2012年10月30日
高内涵筛选新的信号主管跨膜受体的鉴定方法。此方法是适合于大规模的自动化,并允许的预测蛋白结合和在哺乳动物细胞中的蛋白复合物的亚细胞定位。
以下实验的总体目标是通过 CD NA 表达克隆和观察标记的绿色荧光蛋白 Grab two 的变化来确定 grab two 的相互作用伴侣。这是通过首先从细菌裂解物制备 CD NA 文库作为第二步来实现的。CDNA 在人胚胎肾细胞中转染,这将导致报告基因构建体与目标基因一起表达。
接下来,在 opera 显微镜上分析转染板,以可视化整个细胞中抓二定位的变化,获得的结果显示表皮生长因子受体介导的 GFP 标记的募集。根据荧光显微镜将两个抓取到内体。与现有方法(例如这两种杂交种)相比,该技术的主要优点是可以在考虑到相互作用伙伴的亚细胞分布的生理情况下识别 grab two 的交互伙伴。
好吧,尽管这种方法可用于识别 Grab 2 的信号转导。它也可以应用于其他系统,例如其他感兴趣的蛋白质。CDNA 文库在甘油原液中提供单个细菌克隆。
在 96 孔格式中,使用 Hudson Rapid 拾取灯的选择器菜单中的 re ray 命令。从源板中挑选细菌克隆,并在 96 深孔板中接种到 1.5 ml lb 安培中。用透气密封件密封深孔板,并在 37 摄氏度下在摇床中孵育过夜 第二天,将含有细菌 A 2000 RPM 的深孔板旋转 20 分钟。
在台式离心机中使用孔板适配器,从孔中吸出培养基,保持细菌沉淀完好无损。接下来,配置 Tecan Freedom Evo Automation 工作站的甲板,如下所示。将质粒制备溶液分配到 1 至 5 个槽中,并在甲板上放置深孔板。
将一个带有 alucian 溶液的多孔槽放入深孔板加载吸头附近,放入吸头架中。组装真空歧管。质粒结合板放置在歧管内,质粒滤板放置在歧管 Resus 悬浮颗粒的顶部,其中含有 250 微升溶液 1。
通过上下移液获得 Resus 悬浮缓冲液。确保沉淀完全重悬对于该程序的成功至关重要。如果上下抚摸不能完全重悬沉淀,则可以使用摇床。
一旦沉淀完全重悬,通过向裂解缓冲液中加入 250 μL 溶液来沉积细菌。密封板并倒置以允许完全混合。将计时器设置为 2 分钟。
接下来,加入 350 微升溶液 3。中和缓冲液。密封板并倒置 3 次线。
将细菌裂解物转移到质粒过滤板中。真空吸 5 分钟。取下过滤板,将结合板放在歧管顶部。
真空吸 1 分钟。加入 500 μL 额外的洗涤缓冲液,并真空 2 分钟。加入 900 μL 洗涤缓冲液 4,并真空 2 分钟。
之后,再次加入 900 微升洗涤缓冲液 4 次,并真空 15 分钟。将 DNA 收集板放入歧管内。向结合板中加入 100 μL Elucian 缓冲液,孵育 2 分钟。
真空 10 分钟。最后,取出收集板并使用 NanoDrop 8, 000 测量 DNA 浓度。通常,使用这种方法开始此过程,预计产量约为 100 ng/μL。
在 hec 2 9 3 细胞后,进行胰蛋白酶、去根和计数。使用自动分液器将 2 乘以 10 的样品分配到 Perkin Elmer 的每个孔中的四个细胞中。查看板在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育细胞过夜以进行转染。
使用自动液体处理器在圆底 96 孔的每个孔中制备以下混合物,孔板 100 ng GFP。在 25 μL 无血清培养基中用 100 ng CD NA 获取两个质粒 DNA。接下来,加入 25 μL 无血清培养基,每孔混合物含有 0.5 μL 转染液,并启动计时器 30 分钟。
30 分钟后,将 50 μL 的 CDNA 转染混合物转移至细胞中。使用温和的分配方法。将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育过夜。
要开始图像采集,请启动 Opera 软件。选择配置选项卡,然后选择 20 倍物镜和正确的板类型。确保在物镜上将 Collar 设置为正确的值,以允许使用不同类型的板进行聚焦。
接下来,选择显微镜选项卡。将曝光 1 定义为 fite 4 88 激光,将曝光 2 定义为 UV 365 激光。在两个曝光上激活 UV 滤镜并分配曝光。
一个到相机,一个和曝光。二对相机二。将曝光时间设置为 800 毫秒(曝光)、1 毫秒和 40 毫秒(曝光)。
二、选择曝光,一将焦距设置为零微米。聚焦后选择 focus。曝光相机 1。
调整焦距高度以优化曝光平面,然后单击 Take height(获取高度)。保存曝光参数,对曝光重复此作。二、选择 Experiment Definition 选项卡,创建 layout 和 sub layout。
拖放相关布局、曝光、参考图像、倾斜、裁剪文件和子布局。保存实验。选择 Automatic Experiment 选项卡并在正常条件下获取图像。
Grab Two 定位在整个单元格中。在生长因子受体的刺激下,它易位到质膜,随后内化到内体中。在该图中,上图显示了用 GFP 瞬时转染的 CO M 6 个细胞抓住了 2 个,正如预期的那样,荧光分布在整个细胞中。
然而,在瞬时转染 GFP 的细胞中,抓 2 加细胞表面受体 IT EGFR 抓 2 重新定位到内体样结构,如下图所示。因此,当应用全基因组文库时,可以预期可以识别出新的抓取两个结合细胞表面蛋白。该方法不仅限于细胞表面蛋白的检测。
例如,GPA 的 DYNAMIN 2 参与 grab two 介导的内吞作用,可诱导 grab two 的易位。在本实验中,用 DNM 2 将 GFP 抓二转染到 HEC 2 93 T 细胞中。GFP 抓取 2 重新定位到内体样结构由红色圆圈内的细胞说明。
在此程序之后,可以使用免疫沉淀或生化测定等其他方法来回答进一步的问题,例如相互作用是直接的还是间接的。观看此视频后,您应该对如何使用表达克隆来识别亚细胞蛋白相互作用有很好的了解。
本文描述了一种用于识别新型具有信号传导能力的跨膜受体的高内容筛选方法,适用于大规模自动化。该方法能够预测体内蛋白质结合和哺乳动物细胞中蛋白质复合物的亚细胞定位。
High-content imaging of Grb2 signaling complexes via expression cloning enables direct visualization of protein-protein interactions in mammalian cells, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking. This workflow provides quantitative and spatially resolved data on signaling complex formation, enhancing predictive confidence at the discovery-to-lead inflection point. The approach is broadly applicable for portfolio triage and prioritization of signaling pathway targets in oncology and cell signaling research.
This high-content imaging workflow integrates from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis-driven and unbiased screening strategies.