗体。
流程与工作流整合
该检测适用于疟疾研究的连续过程，从早期靶点验证到抗黏附干预措施的临床前评估。
- 发现生物学：支持对寄生虫配体-受体相互作用在滞留和微血管病理中的假设验证。
- 筛选：提供标准化、定量的输出结果（团块频率和大小），用于评估化合物对血小板介导聚集的影响。
- 分析：生成可测量的终点指标——每1000个感染细胞的团块频率和平均团块大小，实现不同分离株和条件间的比较。
- 转化研究：连接体外表型分析与重症疟疾患者队列的离体临床相关性。
- 企业级复用：建立一个可重复使用的平台，用于评估不同恶性疟原虫菌株及地理分离株的黏附表型。
运营与企业影响
- 科学价值：通过量化受体介导的黏附表型，减少寄生虫滞留机制的不确定性。
- 操作价值：通过明确定义的血小板制备、寄生虫富集和定时孵育步骤，确保实验标准化。
- 战略价值：通过识别抑制致病性黏附机制的化合物，改善抗疟疾项目中的推进/终止决策。
- 组合影响：将体外聚集抑制效应与重症疟疾结局潜在降低相关联，支持基于风险评估的项目推进。
实施注意事项
- 需要具备寄生虫学、血液处理和显微镜技术方面的专业知识，以准确制备分离物并检测细胞团块。
- 依赖离心机获取富血小板血浆及纯化感染红细胞。
- 需在不同实验场所统一振荡速度（10–12 rpm）和取样间隔（15–20 分钟），以确保实验可重复性。
- 必须考虑血小板在分离和实验建立过程中对温度变化和机械应力的敏感性。
- 除非结合自动成像或流式细胞术以实现高通量适应，否则仅限于定性和半定量结果读取。
