Name: 血管内灌注的碳黑色墨水可实现可靠的可视化脑血管 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 16 s
Description: 学习使用碳黑色墨水灌注小鼠脑血管的高对比度可视化方法，通过左心室灌注实现稳定染色，结合ImageJ软件分析前中脑动脉吻合点，为脑卒中研究提供可靠的血管解剖学分析工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢Britta Kaltwasser提供的出色技术协助，以及Mahesh Kumar Teli在视频拍摄准备工作中的组织工作。

1. 动物
<ol>
	<li>实验根据美国国立卫生研究院（NIH）关于实验动物护理和使用的指南进行，并经当地主管部门批准。所有实验均使用C57Bl6/J野生型小鼠、载脂蛋白E-/-（ApoE KO）小鼠和SV129小鼠（12-16周龄，体重26-30 g，每实验组5-6只动物）。</li>
</ol>
2. 使用彩色乳胶对脑血管进行染色
<ol>
	<li>在EP管中将25 μl碳黑墨水（Herlitz，德国）与0.5 ml乳胶化合物（Pebeo，法国）按1:20的比例混合，并在37 °C水浴中预热。在麻醉动物前，将混合物吸入带有28-30G针头的2 ml注射器中。</li>
	<li>将50 mg盐酸罂粟碱粉末溶于1 ml无菌生理盐水中。将溶液吸入胰岛素注射器中。取另一支无菌胰岛素注射器，折断其针头，将该针头连接至一段20 cm长的PE10管末端。然后将此PE10管连接至含有盐酸罂粟碱溶液的胰岛素注射器针头上，以便通过股静脉注射，确保血管扩张及血管充分充盈。</li>
	<li>另准备两支各含1 ml生理盐水的胰岛素注射器。胰岛素注射器可实现液体在精确位置的平稳输送。然而，由于乳胶黏度较高，应使用其他带有可拆卸较宽针头的1 ml注射器。</li>
	<li>将所有注射器及灭菌解剖器械置于手术台附近。在手术区域周围铺上手术巾。手术台应具备充足照明，必要时可使用手术显微镜。</li>
	<li>称量C57Bl6/J小鼠的体重，随后使用70% N2O和30% O2混合气体中含5%气化异氟烷进行麻醉诱导，并以1%气化异氟烷维持麻醉。将小鼠仰卧位固定，四肢固定后评估麻醉深度。切开左侧股静脉上方皮肤，暴露股静脉。插入连接于PE10管的针头尖端，以每分钟100 μl的速度缓慢注射盐酸罂粟碱溶液（剂量为50 mg/kg体重）。</li>
	<li>注射完成后，切开腹腔并穿刺膈肌。剪开肋骨以暴露心脏，注意避免损伤或挫伤心脏。用动脉钳夹闭降主动脉。在右心房处做一锐性切口，使静脉血充分流出。经左心室注入2 ml生理盐水，随后在18-20秒内手动施加轻微压力注入染色乳胶。依次使用预先填充的注射器，避免注入气泡。</li>
	<li>乳胶灌注后，静置动物5分钟。断头处死动物，小心取出完整脑组织。在去除颅骨和脑膜时，注意保护血管结构和皮层不受损伤。将脑组织置于含6-8 ml 4%多聚甲醛的60 mm细胞培养皿中进行拍照。在透明培养皿下方放置刻度尺，使用连接手术显微镜的相机在25倍放大倍数下拍摄脑组织背侧和腹侧表面图像。为准确量化原始距离，拍摄时应确保培养皿与显微镜物镜成90°角。</li>
	<li>在另外4-5只动物中重复上述操作。</li>
</ol>
3. 使用碳黑墨水混合物对脑血管进行染色
<ol>
	<li>为了比较基于乳胶的脑血管染色与本方案的效果，取100 μl Herlitz Stempelfarbe墨水（CB1）与900 μl Pelican Scribtol Schwarz墨水（CB2）在1.5 ml EP管中混合。准备两个EP管，共配制2 ml CB1与CB2按1:9比例混合的溶液。将混合液分别收集到两个独立的胰岛素注射器（每支1 ml）中。盖上注射器帽，并将其置于水浴中加热至37 °C。另取两个胰岛素注射器收集2 ml生理盐水，同样置于水浴中预热。</li>
	<li>麻醉动物，并重复上述操作步骤，但不注射盐酸罂粟碱。在向左心室注射2 ml生理盐水后，改用2 ml碳黑墨水混合液代替彩色乳胶进行灌注。手动注射，每毫升注射施加轻微压力，持续18–20秒。在注射前夹闭降胸主动脉。</li>
	<li>处死动物，取出脑组织并拍照。</li>
	<li>如需长期保存脑组织，将脑置于4%多聚甲醛中固定过夜，随后在蔗糖溶液中孵育，蔗糖浓度逐步升高直至脑组织完全沉降（依次为5%、15%和30%）。经彩色乳胶灌注的动物脑组织也可采用相同方法保存。</li>
	<li>在另外4–5只动物中重复该操作。为比较不同遗传背景或品系对脑血管解剖结构的影响，分别在相同数量的ApoE基因敲除小鼠和SV129小鼠中重复本方案。</li>
	<li>为研究缺血条件下的血管解剖结构，根据标准的血管内闭塞方法，在深度麻醉下诱导短暂性局灶性脑缺血，持续45分钟或90分钟（手术的详细描述不在本文范围内，可参考Doeppner等，2010年的文献）。在预定的再灌注期结束时（1天或5天），仅使用CB1+CB2墨水进行血管染色，并将整个脑组织在37 °C下用2% TTC溶液染色5–10分钟，以确定梗死体积。TTC被线粒体酶（特别是琥珀酸脱氢酶）还原为红色的甲臜。TTC染色后，代谢活跃的组织呈深红色，而梗死组织因线粒体酶功能障碍和变性而不着色，呈现白色。图像采集方法同上所述。</li>
</ol>
4. 脑血管分布区域的研究
<ol>
	<li>为分析脑血管的大体解剖结构，可使用 ImageJ 软件（一种基于 Java 的公共领域图像处理与分析软件）对经彩色乳胶或 CB1+CB2 墨水灌注后的大脑背侧表面图像进行分析。经彩色乳胶灌注的脑组织样本中，背侧表面血管染色程度可能存在变异；而经 CB1+CB2 灌注的样本则可使腹侧和背侧表面的所有血管均被染色。</li>
	<li>使用 ImageJ 软件打开图像文件。识别大脑前动脉（ACA）与大脑中动脉（MCA）之间的所有吻合点。吻合点定义为血管直径最窄的部位，或分别为 ACA 与 MCA 分支最近分支点之间距离的中点。2. 使用绘图分段线工具及插件“Dotted Line”，通过标记吻合点绘制一条假想线（吻合线）。</li>
	<li>将比例尺设为毫米。使用直线绘制工具和“测量”工具，测量脑额极后方4 mm处吻合线与中线之间的距离。同样方法测量额极后方6 mm处的距离。每只动物分析3-4张图像，并计算平均值。比较不同动物组间的数值，以识别脑血管解剖结构的差异。在C57Bl6/J动物中，大脑前动脉（ACA）与大脑中动脉（MCA）之间的吻合线在额极后方4 mm处较6 mm处更靠近中线。ApoE基因敲除小鼠在该指标上无显著差异。相反，在SV129小鼠中，吻合线在额极后方4 mm和6 mm处均位于更远离中线且与中线平行的位置。</li>
	<li>为了分析缺血条件下的血管解剖结构，执行上述相同的计算。将梗死边界识别为红色与白色组织交界处的边缘，分别代表代谢活跃的组织和未染色的坏死组织。在距脑额极尾侧4 mm和6 mm处，测量梗死边界至中线的距离。每只动物采集3-4张图像的平均值。比较不同缺血及再灌注时间段之间的结果。</li>
</ol>

<ol><li>Meng, H., Peng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+contrast+angiography%3A+A+simple+method+for+morphological+characterization+of+cerebral+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Nuclear contrast angiography: A simple method for morphological characterization of cerebral arteries.</a> Brain Research. 1261, 75-81 (2009).</li>
<li>Maeda, K., Hata, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+cerebrovascular+anatomy+of+C57black%2F6+and+SV129+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Differences in the cerebrovascular anatomy of C57black/6 and SV129 mice.</a> Neuroreport. 9 (7), 1317-1319 (1998).</li>
<li>Coyle, P., Jokelainen, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+cerebral+arterial+collaterals+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Dorsal cerebral arterial collaterals of the rat.</a> The Anatomical Record. 203, 397-404 (1982).</li>
<li>Coyle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+cerebral+collaterals+of+stroke-prone+spontaneously+hypertensive+rats+%28SHRSP%29+and+Wistar+Kyoto+rats+%28WKY%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Dorsal cerebral collaterals of stroke-prone spontaneously hypertensive rats (SHRSP) and Wistar Kyoto rats (WKY).</a> The Anatomical Record. 218, 40-44 (1987).</li>
<li>Hasan, M. R., Herz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+macroscopic+cerebral+vessel+anatomy%E2%80%94A+new+and+reliable+technique+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Visualization of macroscopic cerebral vessel anatomy—A new and reliable technique in mice.</a> Journal of Neuroscience Methods. 204, 249-253 (2012).</li>
<li>Doeppner, T. R., Nagel, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TAT-Hsp70-mediated+neuroprotection+and+increased+survival+of+neuronal+precursor+cells+after+focal+cerebral+ischemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">TAT-Hsp70-mediated neuroprotection and increased survival of neuronal precursor cells after focal cerebral ischemia in mice.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 29, 1187-1196 (2009).</li>
<li>Todo, K., Kitagawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte-macrophage+colony-stimulating+factor+enhances+leptomeningeal+collateral+growth+induced+by+common+carotid+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor enhances leptomeningeal collateral growth induced by common carotid artery occlusion.</a> Stroke. 39 (6), 1875-1882 (2008).</li>
<li>Sugiyama, Y., Yagita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granulocyte+colony-stimulating+factor+enhances+arteriogenesis+and+ameliorates+cerebral+damage+in+a+mouse+model+of+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Granulocyte colony-stimulating factor enhances arteriogenesis and ameliorates cerebral damage in a mouse model of ischemic stroke.</a> Stroke. 42 (3), 770-775 (2011).</li>
<li>Busch, H. J., Buschmann, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arteriogenesis+in+hypoperfused+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Arteriogenesis in hypoperfused rat brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 23 (5), 621-628 (2003).</li>
<li>Maeda, K., Hata, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+metabolic+disturbances+and+cerebrovascular+anatomy+after+permanent+middle+cerebral+artery+occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22in+C57black%2F6+and+SV129+mice.+Neurobiology+of+Diseases%22%5BJournal%5D)">Regional metabolic disturbances and cerebrovascular anatomy after permanent middle cerebral artery occlusion.</a> in C57black/6 and SV129 mice. Neurobiology of Diseases. 6, 101-108 (1999).</li>
<li>Wang, Y., Kilic, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+overexpression+induces+post-ischaemic+neuroprotection%2C+but+facilitates+haemodynamic+steal+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">VEGF overexpression induces post-ischaemic neuroprotection, but facilitates haemodynamic steal phenomena.</a> Brain. 128 (1), 52-63 (2005).</li>
<li>ElAli, A., Doeppner, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+blood-brain+barrier+permeability+and+brain+edema+after+focal+cerebral+ischemia+induced+by+hyperlipidemia%3A+Role+of+lipid+peroxidation+and+calpain+1%2F2%2C+matrix+metalloproteinase-2%2F9%2C+and+RhoA+overoxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Increased blood-brain barrier permeability and brain edema after focal cerebral ischemia induced by hyperlipidemia: Role of lipid peroxidation and calpain 1/2, matrix metalloproteinase-2/9, and RhoA overoxidation.</a> Stroke. 42, (2011).</li>
<li>Coyle, P., Jokelainen, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+outcome+to+middle+cerebral+artery+occlusion+in+spontaneously+hypertensive+stroke-prone+rats+%28SHRSP%29+and+Wistar+Kyoto+%28WKY%29+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Differential outcome to middle cerebral artery occlusion in spontaneously hypertensive stroke-prone rats (SHRSP) and Wistar Kyoto (WKY) rats.</a> Stroke. 14, 605-611 (1983).</li>
<li>Coyle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diameter+and+length+changes+in+cerebral+collaterals+after+middle+cerebral+artery+occlusion+in+the+young+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Anatomical+Record%22%5BJournal%5D)">Diameter and length changes in cerebral collaterals after middle cerebral artery occlusion in the young rat.</a> The Anatomical Record. 210 (2), 357-364 (1984).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

通过手动注射进行CB1+CB2的灌注无需 intensive 培训即可成功完成，因为该方法不涉及任何需要施加特定压力的专用设备2,3。在我们的方案中，灌注结果的异质性也可忽略不计。在16只非缺血动物中仅有1只、20只缺血动物中有3只出现灌注不完全。这些情况下，最可能的原因是在生理盐水灌注过程中引入气泡，导致血管阻塞，从而造成灌注失败。
尽管最初通过升主动脉灌注乳胶2,3，但也有报道采用其他灌注途径，包括左心室7,8或颈总动脉9。我们发现通过升主动脉或左心室进行灌注后，结果之间无显著差异（未发表观察）。因此，由于左心室更易于接近，故选择该途径。
在选择本研究中提及的特定碳素墨水之前，我们已评估了多种市售碳素墨水在血管内灌注中的效果。CB1 和 CB2 因其灌注效率和染色稳定性而被选用。CB1 黏度极低（1.1 mPa·s），含 2.1% 碳黑；CB2 原为书法墨水，含 2.5% 碳黑，黏度较高（10–50 mPa/s）。单独使用这两种墨水...

<table><tbody><tr><td>斯克里布托尔 黑色（CB2）</td><td>Pelican，德国</td><td>221 135</td><td></td></tr><tr><td>印台墨水（CB1）</td><td>Herlitz PBS AG，德国</td><td>10417202</td><td></td></tr><tr><td>格德奥 乳胶颜料</td><td>Pebeo，法国</td><td>13042B</td><td></td></tr></tbody></table>

血管内灌注碳素墨水可实现脑血管的可靠可视化

Intravascular Perfusion of Carbon Black Ink Allows Reliable Visualization of Cerebral Vessels

脑血管的解剖结构是决定脑血流动力学以及缺血性损伤后损伤严重程度的关键因素。脑血管会动态响应多种病理生理状态，并且在不同品系以及遗传操作条件下表现出显著差异。因此，一种可靠的颅内血管染色技术对于研究缺血性脑卒中的发病机制至关重要。迄今为止，已有多种技术被用于可视化脑血管系统，包括注射低黏度树脂、Araldite F、混有不同染料1（例如胭脂红、印度墨汁）或含2或不含3炭黑的乳胶。通过升主动脉灌注白色乳胶化合物的方法最早由Coyle和Jokelainen3报道。Maeda 等2对这一方案进行了改进，通过在乳胶中添加炭黑墨汁，以提高脑组织经生理盐水灌注后血管的对比度和可视性。然而，由于乳胶化合物黏度过高，常出现灌注效率低下和血管填充不充分的问题4。因此，我们描述了一种简单且经济有效的技术，使用两种市售炭黑墨水（CB1和CB2）的混合物，以可重复的方式显示脑血管结构5。我们已证明，在小鼠中使用CB1+CB2进行灌注，相较于乳胶灌注，能够更密集地染色更细小的脑血管5。在此，我们介绍我们的实验方案，用于识别前 cerebral 动脉（ACA）与中 cerebral 动脉（MCA）之间的吻合点，以研究不同遗传背景小鼠的血管变异情况。最后，我们通过将CB1+CB2介导的血管染色与TTC染色相结合，在小鼠短暂性局灶性脑缺血模型中验证了该技术在不同程度缺血损伤下的可行性。

本文所述方案克服了传统基于乳胶的啮齿类动物脑血管可视化技术的局限性。图1A显示，在灌注彩色乳胶后，仅脑腹侧表面的大血管被染色，而整个背侧表面均未着色，且结果重复性差。在六只动物中，仅有一只显示出大脑背侧表面的前脑动脉（ACA）和中脑动脉（MCA）部分染色（数据未显示）。相反，CB1+CB2灌注可均匀且充分地填充大小血管（图1B），染色效果在7天内保持稳定，质量无任何变化。我们使用ImageJ程序定量分析了野生型C57Bl6/J小鼠前脑动脉（ACA）与中脑动脉（MCA）吻合点距中线的距离（图1C），并将其与ApoE基因敲除（KO）小鼠进行比较，以观察基因修饰是否影响局部脑血管解剖结构（图1D）。尽管ApoE基因敲除未影响C57Bl6/J小鼠脑血管的解剖结构，但在C57bl/6J与SV129品系之间观察到显著差异（图1E, F）。因此，我们证实了该染色方案可用于评估因基因或品系差异导致的小鼠脑血管解剖结构差异。
在实验...

啮齿类动物脑血管解剖结构的分析在实验性脑卒中研究中具有重要作用。在此领域，血管内灌注彩色乳胶多年来被视为一种标准技术。然而，该技术存在明显的技术局限性，影响其可重复性。本文介绍一种简单且可重复的方法，用于可视化脑血管。通过左心室注射两种市售碳黑墨水的混合物，可实现脑血管的良好充填，并获得高对比度的显影效果。我们已成功应用该技术识别了不同遗传背景小鼠脑血管区域之间的吻合点。最后，我们证实这种新颖且简便的血管染色方法可与三苯基四氮唑氯化物（TTC）染色相结合——后者是观察和分析小鼠脑梗死体积的常用工具。

脑血管的解剖结构是决定脑血流动力学以及缺血性损伤后损伤严重程度的关键因素。

本实验的总体目标是以可重复的方式研究小鼠的脑血管解剖结构。首先，使用彩色乳胶对脑血管进行染色，以便后续与炭黑墨水染色进行比较。接着，混合炭黑墨水，并通过左心室对动物灌注磷酸盐缓冲液-多聚甲醛（P-B-S-P-F-A）和炭黑墨水混合物。在最后一步中，收集脑组织并拍摄照片，用于对染色的脑血管进行比较和分析。最终，使用 ImageJ 软件分析大脑中动脉与前动脉之间的吻合点。该技术的应用意义在于脑血管疾病（特别是中风）的治疗，因为它可用于分析血管密度和血管生成。该方法不仅可为脑部血管系统提供深入见解，还可应用于其他系统，例如用于心脏、肝脏或肾脏中微血管的可视化。将乳胶与炭黑墨水在EP管中混合后，置于37摄氏度水浴中加热混合物。使用23至25号针头将加热后的乳胶吸入一支2毫升注射器中。然后将12.5毫克盐酸帕潘立酶粉末溶解于1毫升无菌生理盐水中，涡旋混匀后，将所得溶液收集至一支胰岛素注射器中。接着，取另一支无菌胰岛素注射器，折断其针头，并将分离出的针头连接至一根20厘米长的PE 10管末端。然后将该PE 10管连接至含有盐酸帕潘立酶溶液的胰岛素注射器针头上。现在用生理盐水再填充两支胰岛素注射器，每支一毫升，然后将所有注射器连同已灭菌的解剖器械一起带到手术台，准备麻醉。称量小鼠体重，然后将持续麻醉的小鼠仰卧位固定，固定四肢，并剪开左侧股静脉上方的皮肤。现在找到股静脉，插入连接PE 10导管的针头末端。然后以每分钟约100 µL的速度缓慢注射盐酸帕平溶液，剂量为每千克体重50 mg。注射后，切开腹腔，随后刺穿膈肌。然后剪开肋骨以暴露心脏，并用动脉钳夹闭降胸主动脉。接着，在右心房上方做一锐性切口以引流静脉血。随后向左心室注入2 mL生理盐水。Profil 溶液或混合墨水溶液中存在空气可能导致脑组织血管区域染色不全。为确保实验成功，请仔细检查所有注射器，确保其中完全无气泡。现在，请依次缓慢推注预装注射器中的内容物，手动注射彩色乳胶，持续 18 至 20 秒，随后将动物静置 5 分钟。然后，在处死动物后，去除颅骨和脑膜，注意不要损伤皮层或血管结构，再小心完整取出全脑。将脑组织置于一个含有6至8毫升4%多聚甲醛（PFA）的60毫米细胞培养皿中，然后将一把刻度尺置于培养皿下方，并使用连接在手术显微镜上的相机拍摄。在显微镜物镜与培养皿成90度角的条件下，以25倍放大倍数拍摄脑组织背侧和腹侧表面的照片。为了量化原始距离，首先进行碳素墨水染色步骤：在两个独立的 1.5 毫升 EP 管中，分别将两份 100 微升的 herts stemple farba 墨水或 CB one 与两份 900 微升的 pelican scribal schwartz 墨水或 CB two 混合。将混合后的墨水分别收集到两个独立的 1 毫升胰岛素注射器中。然后盖上注射器帽，并将其与另外两个各含有 1 毫升生理盐水的胰岛素注射器一同放入 37 摄氏度的水浴中。按照上述方法处理小鼠后，以每毫升18至20秒的速度，用轻微压力将碳素墨水溶液注入左心室。按照上述方法取出脑组织并拍照后，将脑组织置于4% PFA中过夜固定，随后在蔗糖溶液中进行梯度孵育，浓度逐渐增加，直至脑组织完全沉入溶液底部。本步骤首先诱导短暂性局灶性脑缺血。根据大脑中动脉管腔内阻塞的标准操作流程，在再灌注期结束时，使用刚刚演示的CB one和CB two墨水对血管系统进行染色，然后将整个脑组织在37摄氏度下用2%TTC溶液染色5至10分钟。为确定梗死体积，梗死区域将保持白色，而非缺血区域则变为红色。按照刚刚演示的方法采集图像，以分析脑血管的大体解剖结构，首先打开脑组织染色面的图像。使用 ImageJ 软件，经有色乳胶灌注的大脑可能显示位于腹侧表面的血管染色程度不一。而 CB1 与 CB2 灌注可使腹侧和背侧表面的所有血管均被染色。以毫米为单位设定比例尺，标记大脑前动脉（aCA）与大脑中动脉（MCA）之间的吻合点，绘制一条连接所有这些吻合点的假想线。现在，测量吻合线与脑前极中线之间在4毫米和6毫米处的距离。每只动物分析三到四张图像后，计算平均值。比较不同动物组之间的数值，以识别脑血管解剖结构的差异。在C57黑鼠（C57 black six J）中，从额极向尾侧测量时，大脑前动脉（ACA）与大脑中动脉（MCA）之间的吻合线在距额极4毫米处比在6毫米处更靠近中线；而载脂蛋白E基因敲除小鼠（APO lipoprotein e knockout mice）在该方面无显著差异。相比之下，SV129小鼠的吻合线在距额极4毫米和6毫米处均更远离中线，且走向更接近与中线平行，可用于血管解剖结构的分析。在缺血条件下，梗死边界可识别为红色与白色组织交界处，分别代表代谢活跃的组织与坏死组织；应测量该梗死边界在距额极4毫米及6毫米处与中线之间的距离。本文所述方案克服了传统基于乳胶的啮齿类动物脑血管可视化技术的局限性。如第一幅图像所示，在灌注彩色乳胶后，仅有腹侧表面的大血管被染色，而整个背侧表面则未被染色。相反，CB1与CB2的灌注则能够均匀且充分地填充大小血管。染色结果在七天内保持稳定，质量无任何变化。利用 Image J 程序，可分析经墨汁灌注以评估不同小鼠组别脑区血管解剖差异的 A CA 与 MCA 吻合点距中线的距离。尽管在 C 57 black six J 小鼠中敲除 POE 不影响脑血管的解剖结构，但在 C 57 black six J 与 SV 1 29 品系之间仍可观察到显著差异。在实验性啮齿类动物卒中模型中，TTC染色被广泛用于梗死体积的可视化。CB one plus CCB two染色在缺血条件下也可用于观察血管结构的变化，并且与TTC染色联合使用时表现出高稳定性。请注意，在不同持续时间的脑缺血及再灌注时间点所诱导的缺血性脑组织中，可同时实现脑血管和梗死体积的可视化。在缺血45分钟或90分钟后，分别匹配1天或5天的再灌注时间，对前脑动脉（a c）与大脑中动脉（MCA）吻合点进行分析，结果如预期所示，各组间中线与吻合点之间的平均距离差异无统计学意义。此外，该平均距离与非缺血动物的范围相同。然而，中线至梗死边界的距离在各组之间存在显著差异，反映出随着缺血再灌注损伤程度的增加，梗死体积相应增大。该技术有望为实验性中风领域的研究人员探索小鼠大脑的血管分布区域提供新的途径。观看本视频后，您应能够充分掌握如何通过灌注乳胶或碳素墨水来研究小鼠脑部的脑血管解剖结构，以及如何借助 Image J 软件分析染色后的脑组织样本。

intravascular-perfusion-carbon-black-ink-allows-reliable

Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

血管内灌注的碳黑色墨水可实现可靠的可视化脑血管

采用活体显微技术追踪软脑膜微循环中血流动力学和炎症事件的时间与空间变化。...

使用封闭式颅窗对小鼠脑微循环进行活体显微成像

本文介绍一种简单且实用的脑血管铸型技术，操作简便，可用于成年小鼠脑部血管树的成像。...

成年小鼠脑血管铸型用于三维成像与形态学分析

做颈部切口以暴露双侧颈总动脉，并进行松扎。...

利用荧光示踪剂在小鼠中可视化缺血期间的脑血流

来源：Kim, D. E., et al. 联合近红外荧光成像与显微计算机断层扫描直接可视化脑血栓栓塞。 J. Vis. Exp.

利用近红外荧光成像技术观察小鼠脑血栓

本方案描述了联合近红外荧光（NIRF）成像与微型计算机断层扫描（microCT）技术用于可视化脑血栓栓塞的应用。该技术可实现对血栓负荷及其演变过程的定量分析。NIRF成像技术可用于观察离体脑组织中荧光标记的血栓，而microCT技术则利用金纳米颗粒在活体动物体内实现血栓的可视化。...

结合近红外荧光成像与显微计算机断层扫描直接可视化脑血栓栓塞

本文描述了一种在淀粉样斑块积聚过程中追踪脑血管重塑的方法 体内...

纵向的 体内 脑血管成像：与中枢神经系统疾病的相关性

我们介绍了一种使用两种不同荧光染料的体内成像方法，用于追踪成年Sprague-Dawley大鼠脊髓挫伤后脊髓血管的动态变化。...

体内实验 双色成像法用于挫伤性脊髓损伤后血管动态的观察

本文介绍了一种通过将DiI溶于固定液后进行心脏灌注，以快速标记辐鳍鱼类血管的实验方案，以青鳉（Oryzias...

使用DiI-固定剂心脏灌注标记硬骨鱼脑和垂体中的血管

本方案介绍了在麻醉小鼠中获取和分析脑包被周细胞的荧光钙成像以及邻近血管血流数据的步骤。这些技术可用于壁细胞生理学研究，并可调整用于研究任何细胞类型的钙瞬变。...

转基因小鼠脑周细胞钙成像与血流动力学成像 体内

初步研究证实，蛛网膜下腔出血（SAH）可导致脑周细胞死亡。评估SAH后周细胞的收缩功能需区分存活与非存活的脑周细胞。因此，已建立一种可在脑组织切片中同时标记存活与非存活脑周细胞的方法，便于利用高分辨率共聚焦显微镜进行观察。...

脑出血后脑切片中脑周细胞活力成像

成对小脑延髓池纳米注射与激光散斑血流成像联合检测法研究脑血流调节 在体 内

学习使用碳黑色墨水灌注小鼠脑血管的高对比度可视化方法，通过左心室灌注实现稳定染色，结合ImageJ软件分析前中脑动脉吻合点，为脑卒中研究提供可靠的血管解剖学分析工具。

血管内灌注碳素墨水可实现脑血管的可靠可视化

探索更多视频