利用延时显微技术观察缺氧诱导的悬浮动画现象 秀丽隐杆线虫 胚胎

本实验的总体目标是描述一种活体成像技术，利用高倍显微镜结合气体流通装置，对暴露于无氧环境的线虫胚胎进行亚细胞动态成像。首先，需准备年轻的成年转基因线虫样本，以获得适合成像的早期胚胎群体；随后，制备用于微型培养室的薄层琼脂垫载玻片。

然后将海葵适当麻醉，并覆盖石蜡油以防止在气体流动下暴露时脱水。最后，将带有麻醉后动物的圆形盖玻片放入微型培养室中。将培养室置于显微镜载物台上，并通入氮气以在成像过程中形成无氧环境，最终通过微型培养室持续通入气体流。

结合活体荧光显微镜技术，可获得线虫胚胎在缺氧条件下细胞周期停滞的高分辨率详细图像和视频。该方法相较于间接免疫荧光等现有技术的主要优势在于，能够在动物暴露于特定条件的同时，在活体内记录亚细胞结构的变化。尽管该方法可用于深入研究缺氧诱导的线虫胚胎悬停发育现象。

该方法还可应用于其他系统，例如酵母、细胞培养或其他小型无脊椎动物或脊椎动物胚胎。也可施加其他条件，例如高氧、温度、应激或小分子处理。本实验的演示者为本实验室的两名研究生 Anastacia Garcia 和 Mary Latt。首先选用合适的目的转基因秀丽隐杆线虫品系；本研究中将使用 TH 32 转基因品系，以染色体和中心粒作为细胞分裂的标记物进行观察。

通过在次氯酸盐溶液中裂解成虫以获得同步化的种群，并将残留的胚胎挑选至接种好的培养板上，让成虫产卵一到两小时，或从混合种群中挑选L4期幼虫转移至新的接种培养板上。在20摄氏度下培养线虫至刚成熟的年轻成虫阶段，此过程从孵化起大约需要96小时，从L1幼虫起约需72小时，或在L4蜕皮后约24小时。该方法可获得含有大量年轻胚胎的年轻成虫种群，这些胚胎具有较大的囊胚腔和细胞核，非常适合用于观察亚细胞及核内亚结构的动态变化。

为设置用于放置已制备载玻片的湿盒，将一张湿润的纸巾放入一个较大的培养皿或容器内，并用大小合适的盖子盖好。通过微波或水浴加热的方式，在玻璃器皿中将去离子水中的2%琼脂糖加热至完全融化。随后，在洁净的玻璃显微镜载玻片上滴加一至三滴温热的琼脂糖，立即取另一张载玻片倒置并垂直覆盖在琼脂糖液滴上，轻轻按压，使形成的垫层薄而无气泡。

待Aros冷却后，缓慢拆开两片显微镜载玻片，使Aros垫完整地保留在其中一片载玻片上。需确保Aros垫足够薄，以免影响显微镜的聚焦能力。随后，使用干净的刀片将Aros垫修整成一个小正方形并储存。

将载玻片置于已准备好的湿盒中，直至使用。使用同一把洁净的剃刀刀片，小心地取下aroS垫片的边缘，并将其从载玻片转移至一个直径为25毫米的圆形显微盖玻片上。转移时应避免在圆形盖玻片下产生气泡，确保盖玻片合适地置于微型培养箱中。

在 aros 垫上滴加一滴麻醉剂。挑选五到十条线虫，放入麻醉剂液滴中。等待一至三分钟，直至线虫停止活动。

使用移液枪枪头，在线虫上方加入一滴空心碳油，以防止气体流经腔室时线虫脱水。接着，将一段柔性塑料管的一端连接到腔室上。分开封闭式灌流微型培养箱的两个半部分，小心地将盖玻片垂直放置在底环上。

将腔室的两侧紧密闭合，然后通过柔性塑料管将腔室连接至氮气罐，并将其放置在显微镜载物台上。通过检查塑料管及腔室侧面的端口塞是否连接牢固，确保无泄漏，以便对胚胎进行成像。

首先，在低倍镜下定位动物。然后切换至适当的高倍镜。若要对成体中的胚胎细胞进行成像，请使用488纳米激光在目标细胞中定位GFP融合蛋白。

为了观察细胞周期阻滞的特定阶段，例如晚期前期，需先识别处于细胞分裂较早阶段（如晚期间期或早期前期）的细胞。用氮气灌注腔室，并在氮气充满腔室的过程中持续监测这些细胞，必要时调整焦平面。在此情况下，进行延时成像以捕获目标现象。

前期停滞及染色体与核内膜的锚定。每10秒拍摄一次图像，持续最长30分钟。通常，在开始通入氮气后20至30分钟内，缺氧诱导的前期停滞即会发生。

为了记录从缺氧诱导的停滞状态中恢复的过程，关闭气体供应，使培养 chamber 恢复至常氧状态，同时采集延时成像序列。细胞周期的重新启动以及染色体的解凝集通常在5至20分钟内发生。使用 ImageJ 或 Photoshop 处理图像和视频，并将其导入 QuickTime 进行展示。

在暴露于缺氧环境的胚胎中，前期染色体将凝缩并沿核内周排列。这一现象被称为染色体锚定；当重新供氧后，细胞周期进程将恢复，前期染色体亦将恢复正常行为。

Blasphemy 将从细胞核周边移向赤道板，表明细胞进入有丝分裂中期。一旦掌握，使用适当发育阶段的动物可在三到四小时内完成该技术。在尝试此操作时，务必记住仅使用健康的年轻成年动物，预留充足时间以完成实验，并在学习如何选择合适发育阶段的 Blasphemy 时保持耐心。

观看本视频后，您应能够充分理解如何利用氮化镓胚胎和高倍显微镜下的气体流通腔室，在活体条件下捕捉缺氧诱导的亚细胞事件。