人工抗原呈递细胞（aAPC）介导的自然杀伤T细胞活化与扩增

本实验的总体目标是生成基于CD1D的人工抗原呈递细胞（A APC），用于扩增NK T细胞。该过程首先通过添加蛋白质对磁珠进行功能化修饰；第二步，从外周血中富集初始的NK T细胞群体。

接下来，富集的T细胞将与人工抗原呈递细胞（A APC）共培养。最后一步是评估人工抗原呈递细胞（A APC）群体的表型和功能。最终，可通过流式细胞术分析确定扩增后T细胞亚群的纯度。与目前使用树突状细胞的方法相比，人工抗原呈递细胞（A APC）的主要优势在于，树突状细胞存在较高的供体间变异。

APCs 提供了一种可重复、即用型且标准化的方法，用于扩增 NK T 细胞。我们最初提出该方法的构想时，我正在约翰·霍普金斯大学与 Schneck 博士和 Oaky 合作。他们率先开创了使用人工抗原提呈复合物来扩增经典 CD8 T 细胞亚群的研究领域。

演示该实验操作的是博士后研究员 James East 博士和来自本实验室的研究助理 Wendy 的儿子。首先，将一毫升 Dynabead M-450 环氧微珠转移至一个五毫升透明硼硅酸盐玻璃螺口小瓶中。然后，在另一个 1.5 毫升微量离心管中，用三毫升无菌 Bore 8 缓冲液冲洗微珠。

加入100微克人CD1D IG二聚体和20微克所需的共刺激分子至1毫升无钙、无镁的PBS中。接着，将含有磁珠的玻璃小瓶置于磁铁上，吸除硼酸盐缓冲液。然后将蛋白混合物加入该玻璃小瓶中，并盖上瓶盖。

立即倒置小瓶混匀溶液，然后用帕拉膜封住瓶盖，并于4°C旋转器上过夜。次日，将玻璃小瓶再次置于磁力架上，小心吸取蛋白混合液，避免接触磁珠。加入3毫升磁珠洗涤缓冲液，4°C旋转孵育5分钟，重复洗涤磁珠三次。

为确认蛋白质已稳定结合到磁珠上，取部分磁珠用抗体进行染色，并通过流式细胞术分析。现在将五次 10 的七次方个磁珠转移至一个小的 1.5 毫升玻璃小瓶中，用 1 毫升无菌 PBS 洗涤磁珠。然后在使用前 48 至 72 小时进行后续操作。

在抗原孵育过程中，将洗涤后的磁珠与一毫升无菌 PBS 中的抗原共同孵育。收集 PBMC 时，首先将肝素抗凝的供体血液与等体积的室温 PBS 稀释。然后加入 15 毫升室温 PHI，转移至 50 毫升锥形管中，并缓慢将 25 毫升稀释后的血液混合液叠加于 PHI 液面上方。

离心后，以700 × g、室温条件离心30分钟并开启刹车。使用巴斯德移液管小心地将淋巴细胞界面层转移至一个新的50毫升锥形管中。接着，用50毫升PBS洗涤淋巴ocytes，弃去上清液，并将同一供体的各管合并至单个管中。

用 20 毫升 PBS 再次洗涤 PBMC 后，计数细胞，然后将细胞重悬于 max 缓冲液中，浓度为每毫升 5 × 10⁷ 个细胞。为分离 T 细胞组分，取 EP 人 T 细胞富集试剂盒中的 PAN T 细胞富集溶液 100 微升，与 2 毫升 PBMC 在室温下孵育 10 分钟。然后加入 100 微升磁珠，在室温下继续孵育 10 分钟。

将溶剂终体积调至2.5毫升，然后将离心管置于磁铁上。五分钟后，迅速将CD3阳性组分倒入15毫升锥形管中。用5毫升预冷的Max缓冲液洗涤细胞，并计数活细胞。

取出一份等分试样用于表面标志染色，以首先筛选出CD161阳性细胞。将富集的T细胞重悬于980 µL预冷的Max缓冲液中，然后加入10 µg抗CD161单克隆抗体，在4°C孵育10分钟。洗涤细胞后，将细胞沉淀重悬于800 µL Max缓冲液和200 µL抗小鼠IgG磁珠（microbeads）中。

将该溶液在 4 摄氏度下再孵育 10 分钟。在细胞与微珠孵育的同时，加入 3 毫升 max buffer 以平衡 LS 柱。洗涤该细胞组分后，用移液器缓慢将细胞加入 3 毫升 max buffer 中，并上样至柱中。

现在用三毫升新鲜的 max 缓冲液冲洗柱子三次。然后向柱子中再加入三毫升新鲜的 max 缓冲液，并将柱子转移至一个 15 毫升的锥形管中。推出经纯化的 CD161 阳性 CD3 阳性细胞，然后计数 NKT 细胞富集组分。

从第12至14天开始此步骤，将10的6次方个富集的CD161阳性CD3阳性T细胞与10的6次方个AA PC细胞在16毫升完全培养基中共同培养。将共培养物每孔160微升接种至96孔组织培养处理的聚苯乙烯U型底板，使用低蒸发盖。收获并计数细胞，通过流式细胞术分析细胞群，然后重新接种并继续共培养。

如上所述，将经过第二轮扩增后多余的NKT细胞进行扩增并冻存。为检测A APC细胞的功能，首先进行共培养实验：每孔加入5×10⁴个NKT细胞与5×10⁵个A APC细胞，总体积为200 µL完全培养基，置于96孔圆底板中；培养24至48小时后，收集细胞培养上清液，用于ELISA分析。该图结果显示，CD1D-Ig蛋白已稳定地固定在磁珠表面，如图所示。

如本图所示，磁珠表面同时表达了 CD1d-Ig 和抗 CD28 抗体。将 Vα14 阳性的鼠源 NK T 细胞杂交瘤 DN3A2-D3 与仅含培养基可溶性 α-GalA 抗原的未负载抗原的 A20-CD1d 细胞或负载 α-Gal 的 A20-CD1d 细胞共培养。随后收集培养上清，通过 ELISA 检测 IL-2 的产生，从而提供一种简便的方法用于检测每批抗原呈递细胞的功能。在本实验中，通过磁珠分选技术富集人外周血中 CD161 阳性、CD3 阳性的 T 细胞。

随后，细胞在14天内每周刺激一次，使用负载α-GalCer的A APC，并分析Vα24和Vβ11的表达。重要的是，即使初始NKT细胞群体比例相对较低（0.03%），这些细胞仍可扩增至约67%的Vα24阳性、Vβ11阳性群体。在此，C1R CD1D细胞与NKT细胞在96孔U型底板中以指定比例共培养，培养时间为20至24小时，培养体系中添加或不添加α-GalCer抗原。

随后通过铬释放实验评估了NKT细胞对B细胞淋巴瘤细胞系的杀伤作用。经PC扩增的NKT细胞能够裂解该淋巴瘤细胞系。无论是否存在α-半乳糖苷酰鞘氨醇（alpha-galactosylceramide），均可从健康志愿者和癌症患者的外周血单个核细胞（PBMC）中扩增出NKT细胞，并加载α-半乳糖苷酰鞘氨醇。

A A PC 已能够扩增来自两组的 NKT 细胞群体。当起始细胞数量为 200 万个 CD161 阳性 CD3 阳性 T 细胞时，经过两轮扩增后可获得超过 10 的 7 次方个细胞。NK NKT 细胞可用于功能研究，本文已对此进行了示范。

体外扩增的NKT细胞仍能对α-Gal刺激产生应答，并有效产生IL-17A、TNF-α和干扰素-γ。需要注意的是，如果初始T细胞富集群体比例较低，且无法进行第二步CD161富集，则aAPC介导的扩增可能无法获得预期结果。然而，如果循环NKT细胞的比例高于0.1%，仍应能够实现显著的不变NKT细胞扩增。

总体而言，这些数据表明，采用基于 CD1D 的 AAPC 可以有效扩增并刺激人原代 NKT 细胞。在完成该操作流程后，还可进行其他方法，如 QPCR，以回答更多问题，例如 NKT 细胞激活后的动力学特征。该技术为肝病学领域的研究人员探索 NKT 细胞在脂肪肝疾病中的作用奠定了基础。