结合荧光染色体复制时序杂交
December 10th, 2012
染色体复制定时分析的定量方法进行说明。的方法，利用结合BrdU掺入荧光，杂交（FISH），以评估哺乳动物染色体的复制定时。这种技术允许在同一细胞重新排列和未重排的染色体直接比较。
这种实验方法将 BRDU 掺入与 C 2 杂交中的荧光相结合。定量分析哺乳动物染色体的复制时间。首先，将 BRDU 掺入活细胞中并收获中期染色体。
然后进行 DNA 鱼结合连续 BRDU 抗体染色，以鉴定单个复制染色体。接下来，使用照片显微镜捕获鱼类信号和 BRDU 掺入单个有丝分裂象的图像。使用 Cyto Vision 软件，计算每个分离染色体上 BRDU 或 DPI 信号表示的像素的面积和强度。
结果可以量化和比较 BRDU 掺入单个重排染色体及其全息中的掺入。因为这里描述的方法评估单个细胞，所以与最近开发的高通量微阵列和 DNA 测序方案相比，它能够检测复制的变化、染色体重排的时间，这些变化仅存在于群体中的一小部分细胞中。这种方法允许直接比较位于同一细胞内的同源染色体。
它还具有明确识别影响染色体复制的染色体重排的能力。证明该程序的整个染色体的时间将是 Leslie Smith。我实验室的一名研究助理将细胞以大约 70% 的汇合度接种在 150 毫米的组织培养皿中，并在适当的时间放入细胞培养箱中 24 小时。
收获前的积分。用每毫升 10 μg 的新鲜完全培养基补充培养基。BRDU.细胞在含有 BRDU 的培养基中培养的时间长度会因细胞类型和物种而异。
通常，G 2 期在 2 到 5 小时之间。从板中取出培养基，在 15 ml 锥形离心管中节省 10 mL。用 10 毫升正弦冲洗细胞，并通过真空抽吸去除剩余的正弦。
然后加入 5 毫升 0.25% 胰蛋白酶，并在室温下孵育，直到细胞从板中分离。收获细胞并将悬浮液转移到 10 毫升保留培养基中。通过离心沉淀细胞，吸出除 0.5 毫升外的所有培养基。
现在，使用移液管的过去使细胞渗透膨胀，将细胞彻底悬浮，加入三滴加热至 37 摄氏度的 75 毫摩尔氯化钾，然后将细胞悬液与移液管混合。然后加入额外的 0.5 毫升低渗溶液。现在将低渗溶液的总体积调至 5 毫升，并通过移液混合。
根据细胞类型，在 37 摄氏度下孵育细胞悬液 20 至 45 分钟。倾斜孵育试管以保持细胞悬浮。然后以 400 倍 G 离心 10 分钟。
吸出除 0.5 毫米外的所有上清液，并使用过去的搅拌移液管轻轻复苏悬浮细胞调色板。此时渗透性肿胀的细胞会很脆弱，因此应注意不要破坏细胞质膜。接下来，加入三滴汽车噪音、固定剂并轻轻混合。
再加入 0.5 mL 固定剂后，将固定剂的体积调至 5 mL，然后移液至均匀的细胞悬液中。这些固定的细胞可以在零下 20 摄氏度的黑暗中储存数月。通过离心收获固定细胞，吸出固定剂并将沉淀重悬于 10 体积的固定剂中，手持湿冰冷显微镜。
以大约 45 度角滑动。逐滴添加细胞悬液以铺展细胞悬液。用固定剂淹没载玻片并排出多余的部分。
然后将玻片平放在纸巾上风干。使用倒置显微镜评估样品是否存在有丝分裂扩散。向每张玻片中加入 2 微升 10 μg/mL RNAS A 的两张 XSSC 中，并在 37 摄氏度下孵育 1 小时。
在室温下对两个 XSSC pH 7.0 进行 3 次洗涤，每次 3 分钟。然后通过乙醇系列在室温下脱水样品 3 分钟。每次将样品在室温下风干到冷冻的微量离心管中。
加入 4 μg DNA 底物标记核苷酸、10 X NIC 翻译缓冲液、DNTP 混合物和 NIC 翻译酶。将反应在 16 摄氏度下孵育过夜，在 70 摄氏度下加热 10 分钟以终止反应。然后在冰上冷藏 5 分钟。
现在，为了乙醇沉淀 DNA，加入 48 微升三摩尔乙酸钠、160 微升 0.25 微升/微升捕获的 1D NA 和 1.2 毫升 100% 乙醇。将样品在负 80 摄氏度下储存 10 分钟过夜，离心沉淀 DNA，然后用 70% 乙醇洗涤沉淀，将风干的 DNA 探针重悬于 40 μL 双蒸水中，终浓度为每微升标记的背 DNA 100 ng，用于背 SEP 同时杂交。准备两个单独的婴儿床，1D NA，其中包含随附手稿中详述的探针混合物。
将探针混合物在 75 摄氏度下变性 10 分钟。然后在 37 摄氏度下孵育 30 分钟，以重复顺序排列。现在将背探针与 S 探针以 3：2 的比例组合，每个样品 25 μL。
滑动到旁边以使样品变性。将玻片浸入 72 摄氏度的 70% 形式的 amide two XSSC 中，孵育 3 分钟。立即通过 4 摄氏度的乙醇系列脱水样品 3 分钟。
每次在完成探针制备前约 10 分钟在室温下风干样品。在 45 摄氏度的玻片加热器上平衡玻片。然后加入 25 微升的后 S 探针混合物。
对于每个载玻片，轻轻放置盖玻片并沿所有边缘用橡胶水泥密封，用于杂交步骤。将样品在 37 摄氏度下在加湿室中孵育过夜。在 38 至 40 摄氏度下，在 50%IDE、两个 XSSC pH 7.0 中进行 3 次杂交后洗涤，每次 3 分钟。
洗涤的最佳温度取决于探针。如果存在高背景杂交，则提高洗涤液的温度。相反，如果探针的信号较弱且没有背景，则降低洗涤的温度。
在室温下在 PN 缓冲液中洗涤 1 次，持续 3 分钟。对于 BRDU 检测，向每张载玻片中加入 200 微升 PNM 封闭缓冲液。在室温下避光孵育 10 分钟，用纸巾沥干玻片。
然后加入 100 微升每毫升 50 微克的抗 B-R-D-U-F-E 偶联抗体，并在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。在室温下在 PN 缓冲液中进行 3 次 3 分钟的洗涤。从每张载玻片上去除多余的 PN 缓冲液。
然后加入 20 微升 dappy Antifa 封片剂。用纸巾盖住载玻片，然后按下盖玻片以挤出气泡和多余的安装液。使用连接到 CCD 相机的荧光显微镜捕获图像。
使用 100 倍物镜和自动滤光片转盘和细胞视觉软件，使用 fitzy 滤光片捕获 BRDU，并使用第三面或德克萨斯红滤光片捕获染色体漆背和着丝粒探针。也使用 dappy 过滤器进行细胞核染色。使用 Cyto Vision 软件中的反向 EP 或染色体特异性油漆探针识别感兴趣的单个染色体。
从中期扩散中切下每条感兴趣的染色体作为一个整体。将 DPI 和 FITZY 染色体图像复制并粘贴到新窗口中。在工具菜单中选择图形图标，该图标允许生成一个图形，表示沿每个单独染色体的 Fitz 和 dappy 染色的面积和强度。
这是通过在染色体的长度上从短臂到长臂画一条线来完成的。在工具菜单中，选择数据图标并生成一个表格，其中显示 ZI 和 dpi 的计算面积和强度。接下来，选择目标染色体的 ZI 和 DPI 信号。
然后单击表格图标上的强度和区域按钮。该软件为每个信号生成每平方英寸像素数的数值测量值。接下来，每条染色体的平均像素强度乘以这些像素所占据的面积。
为了获得用于可视化染色体最新复制区域的像素总数，请评估 BRDU 掺入的强盗模式，以积极复制染色体的区域。然后根据 BRDU 条带模式的差异计算染色体对之间复制时间的差异。哺乳动物细胞中的染色体根据时间程序进行复制，早期和晚期复制分别发生在 S 期的开始和结束。
哺乳动物细胞中的典型 sase 持续 8 到 10 小时，G 2 通常持续 2 到 5 小时。在这个实验系统中，添加 BRDU 的时间增加，以标记复制这些细胞的染色体的最后部分包含人类的缺失，因为位于 6 Q 16.1 处的 R 6 基因。用 BRDU 处理 5 小时后，收获有丝分裂细胞并处理用于 BRDU 掺入，并使用 6 号染色体油漆探针在 C 2 中进行荧光杂交，两个 6 号染色体显示三个荧光标记。
BRDU 条带模式的显着差异与六号染色体之一的复制时间延迟大于 2 小时一致。Cyto 视觉软件描述了两条 6 号染色体上 DPI 和 BRDU 的差异信号强度曲线，表明异步复制。此外，与 DPI 染色的类似分析相比，BRDU 掺入的总量存在显着差异。
包含包含人类作为 AR 6 基因的反向探针突出了该细胞中其长臂上包含缺失的单染色体 6。有趣的是，与非 ED 六号染色体相比，BRDU 掺入的 BRDU 掺入模式更强烈，BRDU 掺入的条带模式更广泛。当处理来自 7 个不同细胞的有丝分裂扩散时，以量化 6 号染色体之间的复制时间差异。
BRDU 水平显示缺失和非 ED 染色体 6 的总像素值之间的差异大于两倍。一旦掌握，这项技术可以在三天内正确执行。我们希望您现在对如何测量复制、驻留在同一细胞内的同源染色体的时间以及明确识别与复制改变相关的染色体重排有了很好的了解。
整个染色体的时间。
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概览
本文描述了一种定量方法，用于分析染色体复制时间，使用BrdU结合和荧光原位杂交（FISH）。该技术能够直接比较同一细胞内重排和未重排的染色体。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 遗传学
- 染色体动力学
背景
- 理解染色体复制时间对于洞察基因组稳定性至关重要。
- BrdU结合允许标记新合成的DNA。
- FISH提供了一种在染色体中可视化特定DNA序列的方法。
- 结合这些技术增强了复制过程中染色体行为的分析。
研究目的
- 开发一种定量评估哺乳动物染色体复制时间的方法。
- 比较重排与未重排染色体的复制时间。
- 提高对活细胞中染色体复制动力学的理解。
使用的方法
- 将BrdU结合到活细胞中。
- 收集中期染色体进行分析。
- 应用DNA FISH结合顺序BrdU抗体染色。
- 使用光学显微镜和软件分析FISH信号和BrdU结合的图像。
主要结果
- 成功识别单个复制染色体。
- 染色体类型之间复制时间差异的定量数据。
- 复制过程中染色体行为的可视化表现。
- 对染色体重排对复制时间的影响的洞察。
结论
- 该方法为研究染色体复制时间提供了一种稳健的方法。
- 直接比较可以增强对基因组稳定性的理解。
- 这种技术可能在遗传学研究中有更广泛的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Quantitative analysis of chromosome replication timing using BRDU incorporation and FISH enables direct, cell-by-cell comparison of homologous and rearranged chromosomes, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides predictive confidence for identifying chromosomal alterations that impact replication dynamics, which is critical for understanding genome stability in disease-relevant systems. The method's single-cell resolution and ability to detect rare chromosomal events enhance its value for portfolio triage and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of replication timing mechanisms at the single-cell level for functional target validation.
- Supports biological de-risking by distinguishing synchronous versus asynchronous replication in homologous chromosomes.
- Facilitates predictive confidence in linking chromosomal rearrangements to altered replication programs.
Screening & Assay Development
- Prepares validated chromosomal systems for downstream analysis of replication timing phenotypes.
- Delivers quantitative, reproducible outputs for comparing rearranged and un-rearranged chromosomes.
- Enables reliable detection of rare chromosomal events within heterogeneous cell populations.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models by identifying replication timing changes associated with chromosomal abnormalities.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by tracking replication dynamics in engineered or diseased chromosomes.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on mechanistic insights into genome stability.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing of replication timing, supporting lead identification, and informing translational biomarker strategies when chromosomal alterations are implicated.
- Discovery Biology: Quantifies replication timing differences to clarify pathway disruptions caused by chromosomal rearrangements.
- Screening: Provides assay-ready, quantitative outputs for comparing chromosome-specific replication timing.
- Analytics: Generates pixel-based intensity and area measurements for robust statistical comparison of chromosome pairs.
- Translational Research: Detects replication timing phenotypes relevant to disease models and chromosomal instability.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for evaluating replication timing across diverse chromosomal contexts and cell types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in chromosomal replication studies.
- Operational Value: Standardizes quantitative analysis and enhances reproducibility across experiments.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking chromosomal structure to replication timing phenotypes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and models based on genome stability insights.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cytogenetics, fluorescence microscopy, and image analysis software.
- Demands access to BRDU labeling, FISH reagents, and high-resolution imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation and data analysis protocols.
- Adaptable to various mammalian cell types but may require optimization for different chromosomal contexts.
- Limited by throughput compared to sequencing-based methods but offers unique single-cell resolution and allele specificity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:53
BrdU Incorporation: Terminal Labeling
2:35
Chromosome Harvest of Monolayer Cells Cultures
5:53
RNase Treatment and Ethanol Dehydration
6:38
Fluorescent Labeling BAC DNA: Nick Translation
8:19
In situ Hybridization
12:18
Capturing Images and Quantifying BrdU Incorporation
14:27
Results: Chromosome Replication Timing and FISH
16:45
Conclusion
