一种用于在 Aplysia californica 中诱发并记录摄食运动程序及其生理运动的 体外 实验装置

本实验的总体目标是记录摄食运动程序期间摄食器官相关的神经、肌肉和神经元的电活动及其相应运动。首先，从麻醉后的无足目动物体内取出口球部，并将钩状电极连接至关键的神经和肌肉。第二步是将口球部置于记录皿中，并为神经节的细胞外记录做好准备。

接下来，使用细胞外电极定位目标神经元。最后一步是诱导并记录摄食运动程序，例如咬合、吞咽和排斥反应。最终，通过离体悬置的口球组织制备，展示口球在类似摄食运动过程中神经、肌肉及单个神经元的活动情况。

与现有的孤立神经节研究等方法相比，该技术的主要优势在于，可以从神经、肌肉和单个神经元记录到的信号直接关联到摄食器官的运动。协助演示该实验操作的是我们实验室的研究生 huu。开始操作时，将一只健康的 200 至 300 克重的 Plegia 置于解剖盘中，通过注射约相当于其体重 50% 的等渗氯化镁溶液进行麻醉。在动物尾部附近完成首次注射后，轻轻按摩动物体表，以促进氯化镁的扩散。

根据需要，在动物头部附近追加注射。当动物对轻柔的触觉刺激不再反应时，将其背侧朝上固定在解剖盘中。在尾部插入一枚大头针，并在每个前侧触手各插入一枚大头针。

然后使用镊子夹住并提起动物头部中央的皮肤。在鼻角四足处后方，沿动物头部做冠状切口，切口位置位于所夹持点的后方。接着，在鼻角四足之间向口部方向做正中矢状切口，以暴露口前庭结构。

接下来，将皮肤瓣从口咽部肌肉团块上拉开，并切断连接至体壁的神经和结缔组织。为将此皮肤瓣与口咽部肌肉团块完全分离，请注意不要切断任何属于口咽部肌肉团块本身的神经或组织。随后，抓住并固定食管。

在所夹持位置的后方切断食管。上提食管，并将口球后方的结构一同抬起。脑神经节、侧神经节和足神经节形成一个环状结构，其中脑神经节通过脑-口神经连索与口神经节相连。

将这些神经节环保留附着在口球上，并切断从这些神经节投射到身体其他部位的所有神经。然后切断口球周围的结缔组织，随着口球与身体的连接逐渐减少，继续将其向上提起。当口球仅与口部相连时，捏住食管和口球。

直接向前，在口器前方做最后一道切割，以分离口器肌肉团与身体。将口器肌肉团置于50%等渗氯化镁溶液和50% SIA生理盐水的混合溶液中，以便在连接电极时保持部分麻醉状态。

随后，将含有溶液的口球置于培养皿中，用剪刀从口球腹面穿过口动脉处剪开。接着剪断脑神经节与足神经节和侧神经节之间的连接，以去除后者。保留脑神经节通过CBCs与口神经节及口球相连，切断脑神经节与口球之间的其他连接。

将食管和唾液腺修剪至较短长度。在此步骤中，将钩状电极连接至眼神经、两块口神经二和三，以及口神经二的 A 分支。采用类似于 JoVE 出版物中 Collins 和 Shield 所演示的方法，此处简要总结。

每次电极脱离时，将电极置于神经或肌肉附近，把目标神经放入钩状电极中，并使用操作器轻轻提起。然后用无尘纸擦拭神经部位使其干燥。在钩住的神经上涂抹适量快速凝胶胶水，确保钩状电极完全被胶水覆盖，而参考导线的尖端不被胶水覆盖。

接下来，使用带有聚乙烯管附件的注射器将溶液从培养皿中施加到胶上，以促使胶的表面固化。下一步是准备一个圆形的100毫米×50毫米的派热克斯（Pyrex）记录皿，用作记录室，在大脑室与弯曲室之间的凹槽处用移液器吸头涂抹一层薄薄的真空脂，以尽量减少泄漏。然后用普雷斯西亚（plescia）生理盐水填充前室。

将口器肌肉群小心地从培养皿转移至圆形派热克斯玻璃皿的前室，并确保没有任何电极被拉紧，以免损伤神经。如果需要将玻璃皿转移至另一台双目解剖显微镜，务必格外小心钩状电极。用于减薄鞘膜。

将两侧口器团块上的电极分别归为一组。用手小心抓住覆盖在连接针脚上的实验室胶带固定电极，再次确保没有任何电极被过度拉紧。当培养皿置于显微镜下时，应将电极轻轻搭在培养皿边缘，并在实验间歇及各阶段之间让其自然垂放在平台上。使用水族箱用气石对口器团块腔室中的生理盐水进行通气。

接下来，将脑神经节固定在后室中，使CBCs穿过切口。在CBCs上再涂抹一些真空润滑脂。然后向培养皿的两部分均加入更多的SIA生理盐水，使神经节完全浸没。

确保生理盐水的液面低于脑部室与口部室之间真空脂的高度，以防止室间发生泄漏。此时，口部肌团应位于前室的底部。接下来，将口部神经节固定在中间平台上，以避免损伤仍与口部肌团相连的神经。

仅将针插在两根神经之间的鞘膜上。然后在口部神经节（CBCs）两侧再加两枚针以拉伸并固定组织。根据目标神经元的位置，保持口部神经节平坦或适当旋转。

为了旋转颊神经节，使用一对精细镊子夹住部分多余的 CBC 鞘膜，并将其固定在第二颊神经与第三颊神经之间。随后，原本靠近后腔室、从颊神经节顶部难以触及的大部分细胞体即可被观察到。最后，在靠近口球侧的颊神经节鞘膜上添加两根固定针。

为尽量减少口侧神经节的移动，用镊子夹住靠近后室的口侧神经节鞘膜，并用精细剪刀剪除多余的鞘膜，注意不要暴露神经元胞体。为尽量减少损伤，仅去除在完成鞘膜变薄后为观察到神经元胞体所必需的那部分鞘膜即可。将所有电极针连接至与放大器相连的电缆插座上。

确保电极未被过度拉紧，并正确连接至相应的电缆，且极性正确，以冲洗掉残留的氯化镁。用新鲜的SIA生理盐水替换口球腔室中的SIA生理盐水。接着，将丝线缝合线穿过口球前端的软组织，并位于颌软骨背侧。

使用两块油灰将缝合线固定在培养皿边缘，从而从其前端位置悬挂口面团。使用操纵器夹持玻璃细胞外电极，使电极尖端靠近口侧神经节。为定位并鉴定神经元，需将细胞外电极的尖端轻轻下移至被膜表面。

将电极置于神经元胞体上方。施加刺激电流后，将用于刺激胞体的通道切换至记录模式，以记录细胞外电极上的放电活动以及神经上的相应活动，从而诱导排斥反应。例如，通过以2赫兹、1毫秒脉冲组成的长串刺激运动程序，激活口神经2A，产生ees放电模式。

这些模式会在刺激期间持续出现，并可能在刺激结束后短时间内仍然持续。为诱导类似咬合的运动程序，将少量固体蜗牛素晶体直接放置于脑神经节上。

重复的模式通常在五分钟内开始，持续大约10到15分钟，然后逐渐减弱以诱导吞咽。与运动程序类似，施加caracol刺激，并等待口球产生强烈的咬合动作。然后在一次咬合过程中，将一条海藻放入动物口中，使其抓住海藻。

以下是刺激和记录已鉴定的运动神经元 B9，以及在同一神经元、I2 肌肉和摄食运动程序期间多条神经的记录。以下视频图像取自同一系列的运动程序。通过将卡巴胆碱施加于脑神经节，并在卡巴胆碱诱导的咬合期间随后将海藻条置于抓握器中，从而诱发吞咽模式。

在此图像中，齿舌伸出以抓取海藻；在此图像中，齿舌回缩，将海藻拉入口中。观看本视频后，您应充分了解如何建立离体悬吊口神经节复合体标本，并记录体外摄食运动节律。