Name: 进行阴道灌洗，结晶紫染色法和阴道细胞学评价小鼠发情周期分期鉴定 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 学习使用阴道灌洗和结晶紫染色法进行小鼠阴道细胞学评价，通过识别上皮细胞、角化细胞和白血球类型准确鉴定发情周期分期。该方法为生殖生物学研究提供可靠的非侵入性评估工具。

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我们感谢卡尔顿大学沉浸式媒体工作室的 Marc Leonard 在视频制作与编辑方面提供的专业技术支持，以及卡尔顿大学沉浸式媒体工作室/神经再生实验室的 Martin Bertrand 博士在视觉模型方面提供的帮助。作者们衷心感谢渥太华大学动物护理与兽医服务部门的 Marilyn Keaney 博士及其全体敬业的工作人员所提供的专业建议。本研究由加拿大卫生研究院（CIHR，项目号 MOP 62826）资助给 SALB，加拿大卫生研究院老龄化研究所及健康研究战略培训计划/加拿大卫生研究院神经退行性脂质组学培训项目（TGF 96121）资助给 SALB 和 SF，加拿大创新基金会资助给 SF，安大略省创新信托基金资助给 SF，以及 Autodesk Research 资助给 SF。ACM 获得了加拿大卫生研究院 Banting 和 Best 博士生奖学金。NV 获得了老龄化研究所及加拿大卫生研究院神经退行性脂质组学培训项目的博士后专业奖学金。

1. 试剂准备 
<ol>
 <li>进行无菌阴道灌洗时，将双蒸水（ddH2O）高压灭菌，并储存于密封容器中，室温保存备用。</li>
 <li>用于细胞学评估时，将0.1 g结晶紫粉末加入100 ml双蒸水（ddH2O）中，充分混匀。结晶紫染液（0.1%）可储存于密封容器中，室温保存备用。</li>
</ol>
2. 收集阴道细胞（阴道灌洗）
<ol>
 <li>在无菌吸管末端安装一个橡胶吸头 200 μl 尖端吸取约 100 μl 无菌ddH₂O2使用吸头上的刻度作为体积参考。 </li>
 <li>将小鼠从小鼠笼中提起，放在笼子的 hopper（盖子）上，使其后端朝向操作者。 </li>
 <li>牢牢抓住小鼠尾巴，抬高其后躯。此时小鼠仅有前肢抓住加样槽。在此过程中，小鼠可能会排尿。若发生排尿，请等待其排尿停止。若阴道口处残留尿液，可用过量的去离子水冲洗开口处。2O，使用独立的吸头（即，而不是你的样本采集尖端）。</li>
 <li>将ddH₂O的末端放置2在阴道口处使用O形尖端，注意不要插入开口，因为阴道（和宫颈）刺激可诱导大鼠假孕1,2最近的报告表明，小鼠对这种效应的敏感性较低，但仍应注意尽量减少重复分析过程中的侵入性程度。3. </li>
 <li>轻轻按压胶头，排出约四分之一到一半体积的水（~25-50 μl在阴道口处，液体将自发吸入管腔，无需插入吸头。缓慢释放施加在吸球上的压力，液体将回流至吸头内。避免过快释放压力，以防液体被吸入吸球内部。为达到此目的，可使用带滤芯的吸头。 </li>
 <li>使用同一吸头、洗耳球和液体重复上一步骤4-5次，以获得单个样本中足够数量的细胞。 </li>
 <li>将液体置于载玻片上，于室温下静置，使涂片完全干燥。干燥后，可立即对发情期涂片进行染色，或保存后择期染色。 </li>
</ol>
3. 使用结晶紫进行细胞学染色*4
<ol>
 <li>将干燥的载玻片放入盛有结晶紫染液的考普林瓶（或其他类似的染色容器）中，染色1分钟。</li>
 <li>将载玻片转移至第二个盛有ddH2O的考普林瓶中，用ddH2O洗涤1分钟，重复一次。</li>
 <li>用轻质擦拭纸轻轻吸去载玻片边缘多余的ddH2O，注意避免接触染色后的涂片区域。</li>
 <li>用移液器吸取约15 μl甘油滴加至涂片及盖玻片上。或者，也可使用其他组织学封片试剂，以获得更持久、不扩散的染色效果。</li>
</ol>
 * 此处描述的染色方法是任何实验室均可执行的最简单操作步骤。其他方法可提供更详细的细胞信息。例如，采用巴氏染色法（Papanicolaou staining）时，有核上皮细胞的成熟度可通过染色差异进行区分：较不成熟的细胞呈青绿色，而较成熟的细胞则呈粉红色或橙色。这些差异可用于判断动情前期的早期或晚期阶段。4 
4. 阴道细胞学检查
<ol>
 <li>在光学显微镜下检查涂片，以确定存在的细胞类型。染色后应立即进行显微镜检查，因为在使用甘油封片时，结晶紫会随着时间推移从细胞中扩散。分析时应拍摄显微照片，以记录细胞学特征。</li>
 <li>首先在较低放大倍数下全面观察整个涂片，选择一个具有代表性的区域，然后转换至更高放大倍数进行观察。您将观察到角化的鳞状上皮细胞、白细胞和/或有核上皮细胞（代表性结果，图1A-C）。根据所见细胞的比例，可判断小鼠在采样时所处的动情周期阶段（代表性结果，图1D-G）及其即时激素状态（讨论，图2）。</li>
</ol>
5. 代表性结果
细胞学： 在阴道涂片样本中可检测到三种主要的细胞类型：（1）有核上皮细胞（图1A），（2）角化鳞状上皮细胞（图1B），以及（3）白细胞（图1C）。有核上皮细胞的细胞质染色较浅，细胞膜染色较深，细胞核呈椭圆形（图1A）。角化鳞状上皮细胞染色均匀，形状较其前体有核上皮细胞更呈多边形，且无细胞核（图1B）。多形核白细胞可通过其不规则的形态、深染的多形性细胞核以及较小的体积与上皮细胞相区分（图1C，黑色箭头）。若涂片中存在尿液污染，尿酸结晶因其晶体结构与任何预期的细胞类型均不相同而易于识别（图3）。若出现此情况并影响主要细胞类型的判读，则应弃用该涂片，不得用于分期分析。
分期：通过观察涂片中不同类型细胞的相对比例，可以确定小鼠在样本采集当天所处的动情周期阶段（图1D-G）。在动情前期，细胞几乎全部为成簇的圆形、结构完整的有核上皮细胞（图1D，代表性细胞由白色箭头指示）。在动情期，细胞主要为致密成簇的角化鳞状上皮细胞（图1E，代表性细胞由箭头指示）。在动情后期，以小而深染的白细胞为主（图1F，代表性细胞由黑色箭头指示）；可观察到角化鳞状上皮细胞，常呈碎片状（图1F，代表性细胞由黑色箭头指示）。在动情间期，仍可能偶见角化鳞状上皮细胞（图1G，代表性细胞由黑色箭头指示），但白细胞仍占主导地位（图1G，代表性细胞由黑色箭头指示）。动情后期与动情间期的区别在于动情间期可见有核上皮细胞（图1G，代表性细胞由白色箭头指示）。
<img src="/files/ftp_upload/4389/4389fig1.jpg" alt="发情周期细胞学中的细胞；有核细胞、上皮细胞和白细胞阶段的显微镜图像。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 阴道涂片的细胞学评估可用于鉴定动情周期阶段。 在阴道涂片样本中可检测到三种主要细胞类型：(A) 有核上皮细胞，(B) 角化鳞状上皮细胞，以及 (C) 白细胞。根据涂片中这些细胞类型的比例如，可判断小鼠处于 (D) 前动情期、(E) 动情期、(F) 动情后期，或 (G) 动情间期，如代表性结果部分所述。E、F 和 G 中的黑色箭头指向典型的角化鳞状上皮细胞。C、F 和 G 中的黑色箭头指向典型的白细胞。D 和 G 中的白色箭头标示出典型的有核上皮细胞。
<img src="/files/ftp_upload/4389/4389fig2.jpg" alt="激素水平周期图；动情周期各阶段细胞形态；显微镜图像；内分泌学研究。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 阴道涂片细胞学反映潜在的内分泌事件。 详细说明亦见于讨论部分。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4389/4389fig2large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。
<img src="/files/ftp_upload/4389/4389fig3.jpg" alt="显微镜图像，晶体结构观察，近距离分析，潜在杂质检测。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 尿液污染样本经结晶紫染色后可能出现尿酸晶体。 （A）晶体呈透明状，大小不一（箭头及框选区域在（B）中放大显示）。此视野中无细胞存在。若用于细胞学染色的视野中存在尿酸晶体污染，则可能难以准确识别存在的细胞类型，应弃用该涂片。比例尺 = 50 μm。

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<li>Van Der Lee, S., Boot, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+pseudopregnancy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+physiologica+et+pharmacologica+Neerlandica%22%5BJournal%5D)">Spontaneous pseudopregnancy in mice.</a> Acta physiologica et pharmacologica Neerlandica. 4, 442-444 (1955).</li>
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</ol>

作者声明不存在利益冲突。所有动物实验均严格遵循渥太华大学动物护理委员会和加拿大动物护理委员会制定的指南与规定。

这些细胞类型的变化反映了潜在的内分泌事件。动情周期中的动情前期对应于人类月经周期的卵泡期5，其特征是循环中17-β-雌二醇水平在排卵前升高6，以及催乳素出现小幅激增7（图2，动情前期，左侧面板）。17-β-雌二醇的升高间接刺激下丘脑和隔区的促性腺激素释放激素神经元，进而激活垂体前叶中的响应细胞，使其释放黄体生成素和卵泡刺激素进入血液循环8,9（图2，动情前期，左侧面板）。从处于动情前期动物采集的阴道涂片中，几乎仅见卵圆形有核上皮细胞（图1D，图2，动情前期，右侧面板）。卵泡刺激素水平达到高峰标志着排卵发生并进入动情期10,11。在动情期期间，17-β-雌二醇水平下降，而催乳素水平达到峰值6,7（图2，动情期，左侧面板）。阴道涂片以检测到几乎 exclusively 不规则形状的角化鳞状上皮细胞为特征，这些细胞常成团出现（图1E，图2，动情期，右侧面板）。进入动情后期与黄体酮激素水平持续上升同时发生6，对应于人类黄体期的开始12（图2，动情后期，左侧面板）。随着黄体酮水平开始上升，以及黄体激活后引发17-β-雌二醇水平出现小幅升高6,13,14（图2，动情后期，左侧面板）。此阶段阴道涂片中存在的细胞类型包括破碎的角化上皮细胞以及较小、染色较深的白细胞（图1F，图2，动情后期，右侧面板）。最后，小鼠进入动情间期，循环中黄体酮水平达到峰值6，对应于人类黄体晚期12。随着黄体退化，黄体酮水平随之急剧下降15,16（图2，动情间期，左侧面板）。在动情间期的涂片中，白细胞占主导地位。角化上皮细胞的频率减少，而在即将过渡至动情前期时，开始重新检测到有核上皮细胞（图1G，图2，动情间期，右侧面板）。
总之，如果采取以下预防措施，这一简单且常规的实验方案可用于估计实验小鼠每日的激素波动并确定其动情周期阶段，同时不改变其生殖状态。应采用本文所述的非侵入性方法进行取样，每天最多取样一次，以避免反复插入阴道、抽吸和搅动，这些操作可能导致阴道刺激，引发炎症反应17，从而使白细胞及其他细胞类型出现在涂片中，干扰细胞学评估。此外，即使在群体饲养的雌性小鼠中，不同个体出现延长的动情间期和动情期，以及静止期的诱导，均属正常现象18；准确识别这些阶段对于解释生殖、性别及疾病相关研究中的激素影响具有重要意义。动情周期长度的变异性也受年龄以及雌性小鼠群体内饲养条件（单独或群养）差异的影响7,19-21。在单性别雌性群体中饲养的雌鼠可能停止动情周期，进入持续的动情间期状态18,22,23，但通过暴露于经雄性尿液预处理过的笼具，可重新启动动情周期24,25。因此，为确定某只小鼠个体的动情周期长度，建议谨慎地每日进行本文所述的非侵入性评估，直至观察到两个完整的动情周期为止。

<table><tbody><tr><td>无菌 200 &amp;mu;l 吸头</td><td>Diamed</td><td>E340901</td><td></td></tr><tr><td>乳胶吸球（1 ml）</td><td>Fisher</td><td>03-488-21</td><td></td></tr><tr><td>玻璃显微镜载玻片</td><td>Fisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>结晶紫染色液（25 g）</td><td>Fisher</td><td>C581-25</td><td></td></tr><tr><td>轻型擦拭纸</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>甘油</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>显微镜盖玻片（22×30）</td><td>Fisher</td><td>12-544A</td><td></td></tr></tbody></table>

执行阴道灌洗、结晶紫染色及阴道细胞学评估以鉴定小鼠动情周期分期

Performing Vaginal Lavage, Crystal Violet Staining, and Vaginal Cytological Evaluation for Mouse Estrous Cycle Staging Identification

快速评估啮齿类动物生殖状态的方法不仅在生殖功能障碍研究中具有重要意义，而且在疾病新小鼠模型的构建以及病理刺激后组织退变（或再生）的激素调控机制研究中也是必需的。小鼠的生殖周期（即动情周期）分为四个阶段：动情前期、动情期、动情后期和动情间期。这些生殖阶段的转换由卵巢类固醇激素17-β-雌二醇和孕酮、促性腺激素黄体生成素和卵泡刺激素，以及催乳素等激素在血液循环中水平的特征性波动所标志。小鼠阴道道内细胞类型的改变反映了这些内在的内分泌事件。通过每日观察阴道涂片中核上皮细胞、角化鳞状上皮细胞和白细胞的相对比例，可用于判定小鼠所处的动情周期阶段。然而，采集这些样本时所采用的方法若具有侵入性，可能改变动物的生殖状态，并诱发炎症反应，从而干扰涂片的细胞学评估。本文介绍一种简单且非侵入性的操作流程，可用于确定雌性小鼠的动情周期阶段，而不干扰其正常的生殖周期。我们详细说明了如何通过采集和分析阴道涂片中占主导地位的细胞类型来区分动情周期的四个阶段，并阐述了如何结合内分泌状态对这些细胞变化进行解读。

本文介绍了如何通过简单、非侵入性地采集小鼠阴道涂片样本并进行细胞学评估，来判断小鼠生殖周期的阶段（动情前期、动情期、动情后期或动情间期）。我们进一步阐述了阴道细胞学变化如何反映驱动小鼠生殖周期各阶段转变的循环激素水平。

一种快速评估啮齿类动物生殖状态的方法，不仅在生殖功能障碍研究中具有重要意义，而且在……

本研究中进行的所有操作均严格遵循渥太华大学动物护理委员会和加拿大动物护理委员会制定的指南和规定。快速评估啮齿类动物生殖状态的方法不仅在生殖功能障碍研究中具有重要意义，而且在疾病新小鼠模型的构建以及病理刺激后组织退化或再生的激素调控机制研究中也是必需的。本文介绍了一种通过简单、无创的阴道涂片细胞学评估方法，根据涂片中占主导地位的细胞类型来确定雌性小鼠在任意一天生殖周期所处阶段的操作流程。小鼠的动情周期分为四个阶段。动情前期、动情期、动情后期和动情间期反映了卵巢类固醇激素17β-雌二醇和孕酮、促性腺激素（黄体生成素和卵泡刺激素）以及促黄体生成性激素催乳素在循环水平上的波动，这些激素信号标志着生殖阶段的转变。动情前期对应于人类月经周期中的卵泡期，其特征是排卵前循环中17β-雌二醇水平升高，以及催乳素的小幅激增。17β-雌二醇水平的升高伴随着循环中黄体生成素和卵泡刺激素水平的上升。卵泡刺激素水平达到峰值标志着排卵以及动情期（es）的开始。在动情期应激（ES stress）期间，17β-雌二醇水平下降，同时催乳素水平也下降。雌激素峰值期进入与循环中卵泡刺激素水平的小幅激增相吻合，并对应于人类黄体期的开始。孕酮水平开始上升，17β-雌二醇水平也出现第二次小幅激增。响应黄体活化，当循环中孕酮水平达到峰值时，小鼠进入间情期，该阶段对应于人类的相应时期。黄体晚期。黄体退化导致孕酮水平急剧下降，并进入蛋白阶段。细胞类型的改变反映了这些潜在的内分泌事件在上皮细胞相对比例上的变化。通过定量分析阴道涂片中检测到的细胞和白细胞，可用于确定每一个动情周期阶段。您好，我叫 Ashley McLean，是渥太华大学 Stephanie Bennett 博士领导的神经再生实验室中的一名研究人员。我是 Nicholas Valenzuela。我在渥太华卡尔顿大学的卡尔顿沉浸式媒体工作室与 Steven Phi 博士合作。在本视频中，我们介绍了一种可用于 EST 扩增循环阶段确定的简单方案。本方案将详细介绍如何通过评估主要的细胞类型和阴道涂片来区分小鼠的四个生殖周期阶段：动情前期、动情期、动情后期和动情间期。现在让我们开始。在本方案中，您需要准备两样物品：经高压灭菌的双蒸水和0.1%结晶紫溶液。染色液可保存在密闭容器中，置于室温下，待需要时使用。首先，在无菌200微升枪头末端安装一个乳胶吸头，吸取约100微升的无菌双蒸水。以枪头上的刻度作为体积参考。将小鼠置于喂食器上，使其后躯朝向操作者。牢固抓住其尾巴，轻轻抬起后肢。小鼠会用前肢抓住喂食器。此时，小鼠可能会排尿。如果发生这种情况，用另一根吸头吸取的双蒸水冲洗该区域。将装有双蒸水的吸头末端置于阴道口处。轻轻按压球囊，将其中约四分之一至一半体积的液体挤入阴道腔内。然后缓慢释放对球囊施加的压力，使液体重新回流至吸头内。使用同一吸头和液体重复此步骤四到五次。避免过快释放压力，以防液体被吸入球囊中。为此目的，可使用带滤芯的吸头。将小鼠放回笼中，并将液体排出至玻片上。将载玻片在室温下完全晾干。干燥后，这些额外的涂片可立即染色，也可在日后进行染色。将空气干燥的载玻片放入结晶紫染液中染色一分钟。用双蒸水冲洗载玻片1分钟。重复一次，用轻质纸巾轻轻擦去载玻片上多余的双蒸水。避免接触染色涂片区域，用移液管在涂片上滴加约20 µL甘油，然后盖上盖玻片。应尽快在光学显微镜下检查染色涂片，因为随着时间推移，染料会从甘油封片中的细胞中扩散。首先在较低放大倍数下观察整个涂片，选择一个具有代表性的区域，然后转换至更高放大倍数进行观察。在Pro Astra阶段，细胞几乎均为有核的上皮细胞。在extra阶段，所观察到的细胞主要为鳞状角化的上皮细胞，通常形成致密堆积的细胞簇。这些细胞形态不规则，无可见的细胞核。在动情期（met estro）阶段，仍可观察到少量角化的鳞状上皮细胞，但此时主要为体积更小、染色更深的白细胞。在间情期（diastrous）阶段，几乎不存在或仅有极少数角化的鳞状上皮细胞，而残留的白细胞则大量存在。可见有核上皮细胞，可呈单个细胞或成簇出现。您可能会遇到的一个问题是尿液污染了涂片。若发生此情况，应丢弃该涂片，不可用于分期诊断。我们刚刚向您展示了如何进行阴道灌洗。采集样本后，对样本进行染色，并评估细胞类型，以确定分析时雌性小鼠动情周期的阶段。总结来说，在动情前期（PROEs），循环中17β-雌二醇水平达到峰值，这在阴道涂片样本中表现为大量形态完整的有核上皮细胞占主导。随后促卵泡激素水平的再次升高会触发排卵并进入动情期，此时阴道涂片中以角化的鳞状上皮细胞为主。在动情后期，孕酮水平上升。此阶段阴道涂片中存在的细胞类型包括碎裂的角化上皮细胞以及体积更小、染色较深的白细胞。在动情后期，随着黄体酮水平达到高峰，开始出现有核的上皮细胞，白细胞仍然存在。为确保雌性小鼠动情周期规律，并确定动情周期的长度，应每天进行评估，并连续观察两个完整周期。在不同小鼠中观察到较长的动情后期和动情间期阶段属于正常现象。希望这能为您的性别与激素相关研究提供帮助，祝您的实验顺利成功。

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Biology

生物学

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