用气相色谱 - 多单元的录音（GCMR）昆虫触角叶嗅觉挥发物的鉴定
2013年2月24日
嗅觉介导许多不同的昆虫的行为，并经常由数十至数百种挥发性化合物组成的复杂混合物。气相色谱法与多通道记录在昆虫触角叶中，我们描述的生物活性化合物的鉴定方法。
该程序的总体目标是通过大黄蜂大脑中的记录来识别复杂意义上的生物有效气味剂。这是通过首先收集行为效应感，然后为实验准备气相色谱仪和多通道记录系统来实现的。第三步是准备和解剖熊蜂大脑，用于工厂叶天线中的神经记录。
然后通过将电极插入天线瓣并通过分析响应复杂感觉及其单个成分的神经活动来测量对膨化挥发物的响应来进行实验。可以鉴定通过气相色谱法获得的生物活性气味剂。因此，相对于 G-C-E-A-G 等其他技术，该技术的主要优势是天线负载神经元的灵敏度以及表征大脑中神经元如何响应特定花挥发物的能力。
这种方法的视觉演示至关重要，因为由于电生理制备记录技术和收集顶空挥发物的必要步骤，电生理学和化学分析的组合步骤很难学习。虽然这项技术可以提供对熊蜂嗅觉加工的见解，但它也可以应用于其他系统，例如蚊子或接吻虫等疾病因素，或蚜虫或飞蛾等农作物害虫。对于此过程，在第二个微型纵器上准备了一个由钨丝制成的参比电极。
微型纵器具有多通道电极，例如盘绕线、电线或连接到前置放大器的硅多通道电极，其输出位于屏蔽 BNC 台上。GCs 检测器的输出与放大器和数据采集系统连接，以便神经信号和 GC 信号同步。在本例中，GC 载气是氦气，位于 DB 5 GC 色谱柱中。
气相色谱仪使用分离列表进样口，温度设置为 200 摄氏度，火焰离子化检测器温度设置为 230 摄氏度。样品在 gc 中加热后，使用玻璃 Y 型连接器在火焰离子化检测器和 B 天线之间将色谱柱的流出物一一分成。在本例中，GC 用于输送通过动态吸收从 Mimus Lewis 眼花（一种原产于加利福尼亚的高山野花）收集的挥发物。
或者，可以通过空气脉冲递送单个挥发性化合物或化合物混合物，而不是使用 GC。通过一个单独的玻璃注射器喷射，该注射器包含一张沉积了化合物的滤纸。空气脉冲使用由计算机控制的电磁激活阀从恒定气流中转移。
从一毫升移液器吸头的末端切下约 1 厘米开始准备。将大黄蜂放入移液器吸头的底部，轻轻地将其推向吸头的另一端，直到只露出头部。使用融化的牙蜡，在裸露的头部周围制作模具。
蜡必须粘附在复眼上才能完全固定头部，但如有必要，它不得接触天线。使用小针固定天线。接下来，使用微型手术刀等锋利的刀片在头囊中做一个方形窗口状的切口。
直接在天线后面和其中一个复眼附近开始切割。在眼睛之间剪一条直线。接下来，向背侧切割，直到头囊向胸部弯曲。
继续切割到头胶囊的另一端。最后切回起点以完成正方形。用镊子去除角质层。
必须去除与天线相邻的角质层，否则一旦大脑暴露，它就会阻碍电极。立即用昆虫盐水将组织超级融合。确保天线瓣暴露在外。
然后小心地使用一对非常细的镊子去除紧邻触角叶上方的神经周围鞘。要非常小心，不要用镊子刺穿蜜蜂的大脑。蜜蜂制剂现在已准备好进行电生理记录。
首先将准备好的蜜蜂连接到固定在磁性底座上的夹子上。将其与带有流量控制器的水库输送的昆虫盐水超级融合。现在将参比电极插入对侧脑组织。
接下来，将多通道电极插入蜜蜂的天线瓣。当电极就位时。等待 30 到 60 分钟，让录音稳定下来。
在此期间，通过阈值化来准备神经元的细胞外尖峰。单个录制通道由于录制通道中存在噪声，某些通道可能需要手动阈值。接下来，验证 GC 运行的温度斜坡是否正确。
在此示例中，温度从 50 摄氏度开始 4 分钟，然后每分钟增加 10 度，最终温度为 220 摄氏度，或者保持 6 分钟。当记录通道中单元的波形形状变得一致时，神经记录被认为是稳定的。稳定后，将花香顶空气味加载到注射器中，并将气味注入 gc 的头部进样口。
然后在 GC 运行完成后立即开始从电极进行记录。让准备工作静置 5 到 15 分钟。然后将另一个样品注入 GC 中，或使用单一挥发性化合物或化合物混合物刺激制备。
如果在任何时候自发活动突然停止或改变，请检查生理盐水滴注，让制剂静置 15 分钟。然后，如果活动没有恢复到之前的水平，则丢弃准备工作。实验结束后，用探针仍在组织中固定大脑，然后切除大脑，清除固定剂并使大脑脱水。
然后可以通过共聚焦显微镜从 mimus Luci 花香中识别记录通道的位置。挥发物的总数正在掠夺。GC 通常在 60 到 70 种化合物之间。
Mimus Luci 的香味主要由单萜类化合物组成，包括 β 肌球蛋白和 α 松氨酸。香味的其余部分由六种碳挥发物组成。用 3 微升 Mimus Lewis 眼部提取物刺激几种制剂。
来自多通道电极记录的八个神经单元之一的记录显示了神经元与特定挥发物的选择性竞争。在此示例中，dine 是所示的化合物。以下是 8 个神经单元的响应。
大约一半的合奏没有反应。考虑到花顶空暗示的挥发性化合物的多样性，这是令人惊讶的，但这在制剂之间是一致的，并且其他研究也报告了这一点。响应单元的归一化燃烧速率表明，对一组加臭剂具有很强的选择性。
箭头突出显示的气味引起了最强烈的反应。这些是排雷和反式 beta osain。因此，在观看此视频后，您应该对如何为昆虫进行实验做好准备，然后使用具有多通道记录的气相色谱法进行实验有一个很好的了解。
然后，目标是在复杂的花束中识别假定的行为有效的气味剂。一旦掌握，如果作正确，可以在两到三个小时内完成此技术。可以进行其他方法，例如使用已识别的气味剂进行行为测试，以充分确定挥发物在介导昆虫行为反应方面的功效。
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概述
本研究专注于通过记录蜜蜂大脑中的数据来识别昆虫中的生物有效气味物质。该方法包括收集具有行为相关性的气味，并分析这些复杂混合物的神经反应。
主要研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 行为生物学
- 嗅觉研究
背景
- 昆虫利用嗅觉线索进行各种行为。
- 嗅觉线索通常是挥发性化合物的复杂混合物。
- 理解这些线索可以提供对昆虫行为的洞察。
- 气相色谱是分析这些化合物的关键技术。
研究目的
- 识别复杂气味中的生物活性气味物质。
- 测量对特定花卉挥发物的神经活动反应。
- 增强对昆虫如何处理嗅觉信息的理解。
使用的方法
- 收集具有行为效果的气味。
- 准备气相色谱仪和多通道记录系统。
- 进行蜜蜂大脑解剖以进行神经记录。
- 在触角小叶中插入电极以测量反应。
主要结果
- 通过气相色谱鉴定出生物活性气味物质。
- 展示触角小叶神经元的敏感性。
- 对复杂气味的神经反应进行表征。
- 比较这种技术与其他方法，突出其优势。
结论
- 该方法有效地识别出影响昆虫行为的气味物质。
- 神经记录为嗅觉处理提供了宝贵的洞察。
- 这种方法可以应用于进一步的嗅觉研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Identifying bioactive volatiles that drive insect behavior is critical for agricultural biotechnology and vector control programs. The GCMR technique enables high-sensitivity detection of behaviorally active compounds by linking chemical analysis with neural responses in the insect brain. This supports target validation and assay development for pest management and pollinator attraction strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by identifying volatiles that elicit significant neural responses in the antennal lobe.
- Operational Value: Provides biological de-risking through functional validation of odorant activity in a disease-relevant system.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing behaviorally active compounds from inactive constituents in complex mixtures.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems (bumblebee antennal lobe) for downstream screening of volatile libraries.
- Quantitative Outputs: Delivers measurable neural activity readouts that enable compound comparison and hit selection.
- Platform Reuse: Supports scalability across insect models including disease vectors and crop pests.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Applicable to identification of attractants or repellents for vector insects such as mosquitoes and kissing bugs.
- Translational Continuity: Bridges discovery through neural response confirmation to preclinical evaluation of volatile efficacy.
- Mechanistic De-risking: Clarifies how specific volatiles are processed in the olfactory center, reducing ambiguity in behavioral outcome prediction.
Pipeline & Workflow Integration
The GCMR method fits within the discovery continuum from early target identification to lead optimization, particularly for behavior-modulating compounds in agricultural and public health applications.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by linking volatile exposure to neural activation patterns in the antennal lobe.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility through synchronized GC and multi-channel neural recording.
- Analytics: Provides spike sorting and thresholding outputs that allow quantification of unit-specific responses to individual volatiles.
- Translational Research: Connects neural response data to behavioral relevance in pollination, herbivory, and disease transmission contexts.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for screening volatile libraries across multiple insect species and ecological contexts.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by detecting responses at the level of convergent neural processing.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized brain preparation, saline perfusion, and electrode stabilization protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by prioritizing volatiles with robust neural responses, reducing investment in inactive compounds.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of lead volatiles based on neural efficacy and behavioral correlation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in insect dissection, electrophysiology, and gas chromatography synchronization.
- Dependent on multi-channel electrode systems, pre-amplifiers, and data acquisition capable of simultaneous GC and neural signal capture.
- Necessitates cross-team standardization for electrode placement, thresholding, and odor delivery consistency.
- Adaptation across model systems may require adjustments in brain exposure techniques and saline composition.
- Practical limitations include preparation stability duration and susceptibility to spontaneous activity loss during prolonged experiments.
