Name: 新洲形成的助手依赖型腺病毒载体介导的基因转移对糖尿病小鼠肝 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 59 s
Description: 了解利用辅助依赖型腺病毒载体介导的基因转移技术，在糖尿病小鼠肝脏中诱导新胰岛形成的方法。该技术通过递送Ngn3和Btc基因，实现血糖正常化和胰岛素水平恢复，为糖尿病治疗提供了一种替代胰岛移植的有效策略。

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本研究由以下机构资助：美国国立卫生研究院（NIH）R03 DK089061-01（VKY）；NIH K08 DK068391（VKY）；贝勒医学院糖尿病与内分泌研究中心（DERC - P30DK079638）以及来自该中心的试点与可行性项目资助（DERC，VKY）；青少年糖尿病研究基金会：JDRF 奖项 # 5-2006-134（VKY）。

<ol><li>Parks, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+helper-dependent+adenovirus+vector+system%3A+removal+of+helper+virus+by+Cre-mediated+excision+of+the+viral+packaging+signal%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A helper-dependent adenovirus vector system: removal of helper virus by Cre-mediated excision of the viral packaging signal.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93, 13565-13570 (1996).</li>
<li>Kim, I. H., Jozkowicz, A., Piedra, P. A., Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifetime+correction+of+genetic+deficiency+in+mice+with+a+single+injection+of+helper-dependent+adenoviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Lifetime correction of genetic deficiency in mice with a single injection of helper-dependent adenoviral vector.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13282-13287 (2001).</li>
<li>Belalcazar, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+stable+expression+of+human+apolipoprotein+A-I+mediated+by+helper-dependent+adenovirus+gene+transfer+inhibits+atherosclerosis+progression+and+remodels+atherosclerotic+plaques+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Long-term stable expression of human apolipoprotein A-I mediated by helper-dependent adenovirus gene transfer inhibits atherosclerosis progression and remodels atherosclerotic plaques in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Circulation. 107, 2726-2732 (2003).</li>
<li>Oka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+stable+correction+of+low-density+lipoprotein+receptor-deficient+mice+with+a+helper-dependent+adenoviral+vector+expressing+the+very+low-density+lipoprotein+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Long-term stable correction of low-density lipoprotein receptor-deficient mice with a helper-dependent adenoviral vector expressing the very low-density lipoprotein receptor.</a> Circulation. 103, 1274-1281 (2001).</li>
<li>Nomura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+lipoprotein+receptor+gene+therapy+using+helper-dependent+adenovirus+produces+long-term+protection+against+atherosclerosis+in+a+mouse+model+of+familial+hypercholesterolemia%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Low-density lipoprotein receptor gene therapy using helper-dependent adenovirus produces long-term protection against atherosclerosis in a mouse model of familial hypercholesterolemia.</a> Gene Ther. 11, 1540-1548 (2004).</li>
<li>Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-efficiency+Cre%2FloxP-based+system+for+construction+of+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">A high-efficiency Cre/loxP-based system for construction of adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 10, 2667-2672 (1999).</li>
<li>Palmer, D., Ng, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+system+for+helper-dependent+adenoviral+vector+production%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Improved system for helper-dependent adenoviral vector production.</a> Mol. Ther. 8, 846-852 (2003).</li>
<li>Oka, K., Chan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helper-Dependent+Adenoviral+Vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Helper-Dependent Adenoviral Vectors.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , 16.24.1-16.24.23 (2005).</li>
<li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenin3+is+sufficient+for+transdetermination+of+hepatic+progenitor+cells+into+neo-islets+in+vivo+but+not+transdifferentiation+of+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Neurogenin3 is sufficient for transdetermination of hepatic progenitor cells into neo-islets in vivo but not transdifferentiation of hepatocytes.</a> Dev. Cell. 16, 358-373 (2009).</li>
<li>Yechoor, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+with+Neurogenin+3+and+Betacellulin+Reverses+Major+Metabolic+Problems+in+Insulin-Deficient+Diabetic+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy with Neurogenin 3 and Betacellulin Reverses Major Metabolic Problems in Insulin-Deficient Diabetic Mice.</a> Endocrinology. , (2009).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

为克服早期腺病毒（Ad）的缺陷并将其应用于基因治疗，研究人员开发了高容量腺病毒（HDAd）。然而，该技术仍面临一些挑战。例如，HDAd的包装需要辅助病毒（HV），且其载体扩增效率不如早期腺病毒。HV属于第一代腺病毒，任何HV污染都会影响HDAd的效果。因此，高效的转染以及每一轮连续传代的最佳条件至关重要。载体生产中的另一个关键参数是：应选择哪一轮传代（P1-P4）用于后续的第5轮传代，后者将直接作为悬浮细胞接种的接种物。根据我们的经验，最佳结果通常来自能使HDAd载体比例在下一轮传代中显著增加的传代轮次（如图2中的P3）。HDAd载体的产量依赖于转基因表达盒。在载体生产过程中，两个转基因均会表达，因为这两个基因均受组成型启动子驱动。Ngn3是一种转录因子，Btc是一种生长因子，这表明表达可能影响细胞谱系的转录因子的HDAd载体可能会抑制载体的扩增，而表达生长因子的载体则有助于载体的复制与包装。
随着糖尿病呈流行态势，亟需开发新的方法以恢复β细胞质量。在本报告中，我们描述了利用HDAd载体的优势，将胰岛谱系决定性转录因子Ngn3与胰岛生长因子betacellulin进行基因转移，从而诱导肝脏门静脉区域发生胰岛新生的方法。为评估该方法的有效性，必须选择血糖水平稳定的高血糖小鼠，并始终设置适当的对照组。在这些基因转移实验中，应始终使用空载体处理的糖尿病小鼠作为对照。此外，分别使用HDAd-Ngn3和HDAd-Btc处理的糖尿病小鼠，可用于检验这两个基因在胰岛新生过程中的独立作用。我们的数据表明，仅Ngn3即可足以诱导胰岛新生，而添加生长因子Btc可增强该反应，从而显著促进胰岛新生。此外，还需验证载体确实在靶组织（肝脏）中实现了表达，并通过证实糖尿病小鼠体内胰腺中不存在残余胰岛，来确认治疗后小鼠血浆中检测到的胰岛素并非来源于胰腺中的残余胰岛。
总之，HDAd 载体系统在基因转移中的优势在于其高容量的克隆能力、在肝脏中高效的转导效率以及持久的基因表达，同时具有最低的慢性毒性，并且其载体基因组不会整合到宿主染色体中。主要局限性在于其制备过程较为复杂，且其体内应用目前主要局限于肝脏，最常用的腺病毒血清型为5型。通过将胰岛谱系决定性转录因子 Ngn3 与胰岛生长因子 betacellulin 进行基因转移，在肝脏中诱导胰岛新生，可完全恢复糖尿病小鼠的血浆胰岛素水平和葡萄糖耐受性。在本报告中，我们展示了制备高质量 HDAd-Ngn3 和 HDAd-Btc 的最佳方案，并演示了在糖尿病小鼠肝脏中诱导和评估胰岛新生以逆转高血糖的技术方法。
脚注：本文所述的病毒载体和细胞系可从贝勒医学院糖尿病研究中心的载体生产核心实验室获取<a href="http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731" target="_blank">http://www.bcm.edu/mcb/index.cfm?pmid=7731</a>）。一些商业试剂盒也可用于生成HDAd病毒（例如 Microbix Biosystems Inc.

<table><tbody><tr><td>ProFectionR 哺乳动物转染试剂盒</td><td>普洛麦格</td><td>E1200</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy 血液 &amp;amp; 组织试剂盒（50）</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>PerfeCTa SYBR Green SuperMix，ROX</td><td>Quanta Biosciences</td><td>95055-500</td><td></td></tr><tr><td>脱氧胆酸钠</td><td>Sigma</td><td>D6750-25G</td><td></td></tr><tr><td>MEM粉末</td><td>Invitrogen</td><td>61100087</td><td></td></tr><tr><td>青霉素 链霉素</td><td>Sigma</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>潮霉素B</td><td>Sigma</td><td>H0654-1G</td><td></td></tr><tr><td>MEM EAGLE JOKLIK</td><td>Sigma</td><td>M0518-10L</td><td></td></tr><tr><td>Rnase</td><td>罗氏</td><td>10109169001</td><td></td></tr><tr><td>DNase I，II型</td><td>罗氏</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>链脲佐菌素</td><td>Sigma</td><td>s0130</td><td></td></tr><tr><td>玻璃旋转烧瓶</td><td>康宁</td><td>4500-3L</td><td></td></tr><tr><td>玻璃旋转烧瓶</td><td>康宁</td><td>4500-250</td><td></td></tr><tr><td>Slide A-lyzer 装置</td><td>PIERCE CH</td><td>PI66380</td><td></td></tr><tr><td>聚烯烃塑料离心管，11.2 ml</td><td>Beckman Coulter</td><td>362181</td><td></td></tr><tr><td>氯化铯 1 kg</td><td>JT4042-2</td><td>VWR</td><td></td></tr><tr><td>Beckman LE-80K</td><td>Beckman Coulter</td><td>Optimal LE-80K 超速离心机</td><td></td></tr><tr><td>筛选</td><td>VWR</td><td>28143-338</td><td></td></tr><tr><td>500 ml 离心管</td><td>康宁</td><td>431123</td><td></td></tr><tr><td>尾静脉固定器</td><td>布雷因特里科学公司</td><td>tv-150</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素，小鼠 ELISA</td><td>Mercodia</td><td>10-1247-01</td><td></td></tr><tr><td>微采血管 CB300</td><td>Sarstedt</td><td>16.443.100</td><td></td></tr><tr><td>D-葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>小鼠C肽ELISA试剂盒</td><td>和光纯药工业株式会社</td><td>#631-07231</td><td></td></tr><tr><td>豚鼠抗胰岛素抗体</td><td>Abcam</td><td>ab7842</td><td></td></tr><tr><td>山羊抗Pdx1抗体</td><td>Christopher Wright博士惠赠</td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 Ngn3 抗体</td><td>β细胞生物学联盟，&lt;br/&gt; 宾夕法尼亚大学</td><td>AB2013</td><td></td></tr><tr><td>小鼠抗 Nkx6.1 抗体</td><td>β细胞生物学联盟&lt;br/&gt; 宾夕法尼亚大学</td><td>F64A6B4</td><td></td></tr><tr><td>抗Betacellulin抗体</td><td>细胞科学</td><td>1型糖尿病是由T细胞介导的针对胰腺中胰岛素生成细胞的自身免疫性破坏所致。目前，胰岛素替代治疗仍是主要疗法，因为胰岛移植受到供体来源有限以及需要长期免疫抑制的限制。通过基因转移技术导入Neurogenin3（Ngn3，即决定胰岛细胞谱系的特异性转录因子）和Betacellulin（Btc，一种胰岛生长因子），可诱导胰岛新生，有望治愈1型糖尿病。腺病毒载体（Ads）是一种高效的基因转移载体，但早期代次的Ads在体内应用中存在多种缺陷。辅助依赖型腺病毒载体（HDAds）是最新一代的Ads，其设计旨在改善早期Ads的安全性并延长外源基因的表达时间1。由于HDAds不含病毒编码序列2-5，仅保留了病毒复制和包装所必需的顺式作用元件，因此不具有慢性毒性，并可容纳长达36 kb的基因片段。在本实验方案中，我们描述了构建HDAd-Ngn3和HDAd-Btc载体并将其递送至链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠的方法。实验结果表明，联合注射HDAd-Ngn3和HDAd-Btc可在肝脏中诱导形成“新生胰岛”，并逆转糖尿病小鼠的高血糖状态。</td><td></td></tr><tr><td>ALT（SGPT）显色试剂盒</td><td>Teco Diagnostics</td><td>A526 - 120</td><td></td></tr><tr><td>AST/（SGOT），比色终点试剂盒</td><td>Teco Diagnostics</td><td>A561-120</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;1型糖尿病是由T细胞介导的针对胰腺中胰岛素生成细胞的自身免疫性破坏所致。迄今为止，胰岛素替代治疗仍是主要疗法，因为胰岛移植受到供体来源有限以及需要长期免疫抑制的限制。通过基因转移技术导入Neurogenin3（Ngn3）——胰岛谱系决定性转录因子，以及Betacellulin（Btc）——一种胰岛生长因子，可诱导胰岛新生，有望治愈1型糖尿病。腺病毒载体（Ads）是一种高效的基因转移载体，但早期代次的Ads在体内应用中存在若干缺点。辅助依赖型腺病毒载体（HDAds）是最新一代的Ads，其设计旨在改善早期代次Ads的安全性并延长外源基因的表达时间1。由于HDAds不含病毒编码序列2-5，仅保留了病毒复制和包装所必需的顺式作用元件，因此不具有慢性毒性，并可容纳长达36 kb的基因片段。在本实验方案中，我们描述了构建HDAd-Ngn3和HDAd-Btc载体并将其递送至链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠的方法。实验结果表明，联合注射HDAd-Ngn3与HDAd-Btc可在小鼠肝脏中诱导形成“新生胰岛”，并逆转糖尿病小鼠的高血糖状态。&quot;&gt;&lt;strong&gt;表2. &lt;/strong&gt; 特异性试剂与仪器&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

通过辅助依赖型腺病毒载体介导的基因转移在糖尿病小鼠肝脏中形成新胰岛

Neo-Islet Formation in Liver of Diabetic Mice by Helper-dependent Adenoviral Vector-Mediated Gene Transfer

1型糖尿病是由T细胞介导的自身免疫反应导致胰腺中胰岛素生成细胞被破坏而引起的。迄今为止，胰岛素替代治疗仍然是主要的治疗方法，因为胰岛移植受到供体来源有限以及需要长期免疫抑制的限制。通过基因转导方法导入胰岛谱系决定性转录因子Neurogenin3（Ngn3）和胰岛生长因子Betacellulin（Btc），可诱导胰岛新生，有望治愈1型糖尿病。
腺病毒载体（Ads）是一种高效的基因转导载体；然而，早期代次的腺病毒载体在体内应用时存在若干缺点。Helper-dependent 腺病毒载体（HDAds）是目前最先进的腺病毒载体，其开发旨在改善早期代次腺病毒载体的安全性，并延长外源基因的表达1。由于HDAds不含病毒编码序列2-5，仅保留腺病毒复制和包装所必需的cis元件，因而不具有慢性毒性。这使得HDAds能够容纳长达36 kb的基因进行克隆。
在本实验方案中，我们描述了生成 HDAd-Ngn3 和 HDAd-Btc 的方法，并将这些载体递送至链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠体内。我们的结果表明，联合注射 HDAd-Ngn3 和 HDAd-Btc 可在肝脏中诱导形成“新生胰岛”，并逆转糖尿病小鼠的高血糖状态。

我们描述了通过使用辅助依赖型腺病毒载体（HDAd）将Neurogenin3（Ngn3）和Betacellulin（Btc）基因转移至链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠体内，从而诱导肝脏中新生胰岛的形成，并实现高血糖的逆转。本方法利用了辅助依赖型腺病毒载体在体内高效转导以及外源基因持久表达的优势。

1型糖尿病是由T细胞介导的自身免疫反应导致胰腺中胰岛素生成细胞被破坏而引起的。迄今为止，胰岛素替代治疗仍然是……

以下实验的总体目标是通过辅助依赖型腺病毒载体介导的基因转移，在糖尿病小鼠的肝脏中诱导新生胰岛的形成。该目标通过构建携带胰岛转录因子 Neurog3 以及胰岛生长因子 Betacellulin 的辅助依赖型腺病毒载体来实现，这些载体可诱导肝脏门脉周围区域新生胰岛结构的形成。将上述载体注射至糖尿病小鼠体内后，检测经治疗的小鼠血糖水平是否恢复正常、血浆胰岛素水平变化，以及肝脏中是否存在能够产生胰岛素的 β 细胞。这些检测的结果表明，由于门静脉周围区域肝脏中新生眼睑样结构的形成，接受载体治疗的小鼠高血糖症状得以逆转。Herpa 依赖型非致病性载体的优点在于其广泛的嗜性以及高转导效率。此外，Herpa 依赖型腺病毒载体不包含任何腺病毒编码区。因此它缺乏慢性毒性。该技术的应用延伸至糖尿病治疗，因为诱导新生胰岛是一种有效的替代方案，可避免胰岛移植所面临的供体短缺、移植物失效以及同种免疫排斥等限制。通常，初次接触该方法的研究者会遇到困难，原因是载体体积较大，导致转染过程难以进行。为尽量减少病毒污染，扩增和纯化过程必须谨慎操作。依赖辅助病毒的腺病毒载体生产涉及多个步骤，必须严格遵循操作流程以获得最佳结果。转染前准备时，将800,001个16细胞分别接种至两块六厘米培养皿中。在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养。两天后，细胞融合度将达到70%至80%，可用于转染。在转染当天。将培养基更换为五毫升新鲜培养基，孵育细胞三小时。然后使用 Promega 公司的 ProPerfection 哺乳动物转染试剂盒，将 10 微克编码神经基因三（以下简称三）或 BTC（以下简称 BTC）的 DNA 转染至细胞中。次日，每次用一毫升培养基洗涤细胞两次。在含有钙和镁的 0.1 毫升 PBS 中，按每细胞 500 个载体颗粒的量加入辅助病毒。随后每隔 10 分钟将细胞放入培养箱中。轻轻摇动培养皿，使辅助病毒均匀分布。60 分钟后，加入 1.5 毫升维持培养基，将培养皿放回培养箱中继续培养 24 小时。次日，再加入 1 毫升维持培养基。然后使用标准光学显微镜观察细胞，评估其病变效应。感染的细胞将变圆并脱落。继续培养感染的细胞至第二天，此时应有超过80%的细胞表现出细胞病变效应。用移液器反复吹打收集粗病毒裂解液，并将其转移至一个五毫升离心管中。加入相当于总体积10%的40%蔗糖溶液。将此管标记为CVL，代表粗病毒裂解液第零代传代至虱体。为释放病毒颗粒，将含有粗制病毒裂解液的管子在-80℃冰箱和37℃水浴中交替放置，反复冻融三次。第三次冻融循环结束后，用该培养基按照随文所述方法进一步扩增载体。载体扩增过程将获得载体第5代（P5）的粗制病毒裂解液。进行大规模辅助依赖型腺病毒生产时，首先将来自质粒扩增步骤的P5代细胞按前述冻融方法反复冻融三次。将三升旋转培养瓶中的16个细胞转移至500毫升锥形瓶中，在1000 × g条件下离心5分钟。离心后，弃去上清液，仅保留100毫升。然后重悬细胞，并将重悬后的细胞转移至250毫升的旋转培养瓶中。加入全部的P5粗制病毒裂解液，随后以每细胞200个病毒颗粒的量加入辅助病毒，在37°C、60 RPM条件下孵育1小时。孵育结束后，将1毫升细胞悬液转移至12孔板的一个孔中，将剩余的细胞悬液转移至一个新的3升旋转培养瓶中，并加入2升悬浮生长培养基。将培养瓶和培养板均置于二氧化碳培养箱中，在60 rpm条件下孵育2天。在接下来的两天内，监测培养板中细胞的病变效应。如果培养板中的细胞出现细胞病变效应，则转瓶培养瓶中的细胞也会出现细胞病变效应。孵育结束后，通过离心收集细胞，并用15毫升100毫摩尔的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）重悬，置于标记为P6的50毫升离心管中。将该管置于负80摄氏度保存，直至进行纯化。为纯化载体，向含有P6粗病毒裂解液的已解冻管中加入1毫升5%脱氧胆酸钠。轻轻混匀，并在室温下孵育30分钟。然后加入氯化镁、RNA A 和 DNA 1，在 37 °C 下孵育 1 小时。孵育结束后，将离心管在 6,000 × g 下离心 10 分钟。离心后，将上清液收集至新的 50 毫升离心管中，再转移至已灭菌的 NVT 65 超速离心管中。加入 2.8 毫升浓度为 1.25 克/毫升的低密度氯化铯溶液。然后使用2 mL移液管，在管底轻轻接触后，将2.8 mL密度为1.41 g/mL的高密度氯化铯（CM chloride）溶液缓慢注入离心管底部。接着，使用2 mL移液管沿管壁缓慢加入5至6 mL上清液，通过沿管壁缓慢释放溶液，使离心管液面升至管颈处。否则在高速离心过程中可能发生塌陷。如有必要，可用 100 毫摩尔的 Tris-HCl 将离心管补满。然后在 10 摄氏度条件下以 237,000 ×g 离心 30 分钟。密度梯度超速离心后，在不透明的细胞碎片下方可见一条单一的乳白色载体条带。有时在较明显的载体条带下方还可观察到一条非常微弱的辅助条带。用70%乙醇擦拭试管中下方乳白色条带处。然后使用带有22号针头的3毫升注射器，穿刺试管壁位于载体条带底部的位置，收集下方乳白色条带。将收集的载体材料转移至新的灭菌超速离心管中，再加入1.35克/毫升的氯化铯密度溶液，直至液面升至管口。 在10摄氏度下以237,000 ×g离心过夜。第二次密度梯度超速离心后，如前所述收集乳白色条带。将该条带转移至透析盒中，于4摄氏度下用含有氯化镁和蔗糖的三升无菌T tris、HCL缓冲液透析过夜，次日进行后续操作。为了从透析盒中移除辅助依赖型腺病毒载体，使用一个3毫升的注射器从透析盒顶部角落注入2毫升空气。将透析盒翻转，使注射器和针头位于底部角落，并保持透析盒直立，将溶液吸入注射器中。将现在含有纯化病毒的溶液转移至已标记的冻存管中。取20微升用于物理滴度测定，50微升用于DNA表征，分别加入1.5毫升微量离心管中，然后冷冻。冻存管中含有纯化的病毒，置于-80℃保存。纯化后的病毒应进一步评估其纯度以及体外功效。如随附文件所述，使用链脲佐菌素（streptozotocin）诱导糖尿病。在本研究中，如随附文件所述，每周监测链脲佐菌素处理的小鼠和对照小鼠是否出现高血糖。当血糖水平在250至500毫克/分升之间持续48小时后，将小鼠放入尾静脉固定器中，进行尾静脉注射。将小鼠尾巴放入含有温水的50毫升离心管中，以扩张尾静脉。然后用浸有70%乙醇的擦拭纸擦拭尾巴。用适当浓度的载体悬液填充一支1毫升注射器，并安装30½号针头，确保注射器内无气泡。然后用拇指和食指捏住注射部位以下的尾巴，将针头插入尾静脉。如果针头位于静脉内，可在针座处看到血液回闪。缓慢注射载体。如果针头位置适当，在注射过程中及注射后应无阻力。拔出针头后，用纱布按压注射部位以止血，然后将小鼠放回笼中。在载体处理后，每周监测一次禁食6小时后的血糖和体重，每两周监测一次胰岛素和肝酶水平。在治疗后六周进行葡萄糖耐量试验，以检测治疗后三周和六周体内葡萄糖刺激的胰岛素分泌是否恢复。处死小鼠后取其肝脏和胰腺组织，用于检测组织中的MNA含量及免疫染色分析，以评估是否可通过腺病毒载体介导的基因转移在糖尿病小鼠肝脏中诱导眼状结构新生。辅助依赖型腺病毒（H-D-A-D-N-G-N 3）和BTC载体的制备与纯化方法如本视频所述，通过尾静脉注射将上述载体给予链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠。空载体以及单独的H-D-A-D-B-T-C载体作为阴性对照。注射后每两天监测一次血糖，持续七至十天。注射HDAD和GN三号以及H-D-A-D-B-T-C的糖尿病小鼠高血糖症状得到逆转，而对照组小鼠则未见逆转。如图所示，在治疗六周后通过葡萄糖耐量试验监测了葡萄糖刺激的胰岛素分泌。注射了HDAD和GN以及H-D-A-D-B-T-C的小鼠中胰岛素分泌得到恢复，以评估胰岛素是否在肝脏中合成。对肝脏中的C肽和胰岛素含量进行了检测。使用商用ELISA试剂盒检测C肽浓度和总胰岛素含量。当C肽与胰岛素以摩尔比形式存在时，证实肝脏中检测到的胰岛素确实在肝脏内合成。免疫组织化学显示，在接受HDAD、NGN3和H-D-A-D-B-T-C处理的小鼠肝脏中存在阳性细胞，而在接受对照载体处理的小鼠中未见阳性细胞。免疫染色还表明，接受NGN3-BTC处理的小鼠胰腺中无残余胰岛细胞。还通过肝脏的免疫染色评估了眼睑特异性谱系转录因子的表达。如图所示，NGN three 在经 NGN three BTC 处理的小鼠肝脏中表达，但在空载体处理的小鼠肝脏中未表达。同样，与空载体处理组相比，NGN3-BTC处理小鼠肝脏中BTC的表达水平更高，如图所示。PDX1免疫染色显示，在NGN3-BTC处理的小鼠肝脏中存在细胞核定位，而在空载体处理的小鼠肝脏中则未观察到。NKX6.1也仅在NGN3-BTC处理的小鼠肝脏中被检测到。综上所述，这些结果表明在小鼠肝脏中成功诱导了新眼睑的形成。观看本视频后，您应能够充分理解如何构建肝细胞依赖型腺病毒载体，以将眼睑谱系决定基因导入肝脏，从而诱导眼睑再生。一旦掌握该技术，若操作得当，可在三周内完成。进行该操作时，需要注意的是，辅助病毒是一种第一代无毒的 avir，可帮助我们完成实验。对于体内应用，应尽量减少污染。

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本文介绍了一种从2型糖尿病小鼠模型Leprdb中分离胰岛的实验方案，以及一种利用双光子显微镜检测完整胰岛活细胞胰岛素分泌的实时细胞检测方法的详细步骤。...

Leprdb 小鼠2型糖尿病模型：胰岛分离与完整胰岛的活细胞双光子成像

本方案演示了小鼠胰岛的分离及其在脱细胞支架上的接种。将支架支持的胰岛移植到链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠的附睾脂肪垫中。胰岛在移植部位存活，并逆转了高血糖状态。...

支架支持的胰岛移植至糖尿病小鼠附睾脂肪垫

介绍了一种在小鼠体内进行网膜移植胰岛的方法。分离的胰岛与水凝胶混合后，将混合物植入糖尿病小鼠的网膜囊内。随后监测血糖水平，并进行免疫组织化学分析。...

一种将胰岛移植至小鼠大网膜的方法

本文介绍了一种利用虫蜕激素类似物特普呋酯处理，通过pEUI(+)单基因开关调控外源基因表达的实验方案。...

基于蜕皮激素受体的单基因开关用于稳健、可逆且泄漏极低的外源基因精确表达

胰岛移植是一种实现1型糖尿病患者血糖正常化的方法。本文重点介绍通过门静脉途径进行移植的技术，以维持糖尿病小鼠的正常血糖水平。...

小鼠模型中胰岛的门静脉移植

本文介绍了一种利用携带短发夹RNA（shRNA）的慢病毒转导分散的人胰岛细胞，从而制备基因修饰的人源假胰岛的实验方案。该方案使用常规易得的酶和培养器具，操作简便，可生成适用于功能学和形态学研究的基因修饰人源假胰岛。...

利用慢病毒介导的基因沉默技术在低吸附培养板中制备的人类假胰岛中的应用

本方案描述了一种简单且微创的方法，用于在非肥胖型糖尿病（NOD）-重度联合免疫缺陷小鼠体内移植并成像NIT-1细胞，这些小鼠经来自自发性糖尿病NOD小鼠的纯化脾细胞攻击后建立疾病模型。...

生物发光监测小鼠过继转移自身免疫性糖尿病模型中的移植物存活

我们提供一种微创方案，用于将人干细胞来源的胰腺干细胞胰岛移植到免疫缺陷小鼠的肌肉内 体内...

小鼠肌肉内移植人多能干细胞衍生的胰腺内分泌细胞

了解利用辅助依赖型腺病毒载体介导的基因转移技术，在糖尿病小鼠肝脏中诱导新胰岛形成的方法。该技术通过递送Ngn3和Btc基因，实现血糖正常化和胰岛素水平恢复，为糖尿病治疗提供了一种替代胰岛移植的有效策略。

通过辅助依赖型腺病毒载体介导的基因转移在糖尿病小鼠肝脏中形成新胰岛

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