Name: 小鼠生殖道黏膜淋巴细胞分离 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 46 s
Description: 学习使用胶原酶消化和Percoll梯度分离技术从小鼠生殖道中分离淋巴细胞的方法。该技术可用于流式细胞术表征，有助于研究生殖道免疫反应和疾病机制。

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我们感谢美国国立卫生研究院（NIH）提供的基金资助，项目编号为 R01-AI026328（KAK）和 R01-AI079004（KAK）。

1. 生殖道的摘除
<ol>
 <li>根据批准的指南实施小鼠安乐死。做低位正中切口并牵开皮肤。</li>
 <li>分离并完整取出从输卵管至阴道开口的整个生殖道。</li>
 <li>用剪刀沿纵轴方向将整个生殖道完全剪开。</li>
 <li>在含有完全RPMI-10/EDTA培养基的培养皿中（配方见下文），用精细手术剪将生殖道组织剪成细小碎片（约 &lt;1 mm），然后将组织转移至125 ml锥形瓶中，在室温下置于磁力搅拌器上搅拌15分钟。此步骤重复两次，之后弃去含有上皮细胞及其他碎片的上清液。</li>
 <li>将锥形瓶中的内容物通过细胞滤网（40 μm）过滤。用完全培养基冲洗残留的EDTA。 
 完全RPMI/10：RPMI 500 ml（Gibco），10% 胎牛血清（FBS），热灭活，青霉素/链霉素 5 ml，1 M HEPES 5 ml。 
 完全RPMI-10/EDTA：10% RPMI（同上）加入5 μM EDTA</li>
</ol>
2. 消化生殖道组织
<ol>
 <li>将组织块转移至含有 20 ml 新鲜 RPMI-10/胶原酶的新培养瓶中（见下文配方），并在 37 °C 下使用磁力搅拌器剧烈搅拌，消化 1 小时。 
 完全 RPMI-10/胶原酶：使用前，将胶原酶 VIII 型（Sigma；于 -20 °C 保存，或根据制造商说明）重悬，加入完全 RPMI/10 中，终浓度为 450–500 U/ml。</li>
 <li>第一次消化后，通过 100 μm 细胞筛过滤收集上清液，并将细胞置于冰上保存。</li>
 <li>将未消化的组织转移至新培养瓶，并使用新鲜的完全 RPMI-10/胶原酶重复步骤 2.1 两次，共进行三次独立的消化。此时，溶液中应无可见的组织块。</li>
 <li>合并来自同一样本的所有上清液，通过 100 μm 细胞筛过滤收集，离心沉淀细胞。细胞沉淀将通过 Percoll 梯度分离。</li>
</ol>
3. 使用 Percoll 梯度分离生殖道细胞
<ol>
 <li>使用前准备每种浓度的 Percoll：
 <ul>
 <li>100% 等渗 Percoll：按 9:1 的比例将 Percoll 原液（Pharmacia Biotech）与 10x PBS 混合，用 HCl 调节 pH 至 7.4。</li>
 <li>40% Percoll 溶液：将 40 ml 的 100% 等渗 Percoll 与 60 ml 完全 RPMI 培养基混合。</li>
 <li>70% Percoll 溶液：将 70 ml 的 100% 等渗 Percoll 与 30 ml 完全 RPMI 培养基混合。</li>
 </ul>
 </li>
 <li>将第 6 步所得的每个细胞沉淀重悬于 40% Percoll 溶液中。使用等体积的 70% Percoll 溶液以形成梯度。梯度管的制备有两种方法：
 <ol>
 <li>下层叠加法：先将含细胞的 40% Percoll 悬液加入梯度管中，然后小心地将 70% Percoll 从下方叠加。</li>
 <li>上层叠加法：先将 70% Percoll 加入离心管中，然后缓慢而轻柔地将含有细胞的 40% Percoll 溶液叠加在上层。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>梯度样品在室温下以 900 × g 离心 20 分钟，关闭刹车。</li>
 <li>淋巴细胞将位于 40% 与 70% Percoll 层之间的界面处。小心收集界面层，用 RPMI 按 1:3 比例洗涤，然后在 740 × g 下离心沉淀。淋巴细胞将存在于细胞沉淀中，可用于后续实验。</li>
</ol>
4. 代表性结果
从小鼠生殖道分离淋巴细胞并进行流式细胞术（FACS）分析的示例如图1所示。在经阴道感染Chlamydia muridarum的小鼠感染后第7天，取出其生殖道组织。将两只小鼠的生殖道组织合并，以获得足够数量的淋巴细胞用于FACS检测其功能和表型。分离的组织按照上述方法进行消化和细胞分离处理。单细胞悬液使用多种荧光素标记的抗小鼠CD3、CD4和CD8单克隆抗体进行染色。图1展示了在CD3阳性T淋巴细胞门控基础上，CD4阳性T细胞与CD8阳性T细胞的散点图。本方法可用于分析来自不同疾病模型小鼠生殖道的淋巴细胞，以评估小鼠模型中不同疾病状态下各种免疫细胞的功能和表型特征。这些免疫细胞包括树突状细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、NK细胞、NKT细胞、T细胞（抗原特异性T细胞）、B细胞等3-10。
<img alt="流式细胞术图示，CD4 与 CD8 细胞分布分析，免疫谱型结果。" src="/files/ftp_upload/4391/4391fig1.jpg" data-altupdatedat="1761830439000" data-alt="图 1"> 
图 1. 采用本文所述方法，从感染了Chlamydia muridarum的小鼠生殖道中分离出淋巴细胞。完成完整的分离步骤后，使用荧光染料标记的 CD3、CD4 和 CD8 抗体对淋巴细胞进行染色。象限数据基于 CD3+ 淋巴细胞设门，显示 CD4+ 与 CD8+ 细胞的分布情况及设门细胞的百分比。

<ol><li>M, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+perinatal+immune+development+on+mucosal+homeostasis+and+chronic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The impact of perinatal immune development on mucosal homeostasis and chronic inflammation.</a> Nat. Rev Immunol. 12, 9-23 (2011).</li>
<li>Centers for Disease Control and Prevention. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%222010+Sexually+Transmitted+Diseases+Surveillance%22">2010 Sexually Transmitted Diseases Surveillance</a>. , Centers for Disease Control and Prevention. (2010).</li>
<li>Jain, S., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+tandem+copies+of+conserved+gp41+epitopes+incorporated+in+gag+virus-like+particles+elicit+systemic+and+mucosal+antibodies+in+an+optimized+heterologous+vector+delivery+regimen%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Multiple tandem copies of conserved gp41 epitopes incorporated in gag virus-like particles elicit systemic and mucosal antibodies in an optimized heterologous vector delivery regimen.</a> Vaccine. 28, 7070-7080 (2010).</li>
<li>Tang, V. A., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravaginal+infection+with+herpes+simplex+virus+type-2+%28HSV-2%29+generates+a+functional+effector+memory+T+cell+population+that+persists+in+the+murine+genital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intravaginal infection with herpes simplex virus type-2 (HSV-2) generates a functional effector memory T cell population that persists in the murine genital tract.</a> J. Reprod. Immunol. 87, 39-44 (2010).</li>
<li>Gillgrass, A. E., Tang, V. A., Towarnicki, K. M., Rosenthal, K. L., Kaushic, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protection+against+genital+herpes+infection+in+mice+immunized+under+different+hormonal+conditions+correlates+with+induction+of+vagina-associated+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Protection against genital herpes infection in mice immunized under different hormonal conditions correlates with induction of vagina-associated lymphoid tissue.</a> J. Virol. 79, 3117-3126 (2005).</li>
<li>Sajic, D., Patrick, A. J., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+delivery+of+CpG+oligodeoxynucleotides+expands+functional+dendritic+cells+and+macrophages+in+the+vagina%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Mucosal delivery of CpG oligodeoxynucleotides expands functional dendritic cells and macrophages in the vagina.</a> Immunology. 114, 213-224 (2005).</li>
<li>Jiang, J. Q., Patrick, A., Moss, R. B., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%2B+T-cell-mediated+cross-clade+protection+in+the+genital+tract+following+intranasal+immunization+with+inactivated+human+immunodeficiency+virus+antigen+plus+CpG+oligodeoxynucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">CD8+ T-cell-mediated cross-clade protection in the genital tract following intranasal immunization with inactivated human immunodeficiency virus antigen plus CpG oligodeoxynucleotides.</a> J. Virol. 79, 393-400 (2005).</li>
<li>Gill, N., Chenoweth, M. J., Verdu, E. F., Ashkar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NK+cells+require+type+I+IFN+receptor+for+antiviral+responses+during+genital+HSV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">NK cells require type I IFN receptor for antiviral responses during genital HSV-2 infection.</a> Cell Immunol. 269, 29-37 (2011).</li>
<li>Thatte, A., DeWitte-Orr, S. J., Lichty, B., Mossman, K. L., Ashkar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+IL-15+in+TLR-mediated+innate+antiviral+immunity+against+genital+HSV-2+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A critical role for IL-15 in TLR-mediated innate antiviral immunity against genital HSV-2 infection.</a> Immunol. Cell Biol. 89, 663-669 (2011).</li>
<li>Kwant-Mitchell, A., Ashkar, A. A., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+innate+and+adaptive+immune+responses+against+herpes+simplex+virus+type+2+in+a+humanized+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Mucosal innate and adaptive immune responses against herpes simplex virus type 2 in a humanized mouse model.</a> J. Virol. 83, 10664-10676 (2009).</li>
<li>Gallichan, W. S., Rosenthal, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+the+estrous+cycle+on+local+humoral+immune+responses+and+protection+of+intranasally+immunized+female+nice+against+herpes+simplex+virus+type+2+infection+in+the+genital+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Effects of the estrous cycle on local humoral immune responses and protection of intranasally immunized female nice against herpes simplex virus type 2 infection in the genital tract.</a> Virology. , 224-487 (1996).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

本方案展示了如何从小鼠生殖道制备淋巴细胞，该方法易于掌握。此过程最关键的步骤是将细胞置于冰上以维持细胞活性。本方法获得的细胞数量取决于操作技术、操作技巧、小鼠的感染状态（未免疫或感染后某天）、病原体类型（细菌、病毒、真菌）以及所检测的小鼠生殖道部位（输卵管、子宫、阴道段或整个生殖道）。我们课题组及其他研究团队已发表多项关于小鼠生殖道不同淋巴细胞群体的研究5-7。据我们经验，一只未免疫的BALB/c小鼠的整个生殖道可获得约2×106个细胞，细胞活性可达90%。在许多情况下，所分离的淋巴细胞将用于进一步的功能分析和/或流式细胞术分析3-10。与常用的分离方法11相比，本方法的细胞得率提高了10倍。该操作流程相对较长，但可根据分离后淋巴细胞的后续用途进行简化。当细胞用于非功能性检测（如流式细胞术分析）时，可省略Percoll梯度离心步骤以缩短操作时间。本方法为研究黏膜淋巴细胞提供了强大而高效的工具，有助于感染性疾病研究，并推动后续疫苗的研发。

<table><tbody><tr><td>胶原酶</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>C2139-1G</td><td> </td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare Bio-Sciences</td><td>17-0891-01</td><td> </td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>11875</td><td> </td></tr></tbody></table>

从小鼠生殖道黏膜中分离淋巴细胞

Isolation of Lymphocytes from Mouse Genital Tract Mucosa

胃肠道、泌尿生殖道和呼吸道等黏膜表面为病毒和细菌等病原体提供了入侵门户 1黏膜也是宿主产生抗病原体免疫反应的诱导部位，例如肠道中的派伊尔集合淋巴结和呼吸道中的鼻相关淋巴组织。这一独特特性使黏膜免疫成为宿主防御系统中的关键组成部分。许多研究集中于胃肠道和呼吸道黏膜部位，但对生殖道黏膜部位的研究却较少。生殖道黏膜是性传播疾病（STD）包括细菌和病毒感染的主要感染部位。性传播疾病是当今世界面临的最严重的健康挑战之一。美国疾病控制与预防中心估计，美国每年有1900万例新的性传播感染病例，性传播疾病每年给美国医疗系统带来170亿美元的经济负担。 2，给个体带来更严重的即时及终身健康后果。为应对这一挑战，需要更深入地理解生殖道黏膜免疫，而分离淋巴细胞是此类研究的基本组成部分。本文介绍一种可重复地从小鼠雌性生殖道分离淋巴ocytes用于免疫学研究的方法，该方法可经修改后适用于其他物种。以下方法基于一只小鼠。

介绍了一种从小鼠生殖道中高效分离淋巴细胞的方法。该方法利用酶消化和Percoll梯度分离，实现高效的细胞分离。此技术也可适用于其他物种。

消化道、泌尿生殖道和呼吸道等黏膜表面为病毒等病原体提供了入侵门户。

本实验的总体目标是从小鼠生殖道中分离淋巴细胞。首先取出整个生殖道组织，并将组织剪切成小块，以释放其中的淋巴细胞。将充分剪碎的组织在37°C条件下，使用胶原酶Ⅷ并伴随剧烈搅拌进行消化处理。通过磁力搅拌，随后利用淋巴细胞分离液梯度离心分离淋巴细胞。最终，可通过流式细胞术对淋巴细胞进行表征。该技术的应用拓展至生殖系统疾病的诊断与治疗领域，因为此方法使我们能够了解组织淋巴细胞的行为特征，而这些淋巴细胞的行为通常与从循环系统中分离出的淋巴细胞有所不同。尽管该方法可为生殖黏膜系统提供研究视角，但也同样适用于肠道和呼吸道黏膜系统。处死一只雌性小鼠后，使用手术剪做低位正中切口，随后剪开皮肤。轻轻移开肠道，识别子宫颈（ucs），然后从子宫颈至阴道开口完整分离并取出整个生殖道。将生殖道放入培养皿中。使用剪刀沿纵轴方向完全剪开整个生殖道。然后将组织转移至含有完全 RPMI 10 培养基的培养皿中。现在将生殖道剪切成细小组织块，然后将组织块转移至含有完全RPMI 10和EDTA的烧瓶中。将烧瓶置于磁力搅拌器上，在室温下每次搅拌15分钟，共搅拌两次，以去除上皮细胞。最后一次搅拌结束后，弃去上清液，再将组织块通过40微米细胞滤网倒入50毫升锥形管中。用完全培养基冲洗残留的EDTA。现在将过滤后的组织块转移至含有新鲜RPMI 10和胶原酶的新培养瓶中，在37摄氏度下用磁力搅拌器进行消化，搅拌速度应调至剧烈搅拌。一小时后，将上清液通过100微米细胞筛网过滤至新的50毫升锥形管中，并将滤过的细胞悬液置于冰上保存。向原培养瓶中加入含胶原酶的新鲜RPMI 10，再用新鲜的完全RPMI 10和胶原酶分别重复搅拌消化两次。第三次消化后，溶液中应无可见的组织块残留。现在，将三次消化的上清液合并在一起。在410 ×g、4°C条件下离心5分钟，然后弃去上清液。用新鲜的40% Percoll溶液重悬细胞沉淀。将含40% per call的细胞悬液加入梯度离心管中，然后小心地在下层加入等体积新配制的70% per call。随后在室温下以刹车关闭的条件对梯度样品离心20分钟。离心后，小心收集 Percoll 梯度界面层中的淋巴细胞。随后，在室温下用 RPMI 1640 溶液洗涤回收的细胞 10 分钟。最后，弃去上清液，根据所需的实验步骤，将淋巴细胞重悬于适当的溶液中。该点图是从小鼠生殖道分离出的淋巴细胞群体的一个示例，该小鼠经阴道感染了沙眼衣原体。感染后第七天，将单细胞悬液通过CD3阳性淋巴细胞设门，并对表达CD4和CD8的细胞进行分析。该技术为研究人员探索生殖系统淋巴细胞功能以及模拟人类疾病的病毒小鼠疾病模型中的细胞特征奠定了基础。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

小鼠生殖道黏膜淋巴细胞分离

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