Name: 一个高含量的成像流程研究Grb2的信号复合体的表达克隆 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: 学习利用高内涵成像技术结合cDNA表达克隆筛选Grb2蛋白相互作用伙伴的方法。该流程通过GFP标记和自动化转染在HEK293细胞中可视化Grb2的亚细胞定位变化，适用于信号转导和蛋白质相互作用研究。

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这项工作由医学研究理事会和玛丽·居里国际回归资助计划（授予 JKV）资助。

1. 筛选cDNA表达克隆
<ol>
 <li>将cDNA文库以96孔板格式的甘油菌种形式提供，每个孔含有单个细菌克隆。使用Norgen CP7200点样仪菜单中的“重排”（Rearray）命令，从源板中挑取细菌克隆，并接种至含有1.5 ml LB/氨苄青霉素的96深孔（每孔1 ml）板中。</li>
 <li>用透气密封膜密封深孔板，于37 °C摇床中过夜培养。</li>
</ol>
2. cDNA表达文库的制备
<ol>
 <li>使用台式离心机配合深孔板适配器，以 2,000 rpm 转速离心含有细菌的深孔板 20 分钟。</li>
 <li>吸除孔中的培养基，保留完整的细菌沉淀。</li>
 <li>按照 图 2 所示配置实验室自动化工作站的反应台。将质粒提取所需的溶液分别加入槽 1-5 中，并将深孔板放置在反应台上。在深孔板旁边放置含有洗脱液的多孔槽。将移液枪头装入枪头架中。</li>
 <li>组装真空装置。将质粒结合板放入真空装置内，质粒滤板置于装置顶部。</li>
 <li>用 250 μl 溶液 1（重悬缓冲液）通过反复吹打重悬沉淀。</li>
 <li>加入 250 μl 溶液 2（裂解缓冲液）以裂解细菌。密封深孔板并倒置，使溶液充分混合。</li>
 <li>启动 2 分钟计时器。</li>
 <li>加入 350 μl 溶液 3（中和缓冲液）。密封深孔板并倒置 3 次。</li>
 <li>将细菌裂解液转移至质粒滤板中。</li>
 <li>施加真空 5 分钟。</li>
 <li>移除滤板，将结合板置于真空装置顶部。施加真空 1 分钟。</li>
 <li>加入 500 μl 附加洗涤（AW）缓冲液。</li>
 <li>施加真空 2 分钟。</li>
 <li>加入 900 μl 洗涤缓冲液溶液 4。施加真空 2 分钟。</li>
 <li>重复步骤 2.14。额外施加真空 15 分钟。</li>
 <li>将 DNA 收集板放入真空装置内。向结合板中加入 100 μl 洗脱缓冲液，孵育 2 分钟。</li>
 <li>施加真空 10 分钟。</li>
 <li>取出收集板，使用 Nanodrop 8000 测定 DNA 浓度。通常该方法可获得约 100 ng/μl 的 DNA 产量。</li>
</ol>
3. 细胞接种
<ol>
 <li>将HEK293细胞进行胰酶消化并计数。</li>
 <li>使用ThermoFisher 96孔多通道移液器，将2 × 104个细胞分配至PerkinElmer Viewplate的每孔中。</li>
 <li>细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育过夜。</li>
</ol>
4. 转染
<ol>
 <li>在圆底96孔板中，每孔用25 μl无血清培养基制备含有100 ng GFP-Grb2质粒DNA和100 ng cDNA的混合物。</li>
 <li>每孔加入含有0.5 μl Transfectin的25 μl无血清培养基。</li>
 <li>混匀后开始计时，孵育30分钟。</li>
 <li>使用轻柔的加样方法将50 μl cDNA/Transfectin混合物转移至细胞中。或者，可先将转染混合物加入孔板，再将细胞加至其上层（反向转染）。</li>
 <li>将细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育过夜。</li>
</ol>
5. 图像采集
<ol>
 <li>启动 Opera 软件。实验设置的屏幕截图如图3所示。选择“配置”选项卡，并选择 20x 物镜和正确的板类型。确保物镜上的“collar”设置为正确值，以便针对不同类型的板进行聚焦。</li>
 <li>选择“显微镜”选项卡。将曝光1定义为 FITC（488 激光），曝光2定义为 UV（365 激光）。在两次曝光中均启用 UV 滤光片，并将曝光1分配给相机1，曝光2分配给相机2。将曝光时间设置为曝光1 800 msec，曝光2 40 msec。</li>
 <li>选择“显微镜”选项卡。将曝光1定义为 FITC（488 激光），曝光2定义为 UV（365 激光）。在两次曝光中均启用 UV 滤光片，并将曝光1分配给相机1，曝光2分配给相机2。将曝光时间设置为曝光1 800 msec，曝光2 40 msec。</li>
 <li>选择曝光1。将聚焦高度设为 0 μm。选择“聚焦”。聚焦完成后，对相机1进行曝光。调整聚焦高度以优化曝光平面，然后点击“采集高度”。调整曝光时间和激光功率，使最大像素强度约为 3,000。保存曝光参数。对曝光2重复此操作。</li>
 <li>选择“实验定义”选项卡。创建布局和子布局。拖放相关布局、曝光、参考图像、skewcrop 文件和子布局。保存实验。</li>
 <li>选择“自动实验”选项卡并采集图像。</li>
</ol>
6. 图像分析（基于 ImageJ 1.46h 版本）
<ol>
 <li>使用 Flex2Volocity Acapella 脚本将 PerkinElmer 专有的 .flex 文件转换为标记图像格式 .tif 文件。</li>
 <li>
 <ol>
 <li>在 ImageJ 中以图像序列形式导入图像，生成图像堆栈。</li>
 <li>通过选择 Image/Hyperstack/Stack to Hyperstack 菜单项，将堆栈转换为双通道超堆栈，切片数量应设置为导入堆栈的一半。</li>
 <li>使用 Image/Duplicate 命令复制 GFP 通道：勾选“Duplicate hyperstack”复选框，并指定 Channels: 1-1。后续操作使用此复制的堆栈。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>选择 Process/Enhance Contrast，设置饱和像素为 0.01%，使用堆栈直方图，并通过 Image/Type/8-bit 将图像转换为 8 位。</li>
 <li>使用 Bernsen 算法进行局部自适应分割，设置半径为 15 像素，对比度阈值（参数 1）q = 30。在 Image/Adjust/Auto Local Threshold 菜单中勾选“White objects on black background”选项。</li>
 <li>分割质量控制：在原始图像上生成分割对象的轮廓叠加图。</li>
 <li>通过粒子分析进行特征提取：测量每个细胞器的面积、平均强度和总强度。保存结果文件。</li>
 <li>在 R 中打开特征结果文件，并生成直方图。</li>
</ol>
7. 代表性结果
在正常条件下，Grb2 分布于整个细胞中。当生长因子受体受到刺激后，Grb2 会转位至质膜，并随后被内化至内体中，如图4所示。表达一种能够结合 Grb2 的细胞表面受体，足以诱导这种转位过程。在典型的筛选实验中，GFP-Grb2 的定位不会发生改变。然而，当表达一种能将 Grb2 招募至特定亚细胞位点的蛋白时，其定位会发生变化，可通过荧光显微镜轻松观察到。例如，EGFR 的表达会导致 GFP-Grb2 重新定位于类似内体的结构中（图4）。因此，在应用全基因组文库筛选时，有望鉴定出新的可结合 Grb2 的细胞表面蛋白。
该方法不仅限于检测细胞表面蛋白。例如，Dynamin2可诱导GFP-Grb2发生亚细胞定位的改变，表现出类似内体的募集现象（图5）。Dynamin2与Grb2的C端SH3结构域结合，并参与该复合物的内吞过程9,10。因此，该方法可用于鉴定一般的蛋白质结合复合物，而不仅限于鉴定SH2结构域的相互作用伴侣蛋白。
可能观察到多种不同类型的转位现象，例如定位于细胞膜、内体、其他细胞质囊泡结构或细胞核。因此，建议对所有图像进行人工目检。然而，在筛选大量cDNA时，采用自动化的图像分析算法更为实用。在此情况下，宜结合使用多种算法，例如通过斑点检测来识别内体，通过细胞质/细胞核检测来识别核转运，以及使用通用形态学算法来识别细胞形态变化。这些不同表型检测方法的应用已在其他文献中进行了更详细的讨论11。
<img alt="cDNA文库扩增流程示意图；所用设备：Tecan Freedom Evo、ImageJ、R。" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 实验总体方案。本实验详细描述了一个完整的高内涵筛选工作流程，起始于cDNA文库的扩增与制备，随后进行cDNA载体与报告基因构建体的转染，最后通过免费开源软件IMAGEJ进行图像采集与图像分析。
<img alt="样品制备软件界面中的实验室工作流程图；包含分步操作过程图标。" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. Tecan 平台的配置。（1）左侧需放置五个 100 ml 储液槽，分别加入缓冲液 1（40 ml）、缓冲液 2（40 ml）、缓冲液 3（50 ml）、AW（60 ml）和 A4（100 ml）。在实验过程中，储液槽 A4 需补充一次。（2）在此示例中，真空 manifold 位于位置 14。（3）含有细菌沉淀的深孔板位于位置 30，旁边是装有 25 ml 洗脱缓冲液的洗脱缓冲液储液槽。（4）8 通道移液头的一次性吸头需装载在左侧的吸头架中，多通道移液头的吸头需放置在位置 40。本实验所用的 Tecan FreedomEvo 液体处理系统配备 500 μl 注射器。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4382/4382fig2large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
<img alt="显示数据采集与分析设置（包括控制面板）的荧光显微镜软件界面。" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 3"> 
图 3. Opera LX 上图像采集的自动化。A) 选择“配置”选项卡（1）。启用实验所需的激光线（2）。选择用于图像采集的相机（3）。选择实验所用的板类型和物镜（4）。B) 选择“显微镜”选项卡（1）。设定曝光1的光源和曝光时间（2,3）。对一个孔进行聚焦并获取高度信息（4）。C) 选择“实验定义”选项卡（1）。拖放曝光、斜裁、参考、布局和子布局文件（2）。拖放实验文件（3）。D) 选择“自动实验”（1）。拖放实验文件（2）。分配适当的条形码（3）。单击“开始”按钮以启动图像采集（4）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4382/4382fig3large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看大图</a>。
<img alt="细胞中cDNA表达、内吞作用示意图、Grb2-GFP相互作用、显微镜结果。" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
图4. 通过cDNA表达实现GFP-Grb2的转位。在过表达跨膜生长因子受体后，GFP-Grb2从主要位于细胞质的定位转移到类似内体的结构，并随后内化至内体中。左侧显示的是瞬时转染GFP-Grb2（上图）或GFP-Grb2与EGFR（下图）的COS M6细胞的显微图像。共表达EGFR导致GFP-Grb2重新定位至类似内体的结构。
<img alt="显示细胞标志物的荧光显微镜图像；绿色和蓝色通道；细胞分析。" src="/files/ftp_upload/4382/4382fig5.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 5"> 
图 5. cDNA诱导GFP-Grb2转位的示例。参与Grb2介导的内吞作用的GTP酶Dynamin2可将GFP-Grb2重定位至类似内体的结构（以圆圈标出）。在本实验中，将GFP-Grb2与DNM2共转染至HEK293T细胞中。转染24小时后，用Hoechst 33342染色细胞，并在Opera LX系统上采集图像。图中显示了绿色（GFP）通道和紫外光（蓝色；Hoechst 33342）的一个视野。

<ol><li>Sastry, L., Cao, T., King, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Grb2-protein+complexes+in+human+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Multiple Grb2-protein complexes in human cancer cells.</a> Int. J. Cancer. 70, 208-213 (1997).</li>
<li>Li, S., Couvillon, A. D., Brasher, B. B., Van Etten, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+phosphorylation+of+Grb2+by+Bcr%2FAbl+and+epidermal+growth+factor+receptor%3A+a+novel+regulatory+mechanism+for+tyrosine+kinase+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Tyrosine phosphorylation of Grb2 by Bcr/Abl and epidermal growth factor receptor: a novel regulatory mechanism for tyrosine kinase signaling.</a> Embo. J. 20, 6793-6804 (2001).</li>
<li>Bisson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selected+reaction+monitoring+mass+spectrometry+reveals+the+dynamics+of+signaling+through+the+GRB2+adaptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Selected reaction monitoring mass spectrometry reveals the dynamics of signaling through the GRB2 adaptor.</a> Nat. Biotechnol. 29, 653-658 (2011).</li>
<li>Ketteler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Feynman+trajectories%3A+determining+the+path+of+a+protein+using+fixed-endpoint+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">The Feynman trajectories: determining the path of a protein using fixed-endpoint assays.</a> J. Biomol. Screen. 15, 321-326 (2010).</li>
<li>Yamazaki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Grb2+in+EGF-stimulated+EGFR+internalization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of Grb2 in EGF-stimulated EGFR internalization.</a> J. Cell. Sci. 115, 1791-1802 (2002).</li>
<li>Antczak, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Domain-Based+Biosensor+Assay+to+Screen+for+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+Modulators%5BTitle%5D)+AND+%22in+Live+Cells.+ASSAY+and+Drug+Development+Technologies%22%5BJournal%5D)">Domain-Based Biosensor Assay to Screen for Epidermal Growth Factor Receptor Modulators.</a> in Live Cells. ASSAY and Drug Development Technologies. 10, 24-36 (2012).</li>
<li>Su, J., Batzer, A., Sap, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+tyrosine+phosphatase+R-PTP-alpha+is+tyrosine-phosphorylated+and+associated+with+the+adaptor+protein+Grb2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Receptor tyrosine phosphatase R-PTP-alpha is tyrosine-phosphorylated and associated with the adaptor protein Grb2.</a> J. Biol. Chem. 269, 18731-18734 (1994).</li>
<li>Hertog, J. den, Tracy, S., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+receptor+protein-tyrosine+phosphatase+alpha+on+Tyr789%2C+a+binding+site+for+the+SH3-SH2-SH3+adaptor+protein+GRB-2+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Embo.+J%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of receptor protein-tyrosine phosphatase alpha on Tyr789, a binding site for the SH3-SH2-SH3 adaptor protein GRB-2 in vivo.</a> Embo. J. 13, 3020-3032 (1994).</li>
<li>Miki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+Ash%2FGrb-2+with+dynamin+through+the+Src+homology+3+domain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Association of Ash/Grb-2 with dynamin through the Src homology 3 domain.</a> J. Biol. Chem. 269, 5489-5492 (1994).</li>
<li>Seedorf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamin+binds+to+SH3+domains+of+phospholipase+C+gamma+and+GRB-2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dynamin binds to SH3 domains of phospholipase C gamma and GRB-2.</a> J. Biol. Chem. 269, 16009-16014 (1994).</li>
<li>Carpenter, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CellProfiler%3A+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome Biol. 7, R100(2006).</li>
<li>Seed, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+expression+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Developments in expression cloning.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 6, 567-573 (1995).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

表达克隆是一种强大的工具，过去已被用于鉴定病毒受体和血细胞抗原等新型细胞组分12。在此，我们描述一种方法，以促进鉴定可与Grb2结合的新型假定信号转导受体。
 该方案中有几个关键步骤。
 <ol>
 <li>进行自动化质粒制备时，必须完全重悬细菌沉淀。有时需要加入剧烈振荡步骤，或使用移液器进一步混合。</li>
 <li>加入溶液2和溶液3后，必须充分混匀，我们发现手动翻转密封的微孔板比使用自动摇床更有效。此步骤应避免使用移液器，以免导致DNA剪切。</li>
 <li>在所有真空步骤中，必须确保液体完全从微孔板中排出，否则将导致得率降低。</li>
 <li>洗脱时，质粒结合板底部常会形成洗脱液液滴。这些液滴需收集至洗脱收集板中，因此建议小心抬起质粒结合板，将底部残留的液滴小心转移至洗脱板。</li>
 <li>转染过程中，复合物形成时间至关重要。我们通常遵循20-30分钟；延长至1小时亦可，不会降低转染效率，但不建议更短时间。</li>
 <li>显微成像时，物镜放大倍数的选择非常重要。本实验所用的Opera LX系统在20倍放大下已能获得高质量图像。若需要更高分辨率图像，可更换物镜，但为获得具有统计学意义的细胞数量，需采集更多视野并延长成像时间。通常，我们力求每孔至少成像100个细胞。</li>
</ol>
 Grb2转位实验已被其他研究团队用于鉴定EGFR激酶活化的小分子抑制剂6。在该实验中，EGFR通过配体特异性激活，从而导致Grb2被招募至质膜。随后可利用小分子化合物研究对此相互作用的干扰。类似地，可以设想利用siRNA筛选来鉴定参与EGFR-Grb2信号通路或其他与Grb2结合的生长因子受体（如c-KIT或促红细胞生成素受体）的内源性基因。因此，该技术具有多种潜在应用价值。类似的方法也可应用于其他接头分子（如Shc、Gab或IRS）的GFP标记报告系统。
 使用基于哺乳动物细胞的这种细胞检测方法的一个主要优势在于，它能够识别出具有生理相关性的相互作用。该检测方法可反映蛋白质复合物的形成，更重要的是，相关相互作用可在正确的亚细胞定位中被监测。在这方面，该技术克服了其他蛋白质-蛋白质相互作用方法（如酵母双杂交系统）所产生的假象问题。 体外 检测。但需要注意的是，间接相互作用也可能导致Grb2的招募。类似地，cDNA表达可能诱导结合伴侣蛋白的转录上调。为了区分这些可能性，有必要进行适当的二次检测，以区分直接结合与间接结合效应。
 总之，GFP-连接分子转位检测在全基因组筛选和药物发现应用中具有很高的潜力。

<table><tbody><tr><td>cDNA 文库</td><td>Origene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB+amp</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>透气密封膜</td><td>ThermoScientific</td><td>AB-0718</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospin 96 质粒提取试剂盒</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740625.4</td><td></td></tr><tr><td>Transfectin</td><td>BioRad</td><td>170-3351</td><td></td></tr><tr><td>H&amp;#8211;chst33342</td><td>分子探针（Molecular Probes）</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Viewplate 96 F TC 培养板</td><td>PerkinElmer</td><td>6005182</td><td></td></tr><tr><td>RapidPick</td><td>Hudson</td><td></td><td>Norgren CP7200</td></tr><tr><td>Freedom Evo</td><td>Tecan</td><td></td><td>配真空 manifold</td></tr><tr><td>Multidrop 384</td><td>Thermo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opera LX</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种通过表达克隆研究grb2信号复合物的高内涵成像工作流程

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

生长因子受体介导的信号转导对于细胞维持增殖和分化至关重要，并需要严格的调控。信号转导由胞外配体与跨膜受体结合启动，并激活下游信号级联反应。Grb2 是有丝分裂原信号通路中的一个关键调控因子，它是一种模块化蛋白，包含一个位于中间的 SH2（Src 同源 2）结构域，两侧各有一个 SH3 结构域，本身不具有酶活性。Grb2 通过其 N 端 SH3 结构域持续性地与鸟苷酸交换因子 Son-Of-Sevenless（SOS）结合。Grb2 的 SH2 结构域可结合生长因子受体上磷酸化的酪氨酸残基，从而将受体激活与 SOS-Ras-MAP 激酶信号通路偶联起来。此外，Grb2 还被报道在信号转导和受体的内吞作用中发挥正向或负向调控作用。Grb2 的模块化结构提示它能够与多种受体结合，并沿多条不同的信号通路传递信号1-3。
	此处描述的是一种简单的显微镜检测方法，用于监测Grb2向细胞质膜的募集。该方法改编自一种通过检测绿色荧光蛋白（GFP）标记的Grb2在刺激作用下亚细胞定位变化的实验。4-6质膜受体（如活化的表皮生长因子受体（EGFR））在结合Grb2后，可在表达cDNA时将GFP-Grb2招募至质膜，并随后转移至细胞内的内体区室。为了鉴定 体内 Grb2蛋白复合物，该技术可用于基于Grb2亚细胞定位变化的全基因组高内涵筛选。以下将详细描述cDNA表达克隆的制备、转染及图像采集过程。与其他用于鉴定蛋白质相互作用伙伴的基因组学方法（如酵母双杂交系统）相比，该技术可通过基于显微镜的简单检测，在哺乳动物细胞中直接在相互作用发生的亚细胞位点上对蛋白复合物进行可视化观察。因此，既可评估定位模式等定性特征，也可定量分析相互作用的强度。

一种用于鉴定新型具有信号传导能力的跨膜受体的高内涵筛选方法被描述。该方法适用于大规模自动化，并可对受体功能进行预测 体内 蛋白质结合及蛋白质复合物在哺乳动物细胞中的亚细胞定位。

一种通过表达克隆研究Grb2信号复合物的高内涵成像工作流程

生长因子受体介导的信号转导对于细胞维持增殖和分化至关重要，且需要严格调控。信号……

以下实验的总体目标是通过cDNA表达克隆技术并观察绿色荧光蛋白标记的Grab two蛋白的变化，来鉴定与Grab two相互作用的分子伴侣。该目标首先通过从细菌裂解液中制备cDNA文库来实现，这是第二步。随后将这些cDNA转染至人胚胎肾细胞中，从而实现报告基因构建体与目的基因的共同表达。接下来，将转染后的培养板置于Opera显微镜下进行分析，以观察Grab two在细胞内定位的变化。根据荧光显微镜结果，可获得表皮生长因子受体介导的、GFP标记的Grab two向早期内体募集的现象。与酵母双杂交等现有方法相比，该技术的主要优势在于能够在生理条件下鉴定Grab two的相互作用蛋白，同时考虑相互作用蛋白的亚细胞分布情况。尽管该方法可用于鉴定由Grab two介导的信号转导，但也适用于其他系统，例如其他目的蛋白。cDNA文库以单个细菌克隆的形式提供，保存于甘油 stocks 中。使用 Hudson Rapid Pick Light 的点样菜单中的 re ray 命令，在 96 孔板中操作。从源板中挑取细菌克隆，并接种到含有 1.5 毫升 LB 氨苄青霉素的 96 深孔板中。用透气封膜密封深孔板，于 37 摄氏度摇床中过夜培养。次日，将含有细菌的深孔板在 2000 转/分钟下离心 20 分钟。使用台式离心机中的板适配器，吸出孔中的培养基，保留完整的细菌沉淀。接下来，按照此处所示配置 Tecan Freedom Evo 自动化工作站的台面。将质粒制备所需的溶液分别加入第 1 至第 5 个槽中，并在台面上放置一块深孔板。将含有铝硅酸盐溶液的多孔槽放置在深孔板旁边，并将吸头装入吸头架中。组装真空抽滤装置。将质粒结合板放入真空抽滤装置内，质粒过滤板置于装置顶部。用 250 µL 溶液一重悬沉淀颗粒。通过上下吹打使沉淀重悬于Resus悬浮缓冲液中。确保沉淀完全重悬对该实验步骤的成功至关重要。若上下吹打无法完全重悬沉淀，可使用摇床进行辅助。加入250微升裂解缓冲液后，充分重悬菌体沉淀。密封培养板并倒置，以确保充分混匀。设定计时器为两分钟。 接下来，加入 350 µL 的溶液三，即中和缓冲液。密封反应板并倒置混匀三次。将细菌裂解液转移至质粒滤板中。施加真空持续五分钟。移除滤板，并将结合板置于多通道装置顶部。抽真空1分钟。加入500微升额外洗涤缓冲液，抽真空2分钟。加入900微升洗涤缓冲液四，抽真空2分钟。随后，再次加入 900 微升洗涤缓冲液四，并抽真空 15 分钟。将 DNA 收集板放入层析柱装置中。向结合板中加入 100 微升洗脱缓冲液，并孵育 2 分钟。抽真空10分钟。最后，取下收集板，使用NanoDrop 8,000测定DNA浓度。采用此方法，通常可获得约100纳克/微升的产量，可用于开始本实验。将HEK 293细胞经胰蛋白酶消化并计数后，使用自动分液器将每种2 × 10⁴个细胞分装至每孔的PerkinElmer View板中，在37°C及5%二氧化碳条件下培养过夜，用于转染。使用自动化液体处理仪，在圆底 96 孔板的每个孔中制备以下混合液：100 纳克 GFP。取含有 100 纳克 CD NA 的两种质粒 DNA，溶于 25 微升无血清培养基中。接着，向每孔加入 25 微升含有 0.5 微升转染试剂的无血清培养基混合液，并启动计时器，孵育 30 分钟。30分钟后，将50微升cDNA转染混合物加入细胞中，采用轻柔的加样方法。将细胞在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育过夜。开始图像采集时，启动 opera 软件。选择配置选项卡，并选择 20 倍物镜和正确的板型。确保物镜上的镜环设置为正确值，以便能够根据不同板型进行聚焦。接下来，选择显微镜选项卡。将曝光一定义为 fite 4 88 激光，曝光二定义为 UV 365 激光。在两次曝光中均激活紫外滤光片，并分配曝光。将曝光一连接至相机一，曝光二连接至相机二。将曝光一的曝光时间设为800毫秒，曝光二的曝光时间设为40毫秒。二、选择曝光，将一个聚焦高度设为零微米。聚焦后选择聚焦。对相机一进行曝光。调整焦面高度以优化曝光平面，然后单击“获取高度”。保存曝光参数，并重复进行曝光。二、选择实验定义选项卡，创建布局和子布局。拖放相关的布局、曝光、参考图像、倾斜度、裁剪文件和子布局。保存实验。选择自动实验选项卡，并在正常条件下采集图像。Grab two 在整个细胞内均有定位。当生长因子受体受到刺激后，它会转位至质膜，并随后被内化进入内体。在本图中，上方图显示了瞬时转染了 GFP-Grab two 的 CO M six 细胞，正如预期，荧光信号分布在细胞的整个区域。然而，在瞬时转染了GFP抓取蛋白2以及细胞表面受体IT EGFR抓取蛋白2的细胞中，后者会重定位至类似内体的结构，如底图所示。因此，当使用全基因组文库时，可望鉴定出新的与抓取蛋白2结合的细胞表面蛋白。该方法不仅限于细胞表面蛋白的检测。例如，GPA 的 DYNAMIN2 参与介导 GRAF2 的内吞作用，可诱导 GRAF2 发生转位。在本实验中，将 GFP-GRAF2 与 DNM2 共转染入 HEC293T 细胞。红色圆圈内细胞显示了 GFP-GRAF2 转位至类似内体结构的现象。通过此实验步骤后，可进一步采用免疫共沉淀或生物化学检测等方法来回答更多问题，例如该相互作用是直接还是间接的。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用表达克隆技术来鉴定亚细胞水平的蛋白质相互作用。

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科研

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生物学

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蛋白质-蛋白质相互作用成像 体内

本文介绍了利用活细胞成像技术测定白细胞对特定配体的趋化反应，并鉴定细胞表面受体与胞质蛋白之间相互作用的方法。...

白三烯B4介导的细胞迁移及BLT1与β-arrestin相互作用的实时成像

蛋白质在质膜内或细胞内特定位置的区室化分布是一种重要的调控机制，可显著影响信号转导的结果；因此，要理解信号转导过程，研究相关蛋白质在空间和时间上的动态行为至关重要。本文介绍了一种基于全内反射荧光（TIRF）显微镜的系统，用于研究T细胞中的信号转导，该系统也具有广泛的适用性。...

一种用于实时同步成像T细胞受体及其相关信号蛋白的TIRF显微镜技术

我们介绍一种活细胞成像方法，可揭示T细胞活化过程中蛋白质的动态变化。我们展示了T细胞铺展实验、共聚焦显微镜与成像分析相结合的使用方法，以获得定量结果，用于追踪T细胞活化全过程中的信号复合物形成。...

T细胞信号复合体形成的实时活体成像

我们在G蛋白偶联受体（GPCR）的不同特定位点处基因编码非天然氨基酸对叠氮-L-苯丙氨酸，并展示了叠氮基团在多种应用中的多功能性。这些应用包括一种靶向光交联技术，用于鉴定GPCR配体结合口袋中的残基，以及利用肽表位标签或荧光探针对GPCR进行位点特异性的生物正交修饰。...

基因编码的分子探针用于研究G蛋白偶联受体

本方案描述了如何利用全内反射荧光显微镜观察和追踪活细胞表面的单个受体，从而分析受体的侧向流动性、受体复合物的大小，以及可视化瞬时的受体-受体相互作用。该方案可拓展应用于其他膜蛋白。...

高分辨率时空分析受体动力学的单分子荧光显微技术

本文展示了一种灵活的信息学工作流程，可实现对荧光标记细胞的多重基于图像的分析。该工作流程可定量分析细胞核和细胞质标志物，并计算这些标志物在不同区室间的转位情况。文中提供了利用siRNA对细胞进行扰动的实验步骤，以及在96孔板体系中通过间接免疫荧光法可靠检测标志物的方法。...

基于开源软件的通用显微镜数据中荧光标记物高内涵单细胞定量分析工作流程

本研究的目的是 该方案旨在建立一种可用于肥大细胞分泌功能基因组学分析的方法。该方法基于对与目的基因共转染的荧光报告基因释放量的定量评估，并结合实时检测 分泌颗粒形态的分析。...

探究肥大细胞分泌颗粒：从生物合成到胞吐作用

通过将双分子荧光互补（BiFC）与光激活定位显微镜（PALM）相结合，可在细胞中以纳米级空间分辨率可视化蛋白质-蛋白质相互作用。本文描述了在U2OS细胞中利用BiFC-PALM成像Ras-Raf相互作用，以观察单个Ras-Raf复合物的纳米级簇集和扩散行为。...

双分子荧光互补结合光激活定位显微技术（BiFC-PALM）

本文介绍了一种对表达绿色荧光蛋白标记的血管紧张素Ⅱ...

活细胞成像与三维分析转染人胚胎肾细胞中血管紧张素受体1a亚型的转运——基于共聚焦显微镜技术

药物靶点结合程度的测定对于有效的药物开发和化学探针验证至关重要。本文详细介绍了一种利用高内涵成像技术测定药物-靶点结合程度的实验方案，该方法基于细胞热偏移分析（CETSA），并适配于微孔板平台。...

利用高内涵成像技术定量测定贴壁细胞中的靶点结合

学习利用高内涵成像技术结合cDNA表达克隆筛选Grb2蛋白相互作用伙伴的方法。该流程通过GFP标记和自动化转染在HEK293细胞中可视化Grb2的亚细胞定位变化，适用于信号转导和蛋白质相互作用研究。

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