Name: 的逻辑，实验步骤和外源天然产物生物合成的潜力，拥有复杂的抗生素红霉素通过 E.大肠杆菌 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: 了解异源生物合成技术在大肠杆菌中生产红霉素A的完整流程。本研究通过基因转移、途径重构和产物分析，成功实现了复杂抗生素的高效合成与活性验证。

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作者感谢美国国立卫生研究院（NIH）（项目编号：AI074224 和 GM085323）以及国家科学基金会（NSF）（项目编号：0712019 和 0924699）对致力于异源生物合成项目的资助。

以下文本针对红霉素A抗生素，但所述步骤设计为可普遍适用于其他天然产物作为异源生物合成的候选物。
1. 红霉素A基因簇转移
<ol>
	<li>设计PCR引物以扩增与红霉素A基因簇相关的所有基因 S. erythraea 染色体。此步骤仅适用于那些遗传序列已被确定的天然产物候选分子。或者，所需基因可通过多家商业供应商进行合成，其优势在于新合成的基因可针对新宿主中的最优密码子使用进行设计 E. coli 宿主。如果进行DNA合成，当前面临的挑战是生成长度可能超过10 kb的巨型合酶基因。从技术上讲，合成是可行的，但过程困难且成本高昂。预计随着基因合成技术的持续改进，将逐步克服现有缺陷，并进一步验证该方法在提供异源遗传物质方面的可行性。</li>
	<li>使用新制备的样品进行 PCR S. erythraea 以基因组DNA为模板。染色体DNA可从培养物中制备 S. erythraea 或从该细菌的冻存菌种图3)25PCR反应中可添加DMSO（50 μl反应体系中加入4 μl），以应对目的片段高G+C含量的问题 S. erythraea 基因。每个扩增出的基因都应进行测序，以确认完整基因已被成功获取，且在PCR过程中未引入任何突变。</li>
	<li>通过限制性消化和连接，将每个分离出的基因插入专为表达设计的载体中 E. coli (图3）。这需要在PCR引物中设计限制性酶切位点，以便将产物经酶切后连接至合适的表达载体（文中已提供一个示例） 图3）。我们使用了pET21和pET28载体。pET28载体允许加入5'端前导序列，在红霉素A的案例中促进了基因表达。通过RT-PCR、SDS-PAGE分析（使用可溶性蛋白组分）或便捷的表型检测来确认各基因的表达。图4).</li>
	<li>根据成功从单个表达质粒表达的基因构建操纵子（图3）。我们传统上使用兼容-黏性末端限制性内切酶组合（例如 Xba我与 光谱I) 24 依次将基因转换为操纵子；然而，用于构建操纵子的限制性酶切位点必须不存在于（或需从）分离的基因序列内部（若采用基因合成方法可避免此问题）。此步骤在将20个红霉素A基因整合之前完成 E. coli 转化。目前，我们已利用该方法将最多达 20 kb 的外源 DNA 插入标准的 pET 载体中（包含两个约 10 kb 的基因）。此外，我们还采用该方法构建了包含九个基因的操纵子。尚不明确 pET 型质粒究竟可整合多少 DNA 或多少基因；然而，上述数据为复杂系统（如红霉素生物合成途径）的研究提供了参考。最后，标准 体外 随着操纵子和质粒尺寸的增大，连接步骤及后续成功的转化步骤变得愈发困难。通过调整连接温度（12–22 °C）和时间（3–24 h），并采用电转化方法，以促进最终质粒构建体的生成。</li>
	<li>将新设计的生物合成质粒转化进入 大肠杆菌 使用电转化法转化BAP1菌株（图5）。可尝试将质粒依次或同时导入。在转化较大或较多质粒时，我们传统上采用电穿孔转化法（而非化学转化法）。转化后，将细胞涂布于含有四环素（5 mg/l）、羧苄西林（100 mg/l）、卡那霉素（50 mg/l）、链霉素（50 mg/l）和安普霉素（50 mg/l）的固体LB培养基上，以筛选维持质粒的菌落。在转化后使用六种不同抗生素进行筛选的情况极为罕见 E. coli 细胞，但这仅反映了实现最终红霉素A生物合成所需的质粒总数。尽管该方法可行，但一旦开始培养，其会限制该化合物的生产能力（详见下文）。</li>
</ol>
2. E. coli 生物合成重建
<ol>
	<li>菌株 BAP1 经过设计，可提供生物合成所需的底物，并对脱氧红霉内酯 B 巨型合酶进行翻译后修饰。红霉素 A 代谢途径中的各个基因已进行基因表达测试，并被整合为操纵子形式插入表达质粒中。本部分专注于测试完整红霉素 A 代谢途径协同活性的培养条件。</li>
	<li>取三份新近转化的 BAP1 单菌落，分别接种于 1.5 ml 含相应质粒筛选抗生素（浓度与前述固体培养基筛选转化子时相同）、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG；100 μM）和阿拉伯糖（2 mg/ml）以诱导基因表达，以及 20 mM 丙酸钠以支持细胞内生物合成前体生成的 LB 培养基中。在确认产物生成后，可进行更大规模的培养，以尝试扩大规模并最大化产物滴度。</li>
	<li>将细胞在 22 °C、250 rpm 条件下培养 24–48 小时。在此情况下，抗生素筛选可确保所需质粒在细胞培养早期得以维持。然而，随着培养过程中抗生素浓度的变化，质粒可能容易丢失。这可能导致质粒不稳定（即 培养过程中一个或多个质粒的丢失），从而限制产物的生产能力。当使用不相容质粒引入完整的异源基因簇时，该问题会更加严重。红霉素 A 化合物（图 5）即为此类情况，若要真正实现从 E. coli 中高效过量生产该化合物，必须解决此问题。然而，出于验证初始产物生成的目的，为快速验证异源表达策略的可行性，可暂时容忍此类设计缺陷。</li>
	<li>使用 Eppendorf 微型离心机以 10,000 rpm 离心澄清培养物。移除上清液并储存于 4 °C 以待分析。</li>
	<li>针对红霉素 A 无法产生化合物的问题，可通过引入 GroES/EL 分子伴侣（使用 pGro7 以特异性解决酶在表达后活性不足的问题）以及增加特定基因的拷贝数（针对疑似表达或活性较弱的基因）来解决。其他异源天然产物生产过程中也可能需要采用类似策略。</li>
</ol>
3. 产物分析
<ol>
	<li>为确认并定量红霉素A的生成，将培养上清液注入LC-MS系统（图6）。使用市售的红霉素A标准品确认产物生成，并在定量过程中作为标准曲线参照。对于无市售标准品的情况，LC-MS分析需结合核磁共振（NMR）和高分辨质谱进行额外的化学结构表征。</li>
	<li>比较BAP1转化所得的3个菌落/培养物之间的产量，选择产量最高的菌株，并从该菌落来源制备甘油保存菌种。此步骤可与第2部分方案中的生产培养平行进行，即取少量培养物制备甘油保存液。将甘油保存菌种置于-80 °C冰箱中保存。</li>
	<li>使用已确认且产量最高的菌种启动独立的生产培养，用两倍体积的乙酸乙酯萃取最终上清液。使用真空蒸发系统将萃取物干燥，并重悬于100 μL甲醇中。将萃取物转移至无菌滤纸片（直径约1/4英寸），并让滤纸片自然干燥。另取B. subtilis在LB液体培养基中过夜培养。取20 μL B. subtilis培养物加入20 mL温度为45 °C的液体LB琼脂中，倒入培养皿并静置凝固。将滤纸片置于琼脂平板表面，在37 °C下培养（图7）。或者，也可将萃取物加入96孔板中的液体培养物内，利用酶标仪定量其生物活性（图7）。</li>
</ol>

<ol><li>Adrio, J. L., Demain, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+improvement+of+processes+yielding+microbial+products%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Genetic improvement of processes yielding microbial products.</a> FEMS Microbiol. Rev. 30, 187-214 (2006).</li>
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<li>Zhang, H., Skalina, K., Jiang, M., Pfeifer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+E.+coli+erythromycin+a+production+through+the+application+of+metabolic+and+bioprocess+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Improved E. coli erythromycin a production through the application of metabolic and bioprocess engineering.</a> Biotechnol. Prog. 28, 292-296 (2012).</li>
<li>Zhang, H., Wang, Y., Wu, J., Skalina, K., Pfeifer, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+biosynthesis+of+erythromycin+A+and+designed+analogs+using+E.+coli+as+a+heterologous+host%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Complete biosynthesis of erythromycin A and designed analogs using E. coli as a heterologous host.</a> Chem. Biol. 17, 1232-1240 (2010).</li>
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</ol>

未声明任何利益冲突。

异源生物合成过程中的关键步骤体现在该流程的三个操作环节：1）基因转移；2）生物合成途径的重建；3）产物分析。任何一个阶段出现问题，都会导致异源生物合成的最终目标失败。其中最具挑战性的环节可能是实现生物合成途径的重建，因为只有成功重建才能进行有效的产物分析。然而，重建的成功依赖于对负责最终生物合成的遗传物质进行精确的设计与转移。同样，已建立的高灵敏度分析方法（如液相色谱-质谱联用，LC-MS）能够检测到极低产量的产物，否则这些产量可能被误判为无产物生成。正是这些因素的综合作用，使得异源生物合成具有高度挑战性。
以红霉素A为例，在将基因整合以实现协调表达和天然产物合成之前，通过PCR分离得到的已确认基因序列需逐一测试其表达情况。在最初的产品分析尝试中，只有当伴侣素（GroEL/ES）与所需基因簇共表达时，才能首先鉴定到中间化合物。最终产物的生成则需要引入一个额外拷贝的、负责生物合成最后一步的基因（eryK）。上述两种措施均得益于所采用的高灵敏度LC-MS分析方法，该方法用于初步评估产物的生成情况。
在确认产物...

红霉素A是一种由革兰氏阳性土壤细菌Saccharopolyspora erythraea产生的聚酮类抗生素，经过数十年的传统诱变与筛选方案，以及近期的工艺优化策略，目前其产量已逐步提升至约10 g/L1-6。由于天然抗生素生产宿主在培养和/或遗传操作方面存在困难，同时抗生素活性或生长表型的改善易于检测并有助于筛选，因此诱变与筛选策略在抗生素天然产物开发中十分常见。对于红霉素A而言，S. erythraea受限于生长缓慢以及缺乏如E. coli等生物所具备的高效遗传操作手段，从而阻碍了产量的快速提升及新衍生物的生物合成。在认识到这些生产瓶颈并意识到红霉素A类化合物结构多样化的潜力后，科研界开始探索异源生物合成的可行性（图1）7。这些研究进展恰逢红霉素A基因簇序列信息的公布8-11。需要强调的是，目前已测序的复杂天然产物基因簇数量大幅增加12-16，这进一步推动了异源生物合成研究的发展，以挖掘其编码的药用潜力。实现这一目标，异源重构要求新宿主能够满足特定生物合成途径的需求。E. coli具备技术操作便利性、丰富的分子生物学工具，以及成熟的代谢与工艺工程策略，有利于产物开发。然而，与天然生产宿主相比，E. coli在复杂天然产物合成能力方面表现有限。因此，此前尚不清楚E. coli是否可作为复杂天然产物生物合成的有效异源宿主。不过，人们普遍认为，若能实现异源生物合成，E. coli将是一种理想的宿主生物。
本着这一目标，初步研究开始致力于通过合成途径制备聚酮类糖苷配基6-脱氧红纹菌素B（6dEB）。 E. coli然而，天然的 E. coli 代谢无法提供足够水平的丙酰-CoA和(2S)-甲基丙二酰-CoA前体以支持6-脱氧红霉内酯B的生物合成，且新宿主也无法对脱氧红霉内酯B合成酶（DEBS）进行翻译后修饰。为解决这些问题，构建了一条由内源性和异源性酶组成的代谢途径 大肠杆菌 使得外源供给的丙酸在细胞内转化为丙酰-CoA，进而转化为(2S)-甲基丙二酰-CoA；在对该通路进行工程化以实现完整功能的过程中，一个 sfp 基因被插入到染色体中 E. coli BL21(DE3) 以构建一种名为 BAP1 的新菌株。Sfp 酶是一种磷酸泛酰巯基乙胺转移酶，能够将 4'-磷酸泛酰巯基乙胺辅因子连接到 DEBS 酶上 17,18三个DEBS基因（每个约10 kb）随后被分别构建到两个具有独立筛选标记的表达载体中，载体含有可诱导的T7启动子。在关键的诱导后温度调整（至22 °C）后，DEBS基因在BAP1中协调表达，产生活性状态的蛋白，能够生成6dEB。 19. 
随后，人们开始利用来自Micromonospora megalomicea的类似基因簇，或由S. erythraea、S. fradiae和S. venezuelae的基因组成的杂合途径，以实现红霉素A的完整生物合成，这些途径分别产生中间体红霉素C和6-脱氧红霉素D20-22。最近，我们的研究团队通过大肠杆菌（E. coli）成功合成了临床上最重要的红霉素形式——红霉素A。与以往研究不同，我们的策略协同表达了S. erythraea中用于聚酮生物合成、脱氧糖生物合成与连接、进一步修饰以及自我抗性的全部20个原始基因（图2）。总共对26个（内源和异源）基因进行了工程化改造，使E. coli能够以4 mg/L的产量生成红霉素A23,24。该成果确立了利用E. coli完整合成复杂聚酮类天然产物的可行性，为开发和利用这一新型生产方式或探索其他新途径奠定了基础。

<table><tbody><tr><td>PCR仪</td><td>Eppendorf</td><td>Mastercycler personal</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜（DMSO）</td><td>Fisher</td><td>BP231</td><td></td></tr><tr><td>电穿孔仪</td><td>BioRad</td><td>Micropulser</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Fisher</td><td>BP1620</td><td></td></tr><tr><td>丙酸钠</td><td>Sigma</td><td>P1880</td><td></td></tr><tr><td>L-阿拉伯糖</td><td>Sigma</td><td>A3256</td><td></td></tr><tr><td>冷冻摇床</td><td>Thermo Scientific</td><td>MaxQ 4000</td><td></td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td>Centrifuge 5415D</td><td></td></tr><tr><td>pGro7</td><td>Takara</td><td>Chaperone Plasmid Set (3340)</td><td></td></tr><tr><td>pET21, pET28, pCDF-Duet-1</td><td>EMD Chemicals</td><td>69742-3, 69864, 71340</td><td></td></tr><tr><td>液相色谱-质谱联用仪（LC-MS）</td><td>Applied Biosystems</td><td>3200 Q-Trap</td><td></td></tr><tr><td>乙酸乙酯</td><td>Sigma</td><td>270989</td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Sigma</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>真空离心浓缩仪</td><td>Eppendorf</td><td>Concentrator 5301</td><td></td></tr><tr><td>旋转蒸发仪</td><td>Buchi</td><td>R-200</td><td></td></tr></tbody></table>

异源天然产物生物合成的原理、实验步骤及其潜力：以大肠杆菌（e. coli）合成复杂抗生素红霉素a为例

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

异源生产复杂天然产物是一种旨在应对当前局限性并探索未来可能性的方法。该方法特别适用于那些具有治疗价值但难以充分生产、或可从改进生产方式中获益的化合物。相关实验步骤可分为三个部分：1）基因转移；2）异源重构；3）产物分析。各个实验环节均在持续优化中，以应对这一新兴方法所带来的挑战，并把握其潜在机遇。
异源生物合成始于鉴定出负责某种有价值天然产物的基因序列。由于产物形成所依赖的生物合成途径具有复杂性，将该序列转移至异源宿主的过程变得复杂。红霉素A就是一个很好的例子。其最终生物合成需要20个基因（总计超过&gt;50 kb）。此外，其中三个基因编码巨型合成酶，即每个分子量约为300 kDa的多结构域酶。这些遗传物质必须经过合理设计并转移至E. coli，以实现重建的生物合成。本文将介绍在将红霉素A基因簇转移至E. coli的过程中，PCR扩增、操纵子构建、多顺反子质粒以及电穿孔转化技术的应用。
转移完成后，E. coli 细胞必须能够支持最终的生物合成过程。由于E. coli与大多数负责复杂天然产物合成的原始宿主之间存在显著差异，这一过程也颇具挑战性。细胞必须提供生物合成所需的必要底物，并协调表达转移的基因簇以产生有活性的酶。以红霉素A为例，需对E. coli细胞进行改造，使其提供生物合成所必需的两种前体（丙酰-CoA和(2S)-甲基丙二酰-CoA）。此外，还需进行基因序列修饰、调控质粒拷贝数、共表达分子伴侣素、实现翻译后酶修饰以及优化工艺温度，才能最终实现红霉素A的合成。
最后必须评估成功生产的情况。对于红霉素A的案例，我们将介绍两种方法。第一种是液相色谱-质谱联用（LC-MS）法，用于确认并定量产物的生成。红霉素A的生物活性还将通过生物测定法进行验证，即检测其对枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的抗生素活性。这些评估实验可确立由大肠杆菌（E. coli）合成红霉素A的可行性，并为后续的工程化改造以提升或多样化产物产量，以及利用该策略生产其他复杂天然化合物奠定基础。

该方法的预期结果是从 E. coli 异源宿主。这一点最能通过用于确认和定量产物的液相色谱-质谱（LC-MS）结果来体现图 6）以及用于确认最终活性的抗菌生物测定（图7在异源生物合成的整体方案中，这一结果标志着成功。一旦实现，研究工作便转向优化（包括细胞水平和工艺水平）以及分子工程。最终目标包括为原始化合物建立经济高效的生产工艺，并实现对异源系统的可控性，从而能够理性地调整工艺，以生成具有增强或更广活性谱的原始化合物的衍生物。
若未能成功生成目标化合物，则需启动多种应急方案，以评估是何种因素阻碍了生物合成的顺利进行。上述方案中已内置了许多故障排查机制。根据我们的经验，至少应在尝试评估所形成天然产物的生物合成之前，首先确认新引入基因簇的基因表达是否成功（通过可溶性生物合成酶的SDS-PAGE分析）。在基因表达完成后，如上所述，采用蛋白质折叠伴侣、增加基因拷贝数以及优化工艺温度等方法，已被证实是最终实现生物合成的有效手段。
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红霉素A的异源生物合成途径 大肠杆菌 包括以下实验步骤：1）基因转移；2）异源重构；以及3）产物分析。每个步骤将结合利用异源宿主生产治疗性天然产物的动机、潜力与挑战进行阐述 E. coli 作为替代宿主。

异源天然产物生物合成的原理、实验步骤及其潜力：以大肠杆菌（E. coli）合成复杂抗生素红霉素A为例

复杂天然产物的异源生产是一种旨在克服当前局限性并拓展未来可能性的方法。它是一种……

异源生物合成是一种通过将基因协调表达，使一种生物的生物合成途径在另一种宿主生物中重现的方法。在本实验中，红霉素A的生物合成途径被转移到大肠杆菌宿主系统中，最终目标是大量生产这种抗生素。首先，从原始细菌宿主中分离出负责红霉素合成的基因簇。随后，将外源遗传物质重新设计为歌剧（opera）格式，以实现整个酶促途径在大肠杆菌（E. coli）中的协调表达。当携带异源红霉素途径的大肠杆菌菌株在培养中复制时，即可产生最终的红霉素化合物。随后可利用芽孢杆菌（Bacillus solus）功能测定法检测该化合物的抗生素活性，这与通过原始生物体生产复杂天然产物的方法不同。通过大肠杆菌进行异源生物合成，为提高工艺速度和工程化潜力提供了机会。这一理念始于大约10到15年前，但直到最近，随着各项技术突破以及我们技术水平的不断提升，才真正实现了利用大肠杆菌成功合成复杂天然产物的多个成功案例。首先设计并订购PCR引物，用于扩增染色体中该基因簇内所有相关基因。在聚合酶链式反应中，使用新制备的基因组DNA作为模板。如果目标基因含有高GC含量，例如天蓝色链霉菌（S. erythri）中的红霉素A基因簇，则在50微升反应体系中加入4微升DMSO。通过测序确认PCR产物的正确性。随后将PCR扩增的基因产物克隆至大肠杆菌表达系统中。在本实验中，我们使用pET-8质粒作为某些基因的表达载体，因为其包含的末端前导序列可促进蛋白的过量表达。接下来，确认功能性蛋白制备物的表达。利用RT-PCR-SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析或便捷的表型检测方法，构建基于各个表达质粒中成功表达基因的实验体系。如果可能，设计兼容的黏性末端限制性内切酶组合，以依次将基因进行转化。在进行开放构建的过程中，我们需要确保所使用的限制性内切酶不会切割目的序列。如果存在切割风险，则需要考虑采用基因合成的方法，将20个红霉素A基因整合到表达质粒中。具体操作需参考随附文稿中详述的各项因素。现在将新设计的生物合成质粒以单独或组合方式转化入大肠杆菌BAP1菌株中，并将细胞涂布于含有多种抗生素的固体LB培养基上，以筛选含有质粒的菌株。我们对大肠杆菌转化使用六种不同的抗生素筛选，这种情况极为罕见，但这是因为在大肠杆菌中实现红霉素A的全合成需要六种质粒。本部分建立了红霉素A完整代谢通路协同作用所需的培养条件。设计Gen BP一是为了提供cin生物合成所需的底物，并在翻译后修饰IDE巨型合成酶。挑取新转化的BAP一的单菌落，接种至三份1.5毫升含相应质粒筛选抗生素的alb培养基中，同时加入100微摩尔IPTG、2毫克/毫升阿拉伯糖以诱导基因表达，以及20毫摩尔丙酸钠。为支持细胞内生物合成前体的形成，将细胞在22摄氏度、250 RPM条件下培养24至48小时。在培养过程中定期取样，以分析质粒稳定性。通过在10,000 RPM条件下离心澄清培养物。移除上清液，并将沉淀物在 4°C 下保存以用于分析。为确认并定量红霉素 A 的生成，将培养物上清液注入液相色谱-质谱（LC-MS）系统。同时运行市售的红霉素 A 标准品样品；对于无市售标准品的情况，该化合物需要通过核磁共振（MR）和高分辨质谱进一步进行化学表征。比较三种制备样品之间的产量，确定产量最高的菌株。从菌落来源制备甘油菌种，并将产量最高的埃里希霉素A生产菌株于-80 °C保存。另取一份大肠杆菌生产培养物，用两倍体积的乙酸乙酯萃取上清液。然后在真空浓缩仪中将萃取物干燥，再将沉淀重悬于100微升甲醇中。随后将萃取物转移至无菌滤膜，并单独晾干。在LB液体培养基中过夜培养B subtilis，取20 µL B subtilis菌液加入20 mL 45 °C的液体LB琼脂中，制备平板。随后，将红霉素A的滤纸片置于含琼脂的固体B solus上，在37 °C条件下培养。本示例中，来自S urethra的红霉素基因簇在大肠杆菌异源宿主产生红霉素A后被转移至大肠杆菌。在天然S ETH三个A染色体中分析该生物活性产物。红霉素基因簇在表达后由总共55 KB的DNA组成，其生成红霉素A需通过一个复杂的生物合成途径，该途径需要细胞内前体物质以及多烯类生物合成和修饰酶的参与，以实现基因转移。首先通过PCR分离各个基因。然后，将红霉素A合成所需的基因分别克隆到表达载体中，以通过SDS-PAGE和表型分析验证蛋白质的表达与活性；此外，还将这些基因整合为操纵子，以便最终将完整代谢通路转移至大肠杆菌。某些基因需要带有PET28表达载体产生的5'端前导序列才能有效表达，而其他基因则不需要。首先通过SDS-PAGE分析各个基因的表达情况。该结果展示了ERME基因对红霉素A抗性的表型评估：在固体培养基中加入红霉素A，用于检测携带含或不含ERME红霉素A抗性基因质粒的大肠杆菌菌株。显然，通过表达ERME可恢复细胞生长。随后将完整的红霉素A合成通路引入大肠杆菌，包括携带groEL分子伴侣的质粒，以及含有uriK额外拷贝的质粒，采用电转化法将这些质粒导入大肠杆菌。随后对最终菌株的质粒稳定性进行评估。LCMS 结果证实并量化了红霉素的产生。其重要的功能通过抗菌生物活性测定得以确认，该测定在敏感细菌的菌线上产生抑菌圈，或在红霉素 A 的系列稀释液中抑制敏感菌的培养生长。通过本视频对天然产物复杂异源生物合成的演示，您现在能够设计、实施并分析完成一种完整异源天然产物所需的各个实验步骤。通过将代谢工程应用于大肠杆菌细胞，优化各种前体物质及引入的代谢通路，您可以最大化目标产物的产量，例如今天我们讨论的红霉素，或其他具有药用价值或难以生产的化合物。

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