Drosophila 幼虫的趋性关联性嗅觉学习

本实验的目的是分析高级脑功能。通过食欲和关联性嗅觉学习，在简单的模型中研究果蝇幼虫的这些功能。首先从食物瓶中收集30只处于三龄进食期的幼虫即可实现这一目标。

接下来，将幼虫置于培养皿中进行训练，每侧放置一个含有辛醇作为嗅觉刺激的气味容器，并以果糖作为奖励，训练持续五分钟。随后，在另一个不含果糖奖励的培养皿中进行第二阶段训练，每侧气味容器中含乙酸戊酯，训练同样持续五分钟。在重复上述两个训练阶段三次后，将幼虫置于两侧放置气味容器的环境中进行五分钟的无奖励测试。

最终，果蝇幼虫对一种辛醇相对于乙酸戊酯的相对气味偏好表明，果蝇幼虫能够建立嗅觉刺激与糖奖励之间的关联，这一特性可用于在遗传上易于操作的系统中研究关联学习。该方法结合神经功能的遗传干扰技术，有助于回答学习与记忆领域中的关键问题，例如：哪些神经元传递奖励信号？哪些神经元对于重复性记忆的获得或提取是必要或充分的？演示该实验操作的将是anti a postop。

我实验室的一名博士生首先制备不含果糖的2.5% aros培养皿。制备果糖培养皿时，将果糖加入已溶解的aros中，然后倒入培养皿。接着，用不同的符号标记每个培养皿，以便对实验操作者实施盲法。

含果糖的培养皿为条件性奖赏刺激，普通培养皿为非奖赏刺激。对于条件刺激，准备总共三个定制的聚四氟乙烯气味容器，每个容器中加入10 µL纯正辛醇。容器盖上有小孔，以允许气味挥发。

其次，另准备三个装有乙酸戊酯的气味容器，其中加入10 µL乙酸戊酯与石蜡油按1:50稀释的溶液。该稀释浓度的吸引力与10 µL纯正辛醛相当。首先收集30只果蝇，使其进食而不游走。第三步，从食物瓶中取出。

该实验方案可在一天中的任何时间进行，不受昼夜节律影响。将熔岩转移至含有几滴自来水的培养皿中，用刷子小心地前后移动。

然后将幼虫转移到第二个培养皿中，该培养皿中也含有数滴自来水。检查幼虫体壁上是否有食物糊状物。现在将培养皿放入实验装置中，训练幼虫将气味与特定的糖类信号关联起来。

将一个气味容器放置在两种类型培养皿中任意一种的左侧和右侧，作为刺激物使用。此处使用的是一个八角形容器，但选择是任意的，因为实验者对奖励物是盲法的。接下来，将这组三龄幼虫放置在培养皿的中央。

关闭盖子，让动物暴露在刺激中五分钟。确保幼虫能够克服水滴的表面张力，以免被困住，并能自由活动。将装有乙酸戊酯的新容器放入一个新的培养皿中。

五分钟后，使用湿润的刷子将幼虫转移至另一种培养皿中，该培养皿左右两侧放置有相反的刺激物。此处的气味物质为乙酸戊酯。幼虫转移完毕后，盖上盖子，让幼虫自由探索五分钟。

当此时间结束后，第一轮训练即已完成。以与第一轮相同的方式再进行两轮训练。使用湿润的刷子转移动物，并使每种刺激与奖励组合总共暴露三次。

实验测试时，在未包被的琼脂培养皿相对两侧分别放置装有新鲜气味物质的容器。将训练后的动物转移至培养皿中央，盖上皿盖，静置五分钟。

五分钟后，使用培养皿下方的模板，明确划分培养皿的左、右和中间三个区域，并统计每个区域中的幼虫数量。中间区域记为无偏好得分，可使分析更加严格，减少偏差。最后，为完成实验，另选取30只新的三龄进食期幼虫，重复训练和测试过程，但奖励与刺激的组合采用相反的配对方式。

继续使用相同的气味容器。需要进行多项对照测试，以确定转基因动物对奖励刺激的气味处理是否正常。 naive 气味偏好测试首先收集并清洗 30 条幼虫，方法与训练和测试时相同。

接下来，将幼虫加载到一个仅在一侧放置一个刺激小瓶的玫瑰培养皿（agro rose Petri dish）中。盖上盖子并等待五分钟。随后，使用模板统计相对于刺激物所在侧，培养皿近端、中间区域以及远端的幼虫数量。

为测试动物对糖的先天偏好，针对实验中使用的每种刺激物均需进行此测试。通过将一个培养皿中的琼脂切去一半，并用另一种类型的熔融琼脂填充空出的空间，制备半半培养皿。注意确保两半部分体积相等，且不形成明显的边界。

这可能需要使用已制备好并置于室温下的半片培养皿进行练习，将30只未经处理的、清洁过的幼虫放在培养皿中央。将皿盖盖上，静置五分钟。

随后，利用模板统计两侧的幼虫数量，并计数位于中央区域的幼虫。上述步骤用于训练和测试 trenchgenic 幼虫。以示例刺激为例，数据记录为不同区域培养皿中幼虫的数量。

经过五分钟脱离该数据偏好后，计算了各项指数，并从相互训练的组别中得出了性能指标。由于所测试的果蝇为转基因品系，实验中还提供了填充气味容器与空气之间的选择，以及纯气味物质与气味物质加糖之间的选择。对箱线图中计算所得的指标进行分析后发现，这些动物能够学会利用果糖气味作为食欲性强化剂，以区分一种辛醇与乙酸甲酯。

动物识别出两种刺激均为吸引性刺激，并表现出对果糖气味的初始偏好，而非乙酸乙酯气味。该实验范式已成功应用于多种嗅觉和视觉刺激，以及多种奖赏性和惩罚性刺激。结合果蝇中丰富的强大遗传操作手段，该范式在解析神经网络方面尤为有用；例如，通过针对由GAL4表达模式定义的特定神经元群进行遗传学操控，可评估这些神经元在食欲学习中的功能作用。

通过该实验流程，结合对神经元功能的遗传学干扰，可用于分析幼虫大脑中与学习和记忆相关的神经网络。由于幼虫大脑结构简单，该研究可达到单细胞水平。