Name: 结合荧光染色体复制时序杂交 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 14 s
Description: 学习使用BrdU掺入与荧光原位杂交技术定量分析哺乳动物染色体复制时序的方法。该技术可在同一细胞内直接比较重排与未重排染色体的复制动态，为基因组稳定性研究提供可靠手段。

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本工作获得了美国国家癌症研究所资助项目 CA131967 的支持。

1. BrdU 掺入（末端标记）
<ol>
 <li>在添加 BrdU 前 24 小时，将细胞接种于 150 mm 组织培养皿中，使其贴壁至约 70% 汇合度。</li>
 <li>在收获前的适当时间点，更换为含 20 μg/ml BrdU（Sigma）的新鲜完全培养基。细胞在含 BrdU 培养基中培养的时间因细胞类型和物种而异，通常 G2 期持续 2 至 5 小时（图 1）。</li>
</ol>
2. 单层细胞培养物的染色体收获
<ol>
 <li>从培养板中移除培养基，并收集 10 ml 至 15 ml 锥形离心管中。弃去剩余培养基。</li>
 <li>用 10 ml Versine [或 HBSS (Sigma)] 将细胞冲洗一次。</li>
 <li>向培养板中加入 5 ml 含 0.25% 胰蛋白酶的 Versine（或 HBSS）。于室温孵育，直至细胞从培养板上脱落。</li>
 <li>将胰蛋白酶消化后的细胞悬液加入步骤 2.1 中含有 10 ml 培养基的离心管中。</li>
 <li>以 400 × g 离心 10 分钟，使细胞沉淀。吸除上清液，保留 0.5 ml 培养基及细胞沉淀。</li>
 <li>用巴斯德移液管充分重悬细胞。</li>
 <li>加入 3 滴低渗溶液（0.075 M KCl (Sigma)，预热至 37 °C）；用巴斯德移液管混匀细胞悬液。再加入 0.5 ml 低渗溶液，再次用巴斯德移液管混匀。将低渗溶液体积补至 5 ml，再用巴斯德移液管混匀一次。根据细胞类型，在 37 °C 孵育 20–45 分钟。</li>
 <li>以 400 × g 离心 10 分钟。吸除上清液，保留 0.5 ml 培养基及细胞沉淀。</li>
 <li>通过轻轻弹击离心管使细胞沉淀重悬。此时细胞因渗透压膨胀而较为脆弱，因此需小心操作，避免破坏细胞膜。</li>
 <li>加入 3 滴卡诺氏固定液（冰醋酸:甲醇 = 1:3）；用巴斯德移液管轻轻吹打混匀。再加入 0.5 ml 固定液，再次用巴斯德移液管轻轻吹打混匀。将固定液体积补至 5 ml，再用巴斯德移液管轻轻吹打混匀。固定后的细胞可在避光条件下于 -20 °C 保存数月。</li>
 <li>参照步骤 2.8 进行离心和吸除上清。</li>
 <li>将细胞沉淀用新鲜固定液重悬；估计沉淀体积，并加入约 10 倍体积的卡诺氏固定液。</li>
 <li>将细胞悬液逐滴加至湿润且预冷的载玻片上；手持载玻片呈约 45° 角，使细胞悬液沿玻片表面流动。将玻片平放于纸巾上，用固定液充分覆盖玻片并自然晾干。使用倒置显微镜检查玻片上是否存在有丝分裂展片。</li>
</ol>
3. RNase 处理与乙醇脱水
<ol>
 <li>向每张载玻片加入 200 μl 含 10 μg/ml RNase A（Sigma）的 2x SSC 溶液；在 37 °C 下孵育 1 小时。</li>
 <li>在室温下用 2x SSC（pH 7.0）洗涤载玻片 3 次，每次 3 分钟。</li>
 <li>将载玻片在室温下依次经乙醇（Sigma）系列（70%、90% 和 100%）脱水处理，每步 3 分钟。</li>
 <li>在室温下将载玻片空气干燥。</li>
</ol>
4. 用于BAC加染色体特异性着丝粒计数探针（CEP）或全染色体涂染原位杂交的探针混合物的制备
<ol>
 <li>对于 BAC/CEP 同时杂交，需分别配制两种不同的探针混合液用于预杂交。我们发现，在不同杂交强度条件下分别对 BAC 和 CEP 探针进行预杂交，可降低背景信号并提高信号强度。此外，我们还发现单个 Fosmid 可替代 BAC 克隆使用。以下所述的混合液配制方案适用于单张载玻片；若使用相同探针对多张载玻片进行处理，可按比例相应增加体积。
 *BAC DNA 探针混合液： 
 11.5 μl 杂交缓冲液（50% 甲酰胺（Sigma）/2x SSC /硫酸葡聚糖（Sigma）） 2 μl dH2O
 2.5 μl BAC/Cot1 DNA 溶于 dH2O 中（标记方案见下文） 总体积 15 μl 
 *CEP 探针混合液： 
 7 μl CEP 杂交缓冲液（65% 甲酰胺/2x SSC/硫酸葡聚糖） 2 μl dH2O 
 1 μl CEP/Cot1 DNA（购自商业来源，已预先标记为 Spectrum Orange/Cy3/德克萨斯红） 总体积 10 μl 
 *在变性及预杂交（步骤 5.1）后，按 3:2 的比例混合 BAC 探针与 CEP 探针，每张载玻片加入 25 μl，并充分混匀探针混合液。 
 或者</li>
 <li>将 20 μl/张的全染色体涂染探针（Cy3/德克萨斯红）分装至离心管中。随后进行变性及预杂交步骤。</li>
</ol>
5. 载玻片与探针变性及 原位 杂交
<ol>
 <li>将探针混合物在 75 °C 下变性 10 分钟。在 37 °C 下预杂交 30 分钟，使 Cot1 DNA 与重复序列结合，防止其后续与中期染色体发生杂交。</li>
 <li>将载玻片置于 Coplin 染色缸中的 70% 甲酰胺/2x SSC（pH 7.0）溶液中，在 72 °C 下变性 3 分钟。</li>
 <li>立即在 4 °C 的 Coplin 染色缸中依次通过乙醇系列（70%、90% 和 100%）进行脱水处理，每步 3 分钟。</li>
 <li>让载玻片在室温下自然干燥。</li>
 <li>在探针预杂交步骤（步骤 5.1）的最后 10 分钟内，将载玻片在载玻片加热板上预热至 45 °C。根据需要混合预杂交后的探针混合物，每张载玻片加入 25 µl；轻轻盖上盖玻片，并用橡胶胶水密封所有边缘。置于湿化 chamber 中 37 °C 过夜孵育，防止蒸发。</li>
</ol>
6. 杂交后洗涤
<ol>
 <li>在 Coplin 染色缸中用 50% 甲酰胺/2x SSC（pH 7.0）溶液于 38–40 °C 下洗涤载玻片，每次 3 分钟，共洗涤 3 次。不同探针的洗涤温度可能有所不同。如果杂交背景较高，可适当提高洗涤温度；反之，若信号微弱且无背景，则可降低洗涤温度。</li>
 <li>在室温下用 PN 缓冲液洗涤载玻片 1 次，每次 3 分钟，随后进入 BrdU 检测步骤。</li>
</ol>
7. BrdU 检测
<ol>
 <li>在室温避光条件下，用 PNM 缓冲液封闭载玻片 10 分钟（每张载玻片 200 μl）。</li>
 <li>将载玻片边缘朝下置于纸巾上以沥干；每张载玻片加入 100 μl 抗 BrdU-FITC 抗体（Roche 或 Millipore，50 μg/ml）溶于 PNM 缓冲液中，37 °C 下孵育 30 分钟。</li>
 <li>用 PN 缓冲液在室温下洗涤载玻片 3 次，每次 3 分钟。</li>
 <li>逐张将载玻片边缘朝下置于纸巾上，去除多余的 PN 缓冲液；每张载玻片加入 20 μl DAPI/抗荧光淬灭封片液（Invitrogen）。盖上纸巾后轻压盖玻片，以排出气泡和多余封片液。随后进行图像分析。</li>
</ol>
8. 捕获图像并定量分析 BrdU 掺入
<ol>
 <li>使用 Olympus BX61 荧光显微镜、Olympus CCD 相机、100 倍物镜、自动滤光轮和 Cytovision 软件（Applied Imaging）采集图像。BrdU 使用 FITC 滤光片采集；染色体涂染探针（Texas Red，Metasystems 或 Cytocell）、BAC 探针（Cy3）和 CEP 探针（Vysis Spectrum Orange）使用 Texas Red 或 Cy3 滤光片采集；DAPI 使用 DAPI 滤光片采集（参见 图2和图3).</li>
 <li>感兴趣的单个染色体通过 BAC/CEP 或染色体特异性着色探针进行鉴定（图2B和图3B）。利用 Cytovision 软件，将每条感兴趣的染色体作为一个整体从中期 spreads 中“剪切”出来，并沿染色体从短臂到长臂的全长画一条线图2C和图3C）。使用Cytovision软件对每条染色体全长上的像素强度分布进行定量分析。Cytovision软件计算像素所占据的面积，并量化每条分离染色体上由BrdU或DAPI信号所代表的像素强度。随后，将每条染色体所代表的平均像素强度乘以这些像素所占据的面积，以获得总像素数（表1和图4。此外，本方案还可用于可视化染色体上最晚复制的区域。因此，通过BrdU掺入的条带模式可检测染色体的活跃复制区域，而染色体对之间复制时间的差异则表现为条带模式的差异。图2和图3最后，可将这些结合模式的差异与各染色体已知的复制时间图谱进行比较6,7，可用于估算同源染色体或染色体臂之间的复制时间差异4例如，两条6号染色体中的 图3A 显示带型模式的差异 &gt;与6号染色体正常的复制时间相比延迟2小时4. 
 此外，类似于此处所述的方法已成功用于研究失活与活性X染色体之间的异步复制时序8,9使用X染色体荧光涂染法鉴定活性与非活性X染色体。采用Quips mFISH软件（Vysis）采集图像，随后利用NIH Image软件计算X染色体所占像素数以及荧光标记的BrdU所占像素数。<a href="http://rsb.info.nih.gov/nihimage" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/nih-image/index.html</a>).</li>
</ol>
9. BAC DNA 的荧光标记缺口平移法（Vysis）
<ol>
 <li>向一个预冷的微量离心管中加入以下探针混合物： 
 70 μl（4 μg DNA）dH2O 
 10 μl 0.2 mM dUTP-Orange 或 Green 
 20 μl 0.1 mM dTTP 
 20 μl 10x Nick Translation Buffer 
 40 μl NT dNTP（不含dTTP） 
 40 μl nick Translation酶 
 总体积200 μl 
 在16 °C下孵育过夜。于70 °C加热10分钟以终止反应。冰上冷却5分钟。</li>
 <li>通过向探针混合物中加入以下成分进行DNA乙醇沉淀： 
 200 μl探针溶液 
 48 μl 3 M NaOAc 
 160 μl Cot1DNA（0.25 μg/μl） 
 1,200 μl 100% EtOH</li>
 <li>在-80 °C下保存10分钟至过夜。</li>
 <li>在4 °C下以12,000 × g离心20分钟。倾去上清EtOH。用70% EtOH洗涤一次。按前述条件再次离心。倾去EtOH。风干至乙醇完全挥发。用40 μl dH2O重悬，得到BAC DNA终浓度为100 ng/μl。</li>
</ol>

<ol><li>Payer, B., Lee, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X+chromosome+dosage+compensation%3A+how+mammals+keep+the+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">X chromosome dosage compensation: how mammals keep the balance.</a> Annu. Rev. Genet. 42, 733-772 (2008).</li>
<li>Breger, K. S., Smith, L., Turker, M. S., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizing+radiation+induces+frequent+translocations+with+delayed+replication+and+condensation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Ionizing radiation induces frequent translocations with delayed replication and condensation.</a> Cancer Research. 64, 8231-8238 (2004).</li>
<li>Smith, L., Plug, A., Thayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+Replication+Timing+Leads+to+Delayed+Mitotic+Chromosome+Condensation+and+Chromosomal+Instability+of+Chromosome+Translocations%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Delayed Replication Timing Leads to Delayed Mitotic Chromosome Condensation and Chromosomal Instability of Chromosome Translocations.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 13300-13305 (2001).</li>
<li>Stoffregen, E. P., Donley, N., Stauffer, D., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+autosomal+locus+that+controls+chromosome-wide+replication+timing+and+mono-allelicexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">An autosomal locus that controls chromosome-wide replication timing and mono-allelicexpression.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 2366-2378 (2011).</li>
<li>Breger, K. S., Smith, L., Thayer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+translocations+with+delayed+replication%3A+evidence+for+cis+control+of+chromosome+replication+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Mol.+Genet%22%5BJournal%5D)">Engineering translocations with delayed replication: evidence for cis control of chromosome replication timing.</a> Hum. Mol. Genet. 14, 2813-2827 (2005).</li>
<li>Camargo, M., Cervenka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+DNA+replication+of+human+chromosomes.+II.+Replication+map+and+replication+model%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Patterns of DNA replication of human chromosomes. II. Replication map and replication model.</a> Am. J. Hum. Genet. 34, 757-780 (1982).</li>
<li>Cohen, S. M., Cobb, E. R., Cordeiro-Stone, M., Kaufman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+chromosomal+bands+replicating+early+in+the+S+phase+of+normal+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Identification of chromosomal bands replicating early in the S phase of normal human fibroblasts.</a> Exp. Cell Res. 245 (98), 321-329 (1998).</li>
<li>Diaz-Perez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+element%28s%29+at+the+nontranscribed+Xist+locus+of+the+active+X+chromosome+controls+chromosomal+replication+timing+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The element(s) at the nontranscribed Xist locus of the active X chromosome controls chromosomal replication timing in the mouse.</a> Genetics. 171, 663-672 (2005).</li>
<li>Diaz-Perez, S. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deletion+at+the+mouse+Xist+gene+exposes+trans-effects+that+alter+the+heterochromatin+of+the+inactive+X+chromosome+and+the+replication+time+and+DNA+stability+of+both+X+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A deletion at the mouse Xist gene exposes trans-effects that alter the heterochromatin of the inactive X chromosome and the replication time and DNA stability of both X chromosomes.</a> Genetics. 174, 1115-1133 (2006).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).</li>
<li>Schlesinger, S., Selig, S., Bergman, Y., Cedar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allelic+inactivation+of+rDNA+loci%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Allelic inactivation of rDNA loci.</a> Genes Dev. 23, 2437-2447 (2009).</li>
<li>Mitelman Database of Chromosome Aberrations in Cancer. , Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman">http://cgap.nci.nih.gov/Chromosomes/Mitelman</a> (2006).</li>
<li>Branzei, D., Foiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+checkpoint+response+to+replication+stress%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair+%28Amst%29%22%5BJournal%5D)">The checkpoint response to replication stress.</a> DNA Repair (Amst). 8, 1038-1046 (2009).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

制备染色体铺展是本文所述复制时序检测成功的关键步骤。在低渗处理前加入秋水仙胺预处理步骤，可能有助于提高有丝分裂细胞的出现频率及其铺展效果。我们通常在收获细胞前用秋水仙胺处理1–3小时，终浓度为10 µg/mL。然而，加入秋水仙胺预处理步骤可能改变G2期的长度，从而可能影响染色体的表观复制时序及其凝缩状态3。
通过调整 BrdU 孵育时间（取决于细胞周期持续时间），该方法可应用于多种不同细胞类型和物种。对于大多数人和小鼠细胞系，G2 期通常为 3–6 小时；因此，BrdU 处理时间通常在此范围内。另一种替代 BrdU 的试剂是 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU），其后续检测可通过荧光叠氮化物与“点击化学”反应实现10。EdU 检测方法相较于 BrdU 检测具有多项优势。例如，EdU 检测无需样本固定或 DNA 变性。因此，使用 EdU 评估复制时序时，可结合简单的 G 显带技术而非荧光原位杂交（FISH）来鉴定目标染色体。
本文所述的复制时间程序专门设计用于检测晚S期以及延伸至G...

<table><tbody><tr><td>抗-BrdU-FITC</td><td>Roche Millipore</td><td>11202593001 MAB326F</td><td>50 &amp;mu;克/升&amp;mu;l</td></tr><tr><td>缺口平移试剂盒</td><td>Abbott Molecular (Vysis)</td><td>07J00-0001</td><td></td></tr><tr><td>Spectrum Orange dUTP</td><td>Abbott Molecular (Vysis)</td><td>02N33-050</td><td></td></tr><tr><td>着丝粒探针</td><td>Abbott Molecular (Vysis)</td><td>不同</td><td></td></tr><tr><td>LSI/WCP 杂交缓冲液</td><td>Abbott Molecular (Vysis)</td><td>06J67-011</td><td></td></tr><tr><td>CEP杂交缓冲液</td><td>Abbott Molecular (Vysis)</td><td>07J36-001</td><td></td></tr><tr><td>染色体涂染</td><td>MetaSystems 集团</td><td>D-14NN-050-TR</td><td></td></tr><tr><td>奥林巴斯BX61荧光显微镜</td><td>Olympus</td><td>BX61TRF-1-5</td><td></td></tr><tr><td>显微镜成像软件系统</td><td>应用成像</td><td>Cytovision 3.93.1</td><td></td></tr><tr><td>数码相机</td><td>Olympus</td><td>UCMAD3</td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> &lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;&lt;em&gt;原位&lt;/em&gt; 杂交反应配方&lt;br/&gt; 甲酰胺溶液&lt;br/&gt; &lt;em&gt;70% 甲酰胺/2x SSC&lt;/em&gt;&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;35 ml 甲酰胺*（Sigma）&lt;br/&gt; 10 ml 10x SSC&lt;br/&gt; 5 ml d&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;0&lt;br/&gt; 用 HCl（Sigma）调节 pH 至 7.0&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;* 必须使用储存在 -20℃ 的甲酰胺 &amp;deg;C. 长时间室温储存会产生甲酸，导致pH过低。&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;em&gt;&lt;strong&gt;50% 甲酰胺/2x SSC&lt;/strong&gt;&lt;/em&gt;&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;25 ml 甲酰胺（Sigma）&lt;br/&gt; 10 ml 10× SSC&lt;br/&gt; 15 ml dH₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;br/&gt; 用 HCl（Sigma）调节 pH 至 7.0&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_step&quot;&gt;&lt;em&gt;20x SSC，4 L&lt;/em&gt;&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;702 g NaCl (Sigma)&lt;br/&gt; 358 g 柠檬酸钠（Sigma）&lt;br/&gt; dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O至体积&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;PN缓冲液 [0.1 M NaP0&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 0.1% NP-40&lt;/strong&gt; （Sigma）&lt;strong&gt;]&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;JoVE 内容&quot;&gt;配制 0.1 M 的磷酸钠溶液 &lt;strong&gt;（经滤膜除菌后，分装保存于500 ml等分试样中）。&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;&lt;em&gt;0.1 M NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;P0&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; ，1 L&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;13.8 g &lt;strong&gt;NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;P0&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;/strong&gt; （Sigma）：&lt;br/&gt; dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O至体积&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;&lt;em&gt;0.1 M NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;P0&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 1 L&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;14.2 g &lt;strong&gt;NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;P0&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&lt;/strong&gt; (Sigma)&lt;br/&gt; &lt;em&gt;dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O至体积。&lt;/em&gt;&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;JoVE 内容&quot;&gt;&lt;strong&gt;PN：调节 0.1 M Na 的 pH 值&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HP0&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 用0.1 M NaH调至pH 8.0&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;P0&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;过滤除菌后加入1 ml NP-40。&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;&lt;em&gt;PNM 50 ml&lt;/em&gt;&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;1.25 g 脱脂奶粉（Sigma）&lt;br/&gt; 25 ml PN缓冲液（见上文配方）&lt;/p&gt; &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;持续搅拌混合15-20分钟。以400 × g离心两次，每次10分钟。取上清液使用，并注意不要扰动已沉淀的牛奶蛋白。&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

染色体复制时间分析与荧光原位杂交相结合

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

哺乳动物的DNA复制在S期的不同时间沿染色体上的多个位点启动，遵循一种时序性的复制程序。复制时序的确定被认为是一个动态过程，受到组织特异性和发育信号的调控，这些信号对表观遗传修饰具有响应性。然而，调控DNA复制在染色体上启动位置和时间的机制仍知之甚少。同源染色体通常同步复制，但这一规则存在显著例外。例如，在雌性哺乳动物细胞中，两条X染色体中的一条通过一种称为X染色体失活的过程变为晚期复制1。伴随着这种复制时序的延迟（估计为2-3小时），其中一条X染色体上的大多数基因发生转录沉默。此外，一个被称为X失活中心的特定顺式作用位点调控这一X染色体失活过程，包括诱导整个失活X染色体的复制时序延迟。此外，在癌细胞以及暴露于电离辐射的细胞中发现的某些染色体重排，表现出显著的复制时序延迟（>3小时），并影响整条染色体2,3。我们实验室近期的研究表明，破坏特定的常染色体顺式作用位点会导致整条染色体出现极晚期复制的表型4。其他“染色体工程”研究也表明，影响多种不同染色体的某些染色体重排会导致这种异常的复制时序表型，提示所有哺乳动物染色体均含有控制各条染色体正常复制时序的特定顺式作用位点5。
本文介绍了一种将染色体复制时间的定量分析与荧光原位杂交相结合的方法。该方法可在同一细胞内直接比较同源染色体之间的复制时间，其改编自文献6。此外，该方法能够明确识别与影响整条染色体复制时间变化相关的染色体结构重排。相较于近期开发的高通量微阵列或测序技术，本方法具有优势，后者无法区分存在于结构重排与未重排染色体上的同源等位基因。此外，由于本方法针对单个细胞进行分析，因此能够检测到仅在细胞群体中部分细胞存在的染色体结构重排所引发的染色体复制时间变化。

人类6号染色体复制时间分析的一个示例如下所示 图2. 缺失 ASAR6 基因的细胞4位于6q16.1的染色体区域经BrdU处理5小时后，收集有丝分裂细胞，并使用染色体6全涂探针（Vysis）进行FISH检测及BrdU掺入分析。请注意，两条6号染色体之间的BrdU带型存在显著差异，这与复制时间延迟的现象一致 &gt;2 小时，针对 6 号染色体中的一个 [参见4 染色体6在缺失前的复制时间带型。此外，与DAPI染色的类似分析相比，BrdU掺入总量（像素）存在显著差异。图 2D).
人类6号染色体复制时间分析的另一个示例如下所示 图3. 含有 ASAR6 基因相同缺失的细胞4 显示如果 图2 暴露于BrdU中5小时，收集有丝分裂细胞，并使用染色体6着丝粒探针及包含ASAR6基因的BAC探针进行FISH处理，同时检测BrdU掺入情况。注意，缺失的染色体6（Δ6）显示出比未缺失的染色体6更高...

一种用于分析染色体复制时间的定量方法。该方法利用溴脱氧尿苷（BrdU）掺入与荧光 原位 杂交（FISH）来评估哺乳动物染色体的复制时序。该技术可在同一细胞内直接比较发生重排与未发生重排的染色体。

哺乳动物DNA复制遵循时序性复制程序，在S期的不同时间点沿染色体上的多个位点起始。复制时序的确定被认为是一个动态过程，受组织特异性和发育信号调控，并对表观遗传修饰具有响应性。然而，调控DNA复制在染色体上起始位置和时间的机制仍知之甚少。同源染色体通常同步复制，但该规律存在显著例外。例如，在雌性哺乳动物细胞中，两条X染色体中的一条通过一种称为X染色体失活的过程变为晚期复制。伴随着约2-3小时的复制时序延迟，其中一条X染色体上的大多数基因发生转录沉默。此外，一个明确的顺式作用位点，即X失活中心，调控这一X染色体失活过程，包括诱导整条失活X染色体的复制时序延迟。此外，在癌细胞以及暴露于电离辐射的细胞中发现的某些染色体重排，表现出显著的复制时序延迟（>3小时），影响整条染色体。我们实验室近期的研究表明，破坏特定的常染色体顺式作用位点会导致影响整条染色体的极晚期复制表型。其他“染色体工程”研究也显示，影响多条不同染色体的某些染色体重排会导致这种异常的复制时序表型，提示所有哺乳动物染色体均含有调控各自正常复制时序的特定顺式作用位点。本文介绍一种结合荧光原位杂交技术的染色体复制时序定量分析方法。该方法可实现同一细胞内同源染色体间复制时序的直接比较，并改编自文献6。此外，该方法能够明确识别与整条染色体复制时序改变相关的染色体结构重排。相较于近期发展的高通量微阵列或测序方案（无法区分存在于重排与未重排染色体上的同源等位基因），本方法具有优势。同时，由于本方法针对单个细胞进行分析，因此能够检测仅在群体中部分细胞存在的染色体重排所引发的染色体复制时序变化。

该实验方法将BrdU掺入与荧光原位杂交相结合，用于定量分析哺乳动物染色体的复制时间。首先，将BrdU掺入活细胞中，然后收获中期染色体。然后进行DNA荧光原位杂交（FISH），并结合连续的溴脱氧尿苷（BrdU）抗体染色，以鉴定单个正在复制的染色体。接着，利用光学显微镜拍摄各个有丝分裂相中FISH信号和BrdU掺入的图像。使用CytoVision软件，计算每条分离染色体上由BrdU或DPI信号所代表的像素面积和强度。结果可以定量并比较单个重排染色体及其对应完整染色体中的BrdU掺入情况。由于本文所述方法针对单个细胞进行评估，因此能够检测出在细胞群体中仅有部分细胞存在的染色体重排事件的复制时序变化，而相比之下，近期发展的高通量微阵列和DNA测序方案则难以实现。该方法允许对同一细胞内的同源染色体进行直接比较。它还能够明确识别影响染色体复制的染色体重排。演示该实验步骤的将是我的实验室研究助理 Leslie Smith。在150毫米组织培养皿中以约70%的融合度接种细胞，并在适当时间置于细胞培养箱中培养24小时。收获前的培养时间点。用含有10微克/毫升BrdU的新鲜完全培养基更换培养基。细胞在含BrdU培养基中培养的时间长短取决于细胞类型和物种。通常，G2期持续两到五小时。从培养板中移除培养基，保留10毫升于15毫升锥形离心管中。用10毫升PBS洗涤细胞，然后通过真空抽吸除去残留的PBS。然后加入5毫升0.25%胰蛋白酶，在室温下孵育，直至细胞从培养皿上脱落。收集细胞并将悬液转移至含有10毫升保留培养基的容器中。通过离心沉淀细胞，吸除上清液，仅保留0.5毫升培养基。现在用移液枪充分重悬细胞，以渗透性地使细胞膨胀，加入三滴预热至37摄氏度的75毫摩尔氯化钾溶液，并用移液枪混匀细胞悬液。然后加入额外的0.5毫升低渗溶液。现在将低渗溶液的总体积补至5毫升，并通过移液操作混匀。根据细胞类型，将细胞悬液在37摄氏度下孵育20至45分钟。将试管倾斜孵育，以保持细胞处于悬浮状态。然后在400 × g下离心10分钟。吸除上清液，仅保留0.5毫米。使用一次性塑料移液管轻轻重悬细胞团块。此时细胞因渗透压膨胀而较为脆弱，因此需小心操作，避免破坏细胞质膜。接着，加入三滴卡诺固定液（car noise fixative），并轻轻混匀。加入额外的 0.5 毫升固定液后，将固定液体积补至 5 毫升，并吹打形成均匀的细胞悬液。这些固定的细胞可在避光条件下于负 20 摄氏度保存数月。通过离心收集固定后的细胞，吸除固定液，并将沉淀重悬于 10 倍体积的冰冷固定液中，保持在湿冰上的低温显微镜载片环境中。以约45度角倾斜载玻片。将细胞悬液逐滴加入，以铺展细胞悬液。用固定液淹没载玻片，然后吸去多余液体。然后将载玻片平放在纸巾上自然晾干。使用倒置显微镜观察样品中是否存在有丝分裂相。在每张载玻片上加入2微升含有10微克/毫升RNase A的2×SSC溶液，于37摄氏度孵育1小时。在室温下用2×SSC（pH 7.0）溶液洗涤三次，每次三分钟。然后在室温下通过乙醇系列脱水，每次三分钟。最后将各样品在室温下空气干燥后转移至预冷的微量离心管中。加入4微克标记了核苷酸的DNA底物、10倍NIC转录缓冲液、dNTP混合物和NIC转录酶。在16摄氏度下孵育反应过夜，然后在70摄氏度加热10分钟以终止反应。随后在冰上冷却5分钟。现在通过乙醇沉淀DNA，加入48微升3摩尔的醋酸钠、160微升浓度为0.25微克/微升的cot-1 DNA以及1.2毫升100%乙醇。将样品置于-80摄氏度下保存10分钟至过夜，通过离心沉淀DNA，再用70%乙醇洗涤沉淀物，将空气干燥后的DNA探针重悬于40微升双蒸水中，得到终浓度为100纳克/微升的标记后向DNA，用于后向SEP同时杂交。根据随附的手稿详细说明，配制两种不同的含有cot-1 DNA的探针混合液。将探针混合物在 75 摄氏度下变性 10 分钟。然后在 37 摄氏度下孵育 30 分钟，使 cot-1 DNA 与重复序列结合。现在将反向探针与 S 探针按 3:2 的比例混合，每份样本加入 25 微升。将载玻片并列以变性样品。将载玻片浸入70%甲酰胺、2×SSC溶液中，在72°C下孵育3分钟。立即在4°C条件下依次通过乙醇系列对样品进行脱水，每次3分钟。在探针制备即将完成前约10分钟，将各样品于室温下风干。将玻片置于45摄氏度的玻片加热台上平衡，然后加入25 µL的back S探针混合液。每个载玻片上轻轻盖上盖玻片，并用橡胶胶水将边缘完全密封，以进行杂交步骤。将样本置于湿化 chamber 中，于 37 摄氏度孵育过夜。在 38 至 40 摄氏度条件下，使用 50% IDE 两倍浓度的 SSC 缓冲液（pH 7.0）进行三次杂交后洗涤，每次三分钟。洗涤的最适温度取决于探针。如果杂交背景较高，则应提高洗涤温度。相反，如果探针信号较弱且无背景，则应降低洗涤温度。在室温下用PN缓冲液洗涤一次，持续三分钟。进行BRDU检测时，向每张载玻片加入200微升PNM封闭缓冲液。在室温避光条件下孵育10分钟，然后将载玻片在纸巾上沥干。然后加入100微升浓度为50微克/毫升的抗B-R-D-U-F-E偶联抗体，在37摄氏度孵育30分钟。在室温下用PN缓冲液洗涤三次，每次3分钟。移除每张载玻片上多余的PN缓冲液。然后加入 20 µL 的 DAPI 抗荧光淬灭封片液。用纸巾覆盖载玻片，并轻压盖玻片以排出气泡和多余的封片液。使用连接 CCD 相机的荧光显微镜采集图像。使用100倍物镜、自动滤光轮和Cyto Vision软件，通过Fitzy滤光片捕获BrdU信号，使用Side Three或Texas Red滤光片捕获染色体涂染探针和着丝粒探针信号。同时使用Dappy滤光片进行细胞核染色。在Cyto Vision软件中，利用Back EP或染色体特异性涂染探针识别目标染色体。将中期 spreads 中每条目标染色体整体剪下。将 DPI 和 FITZY 染色体图像复制并粘贴到新窗口中。在工具菜单中选择图表图标，该功能可生成一条曲线图，显示 Fitz 和 dappy 染色在每条单个染色体上的面积和强度分布情况。通过从染色体的短臂到长臂沿其长度画一条线来完成此操作。在工具菜单中，选择数据图标并生成一个表格，显示 ZI 和 dpi 计算出的面积和强度。接下来，选择目标染色体的 ZI 和 DPI 信号。然后点击表格图标上的强度和面积按钮。软件会为每个信号生成每平方英寸像素数的数值测量结果。接下来，将每条染色体的平均像素强度乘以这些像素所占的面积。为了获得用于可视化染色体最新复制区域的总像素数，需评估染色体活跃复制区域中BrdU掺入的带型模式。然后根据BrdU带型模式的差异，计算染色体对之间复制时间的差异。哺乳动物细胞中的染色体按照时间程序进行复制，早期复制和晚期复制分别发生在S期的起始和末期。在哺乳动物细胞中，一个典型的S期持续八到十小时，而G2期通常为两到五小时。在此实验系统中，加入BrdU的时间逐渐延长，以标记染色体中最后复制的部分。这些细胞缺失了位于6q16.1的人源ASAR6基因。经过五小时的BrdU处理后，收集有丝分裂期细胞，并对其进行BrdU掺入检测以及使用6号染色体全染探针的荧光原位杂交分析，结果显示两条6号染色体均显示出三个荧光信号标记。BrdU带型模式的显著差异与其中一条六号染色体复制时间延迟超过两小时的结果一致。Cyto Vison软件显示了两条六号染色体上DPI和BrdU的信号强度分布存在差异，提示复制不同步。此外，与DPI染色的类似分析相比，BrdU掺入总量也存在显著差异。包含人类AR六号基因的反向探针显示出该细胞中单条六号染色体在其长臂上存在缺失。有趣的是，与非ED六号染色体相比，BRDU掺入信号更强，且BRDU掺入的带型分布更广泛。对来自七个不同细胞的有丝分裂铺展样本进行处理，以定量分析六号染色体之间的复制时间差异。BrdU 水平显示，缺失和非 ED 的六号染色体之间的总像素值差异超过两倍。一旦掌握，该技术可在三天内正确完成。希望您现在已经充分理解如何测量位于同一细胞内的同源染色体的复制及其复制时序，并能够明确鉴定与复制改变相关的染色体重排。整条染色体的计时。

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科研

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生物学

结合荧光染色体复制时序<em在原位</em&gt;杂交

来源： Schumacher, D.，和 Sogaard-Andersen, L. 缓慢生长的社会性细菌完整营养细胞周期的荧光活细胞成像 黏球菌属黄单胞菌。J. Vis. Exp.

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学习使用BrdU掺入与荧光原位杂交技术定量分析哺乳动物染色体复制时序的方法。该技术可在同一细胞内直接比较重排与未重排染色体的复制动态，为基因组稳定性研究提供可靠手段。

染色体复制时间分析与荧光原位杂交相结合

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