Name: 基于探测器的激光共聚焦激光显微内镜对泌尿道的技术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: 学习基于探测器的激光共聚焦显微内镜技术，用于膀胱肿瘤实时高分辨率成像与诊断。该方法结合白光膀胱镜检查，可提高泌尿系统肿瘤检测准确性并指导手术切除。

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作者谨此感谢 Mauna Kea Technologies 提供的技术支持。作者还感谢 Shelly Hsiao 提供的技术协助以及 Kathleen E. Mach 的审阅意见。本研究工作部分由 NIH R01CA160986 项目对 J.C.L. 的资助支持。

1. 患者准备
<ol>
	<li>对计划接受诊断性膀胱镜检查及其他内泌尿系统手术（如经尿道膀胱肿瘤切除术，TURBT）的患者，获取其进行共聚焦激光显微内镜（CLE）检查的知情同意。知情同意书中应包含使用膀胱内和/或静脉注射荧光素作为对比剂的说明，并询问患者是否有对荧光素的超敏反应史。</li>
	<li>将患者置于膀胱镜检查体位（通常为截石位），并以无菌方式准备。</li>
	<li>通过尿道使用硬性或软性膀胱镜进行标准白光膀胱镜检查（WLC）。</li>
	<li>在白光下观察膀胱的所有区域（图1），并标记出需进一步进行CLE检查的关注区域。</li>
	<li>除白光膀胱镜检查外，还可使用其他宏观光学成像方式对膀胱进行成像，包括荧光膀胱镜检查（图2A）或窄带成像（图2B），以识别更多可疑区域，随后使用CLE进行特征分析。</li>
	<li>使用电灼电极或切除环在拟进行成像及活检以获得病理学证实的关注区域附近做一小电灼标记。该电灼标记有助于在后续的CLE成像和活检过程中重新定位。</li>
</ol>
2. 对比剂
<ol>
	<li>膀胱内灌注造影剂
	<ol>
		<li>将临床级10%荧光素钠用无菌生理盐水（0.9% NaCl）稀释至所需浓度。例如，将4 ml的10%荧光素钠加入396 ml生理盐水中，配制成400 ml的0.1%荧光素钠溶液。</li>
		<li>将无菌导尿管插入膀胱，使用60 ml注射器通过重力作用将稀释后的造影剂灌注至膀胱内。</li>
		<li>夹闭导尿管，使造影剂在膀胱内留置5分钟。</li>
		<li>排出膀胱内的造影剂。使用60 ml注射器以生理盐水冲洗膀胱，清除残留造影剂，冲洗量约为240–300 ml。</li>
		<li>进行共聚焦激光显微内镜（CLE）成像。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>静脉注射荧光素钠
	<ol>
		<li>抽取1.0 ml荧光素钠至注射器中。将注射器连接至静脉通路，以团注方式静脉推注0.5–1.0 ml荧光素钠，随后用生理盐水冲洗管路。此步骤通常由手术室内的麻醉团队完成。</li>
		<li>进行共聚焦激光显微内镜（CLE）成像。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. CLE 成像
<ol>
	<li>从包装中取出已灭菌的共聚焦激光显微内镜探头（Cellvizio），并将其连接至激光扫描单元（Mauna Kea Technologies，法国巴黎）。</li>
	<li>按照制造商的说明对成像探头进行预热和校准。</li>
	<li>将膀胱镜或经尿道电切镜重新插入膀胱。使用带有0度镜头的硬性膀胱镜。</li>
	<li>将共聚焦激光显微内镜探头沿膀胱镜的工作通道推进，使探头尖端略伸出膀胱镜末端。</li>
	<li>在白光下定位先前标记的兴趣区域。根据需要额外灌注生理盐水以清晰显示黏膜，并保持膀胱适度扩张。</li>
	<li>操作者用手操控共聚焦激光显微内镜探头，使其与兴趣区域直接进行en face接触。为实现对兴趣区域的光学切片，应在保持直接接触的同时，轻柔地施加和释放探头压力。
	<ol>
		<li>对于位于膀胱前壁的肿瘤，使用标准Albarran桥有助于偏转成像探头，从而实现与兴趣区域的直接接触（图2C）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>常见的兴趣区域包括乳头状肿瘤、非乳头状肿瘤、正常外观黏膜与肿瘤之间的过渡区以及红斑样区域，这些均可通过膀胱内或静脉注射荧光素的方式进行成像。对于切除创面、前列腺部尿道及阴茎部尿道的成像，则必须采用静脉注射荧光素。</li>
	<li>当成像探头扫描兴趣区域时，记录图像以供后续分析。注意观察整体细胞形态、边界、排列结构以及新生血管的有无。</li>
	<li>完成成像后，将共聚焦激光显微内镜探头从工作通道中撤出。</li>
	<li>如需要，可从共聚焦激光显微内镜扫描过的相应兴趣区域获取冷刀活检组织。使用电灼标记作为解剖标志，以便对成像区域与活检区域进行共定位配准。</li>
	<li>按常规完成经尿道膀胱肿瘤电切术（TURBT）。对于接受静脉注射荧光素的患者，考虑到荧光素在静脉注射后约5分钟经肾脏排泄入膀胱，建议使用连续灌流式电切镜以改善切除过程中的视野清晰度。</li>
	<li>从共聚焦图像处理器中调取保存的图像记录，并进行图像分析。</li>
</ol>

<ol><li>Thiberville, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+in+vivo+fluorescence+microimaging+of+the+alveolar+ducts+and+sacs+during+bronchoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+Respir.+J%22%5BJournal%5D)">Human in vivo fluorescence microimaging of the alveolar ducts and sacs during bronchoscopy.</a> Eur. Respir. J. 33, 974-985 (2009).</li>
<li>Dunbar, K. B., Okolo, P. 3rd, Montgomery, E., Canto, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+laser+endomicroscopy+in+Barrett%27s+esophagus+and+endoscopically+inapparent+Barrett%27s+neoplasia%3A+a+prospective%2C+randomized%2C+double-blind%2C+controlled%2C+crossover+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointest.+Endosc%22%5BJournal%5D)">Confocal laser endomicroscopy in Barrett's esophagus and endoscopically inapparent Barrett's neoplasia: a prospective, randomized, double-blind, controlled, crossover trial.</a> Gastrointest. Endosc. 70, 645-654 (2009).</li>
<li>Buchner, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+probe-based+confocal+laser+endomicroscopy+with+virtual+chromoendoscopy+for+classification+of+colon+polyps%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Comparison of probe-based confocal laser endomicroscopy with virtual chromoendoscopy for classification of colon polyps.</a> Gastroenterology. 138, 834-842 (2010).</li>
<li>Pech, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+laser+endomicroscopy+for+in+vivo+diagnosis+of+early+squamous+cell+carcinoma+in+the+esophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Confocal laser endomicroscopy for in vivo diagnosis of early squamous cell carcinoma in the esophagus.</a> Clin. Gastroenterol. Hepatol. 6, 89-94 (2008).</li>
<li>Goetz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+confocal+laser+endo+microscopy+of+the+human+liver%3A+a+novel+method+for+assessing+liver+microarchitecture+in+real+time%5BTitle%5D)+AND+%22Endoscopy%22%5BJournal%5D)">In vivo confocal laser endo microscopy of the human liver: a novel method for assessing liver microarchitecture in real time.</a> Endoscopy. 40, 554-562 (2008).</li>
<li>Meining, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+cholangiocarcinoma+in+vivo+using+miniprobe-based+confocal+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Gastroenterol.+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Detection of cholangiocarcinoma in vivo using miniprobe-based confocal fluorescence microscopy.</a> Clin. Gastroenterol. Hepatol. 6, 1057-1060 (2008).</li>
<li>Wu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+real-time+microscopy+of+the+urinary+tract+using+confocal+laser+endomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">Dynamic real-time microscopy of the urinary tract using confocal laser endomicroscopy.</a> Urology. 78, 225-231 (2011).</li>
<li>Sonn, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+biopsy+of+human+bladder+neoplasia+with+in+vivo+confocal+laser+endomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">Optical biopsy of human bladder neoplasia with in vivo confocal laser endomicroscopy.</a> J. Urol. 182, 1299-1305 (2009).</li>
<li>Sonn, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibered+confocal+microscopy+of+bladder+tumors%3A+an+ex+vivo+study%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Endourol%22%5BJournal%5D)">Fibered confocal microscopy of bladder tumors: an ex vivo study.</a> J. Endourol. 23, 197-201 (2009).</li>
<li>Adams, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+2.6-+and+1.4-mm+imaging+probes+for+confocal+laser+endomicroscopy+of+the+urinary+tract%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Endourol%22%5BJournal%5D)">Comparison of 2.6- and 1.4-mm imaging probes for confocal laser endomicroscopy of the urinary tract.</a> J. Endourol. 25, 917-921 (2011).</li>
<li>Wiesner, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+laser+endomicroscopy+for+the+diagnosis+of+urothelial+bladder+neoplasia%3A+a+technology+of+the+future%3F%5BTitle%5D)+AND+%22BJU+Int%22%5BJournal%5D)">Confocal laser endomicroscopy for the diagnosis of urothelial bladder neoplasia: a technology of the future?</a> BJU Int. 107, 399-403 (2011).</li>
<li>Wallace, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+safety+of+intravenous+fluorescein+for+confocal+laser+endomicroscopy+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Aliment.+Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">The safety of intravenous fluorescein for confocal laser endomicroscopy in the gastrointestinal tract.</a> Aliment. Pharmacol. Ther. 31, 548-552 (2010).</li>
<li>Konda, V. J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+assessment+of+needle-based+confocal+laser+endomicroscopy+during+EUS-FNA+procedures+of+the+pancreas+%28with+videos%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointest.+Endosc%22%5BJournal%5D)">First assessment of needle-based confocal laser endomicroscopy during EUS-FNA procedures of the pancreas (with videos.</a> Gastrointest. Endosc. 74, 1049-1060 (2011).</li>
<li>Liu, J. -J., Droller, M., Liao, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Optical+Imaging+Technologies+in+Bladder+Cancer%3A+Considerations+and+Perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Urol%22%5BJournal%5D)">New Optical Imaging Technologies in Bladder Cancer: Considerations and Perspectives.</a> J. Urol. 188, 361-368 (2012).</li>
<li>Hsiung, P. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+colonic+dysplasia+in+vivo+using+a+targeted+heptapeptide+and+confocal+microendoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Detection of colonic dysplasia in vivo using a targeted heptapeptide and confocal microendoscopy.</a> Nat. Med. 14, 454-458 (2008).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

获得并维持固态 表面（en face） 成像探头与膀胱黏膜之间的接触是获得最佳图像质量最关键的步骤。患者通常需要经过约3至5例的操作学习曲线，才能掌握操控成像探头的技巧，并在图像采集过程中稳定地保持探头位置。此外，由于该操作是在无菌条件下进行的 体内，患者移动（即 呼吸运动和血管搏动可能影响成像探头与膀胱的接触。目前仍在研究不同观察者之间的判读差异以及图像解读的学习曲线，后者需要具备广泛的膀胱病理学经验。图像质量的差异可能源于组织本身的变异性及潜在的病理状况。除可疑病变区域外，对正常区域进行成像有助于评估图像质量和荧光素染色效果。
在成像和切除组织过程中，通过电灼标记每个感兴趣区域有助于在膀胱反复排空和充盈期间重新定位已成像和已切除的组织。此步骤称为共配准，对于将共聚焦激光显微内镜（CLE）获得的图像与组织学结果进行对比分析至关重要。上述内容已描述了荧光素膀胱内给药和静脉给药的两种方法，两者在给药时机和是否需要建立静脉通路方面存在一些差异。8
根据需要...

<table><tbody><tr><td>Cellvizio 100 系列</td><td>Mauna Kea Technologies</td><td>100 系列</td><td>包含共聚焦处理器和 LSU：F400-v2，波长 488 nm</td></tr><tr><td>Cellvizio 共聚焦微型探头</td><td>Mauna Kea Technologies</td><td>Gastroflex UHD</td><td></td></tr><tr><td>AK-FLUOR 10%</td><td>Akorn, Inc.</td><td>NDC 17478-253-10</td><td></td></tr></tbody></table>

基于探头的尿路共聚焦激光内窥显微技术：操作方法

Probe-based Confocal Laser Endomicroscopy of the Urinary Tract: The Technique

基于探针的共聚焦激光内窥显微技术（CLE）是一种新兴的光学成像技术，可在常规内窥镜检查过程中实现对黏膜表面的实时活体显微成像。目前该技术已应用于呼吸系统1和消化道2-6，并在泌尿系统中用于膀胱癌的诊断研究7-10。CLE 能够以微米级分辨率实时显示细胞形态和组织微结构，同时可动态观察正常及病变血管系统7。
基于探针的共聚焦激光显微内镜系统（Cellvizio，Mauna Kea Technologies，法国）由一个可重复使用的光纤成像探针与488 nm激光扫描单元耦合组成。该成像探针可插入标准的软性或硬性内镜的工作通道中。另一种基于内镜的共聚焦激光显微内镜系统（Optiscan，澳大利亚）则将共聚焦显微内镜功能直接集成于内镜上，也已用于胃肠道检查。然而，由于其内镜直径较大，目前在泌尿道中的应用仅限于ex vivo（离体）使用。11 共聚焦图像的采集通过成像探针与目标组织直接接触完成，并以视频序列形式记录。与胃肠道类似，泌尿道的显微内镜检查也需要外源性对比剂——最常用的是荧光素，可通过静脉或膀胱内途径给药。膀胱内给药是一种成熟的局部给药方法，可在泌尿道实现局部药物递送，同时系统性毒性最小。荧光素可快速染色细胞外基质，且其安全性已得到充分验证。12 不同直径的成像探针可适配不同规格的内镜。迄今为止，1.4 mm和2.6 mm的探针已用于软性和硬性膀胱镜检查。10 近期推出的&lt; 1 mm成像探针13为输尿管镜检查期间在上尿路开展共聚焦激光显微内镜（CLE）提供了可能。荧光膀胱镜检查（即光动力诊断）和窄带成像则是其他可与CLE联合使用的基于内镜的光学成像技术14，以实现泌尿道的多模态成像。未来，CLE还可与分子对比剂（如荧光标记的多肽15和抗体）结合，用于具有分子特异性的疾病过程内镜成像。

CLE 图像以每秒 12 帧的灰度视频序列文件格式保存。图像解读可实时进行，并可在研究性方案下用于影响临床决策。离线分析包括视频序列的回看，以及额外的图像处理步骤，例如马赛克拼接，7 在技术学习曲线阶段，与标准病理学进行比较具有重要意义。图1B和图1C分别为使用膀胱内注射和静脉注射荧光素钠从两个不同膀胱肿瘤获得的代表性共聚焦激光显微内镜（CLE）图像。对于膀胱肿瘤，细胞特征（例如 形态、凝聚性及边界）和微结构特征（例如 扁平与乳头状肿瘤、组织结构及血管特征等方面的差异可用于区分良恶性病变以及低级别与高级别癌症。由于成像探针可在不同类型的膀胱镜之间互换使用，共聚焦激光显微内镜（CLE）可与其他新兴成像技术联合应用，包括荧光膀胱镜检查（图2A）和窄带成像（图2B），这可能会提高任一技术单独使用的诊断准确性。
<img alt="显微镜图像；荧光分析；肝组织检查；细胞结构观察。" fo:...

基于探头的共聚焦激光内窥显微技术可在膀胱镜检查期间实现对人体泌尿道的实时显微成像，以细胞级分辨率动态观察膀胱癌等病理状态。内窥显微技术可提高标准白光内窥镜检查的诊断准确性，并为术中提供影像引导，从而改善手术切除效果。

基于探头的共聚焦激光内窥显微技术（CLE）是一种新兴的光学成像技术，可实现黏膜表面的实时活体显微成像。

以下实验的目的是在一名接受经尿道膀胱肿瘤切除术的患者中，演示使用探头式共聚焦激光内窥显微镜进行的活体显微成像。该过程首先通过白光膀胱镜检查观察膀胱的整个尿路上皮，并记录任何异常或可疑的黏膜病变。第二步，向膀胱内灌注对比剂，以提供共聚焦激光内窥显微镜成像所需的荧光对比。第三步，对每个感兴趣区域进行活体显微成像，观察并记录组织的细胞微结构及血管特征。最终，可将活体显微镜检查结果与感兴趣区域活检组织的组织病理学分析进行比较。本操作将由泌尿外科医生 Joseph Leal 博士进行演示，他开发了基于探头的共聚焦激光内窥显微镜在泌尿道中的应用。受试者取截石位后，首先采用标准白光膀胱镜检查，将硬性膀胱镜经尿道插入，利用白光观察膀胱各区域。使用切除环标记共聚焦激光内窥显微镜的感兴趣区域。在此步骤中，可采用其他宏观光学成像方式，如荧光膀胱镜和窄带成像，以识别额外的可疑区域；随后使用60毫升注射器连接导尿管，无菌插入膀胱，并通过重力灌注稀释的对比剂。接下来，夹闭导尿管以使造影剂在膀胱内停留。五分钟后，将造影剂从膀胱中排出。然后将240至300毫升生理盐水倒入60毫升注射器中，用于冲洗膀胱内残留的造影剂，以便进行荧光素的静脉注射。用注射器抽取1毫升荧光素。将注射器连接至静脉通路，以静脉推注方式注入0.5至1毫升荧光素，并用生理盐水冲洗管路。注入造影剂后，从包装中取出无菌的共聚焦激光内窥显微成像探头，并将其连接至激光扫描单元。接下来，根据制造商的说明对成像探头进行预热和校准，然后将带有0度镜头的硬性膀胱镜重新插入膀胱。现在，在白光下将共聚焦内窥显微成像探头沿膀胱镜的工作通道推进，使探头尖端刚好伸出膀胱镜末端。当成像探头扫描感兴趣区域时，定位先前标记的感兴趣区域。记录图像以供后续分析。然后通过操作者的手控制共聚焦内镜显微成像，将探头直接快速接触感兴趣区域，以实现对这些区域的光学切片。轻柔地增加和降低成像探头的压力，同时保持直接接触，以到达位于膀胱内部的肿瘤。使用标准AL肘部连接器和桥接装置，以促进成像探头的偏转，从而与目标区域实现直接接触。如有需要，可从共聚焦激光内窥显微镜扫描过的相应目标区域获取冷切活检样本。成像完成后，将共聚焦内窥显微成像探头从工作通道中取出。进行此操作时，需注意在成像前用液体冲洗膀胱内多余的荧光素，并保持探头与黏膜表面呈90度接触。此第一张图像来自一次典型的白光膀胱镜检查，显示经血管内染色的乳头状肿瘤。注意图像底部可见的 2.6 毫米成像探头。这两幅图像分别为使用膀胱内注射和静脉注射荧光素钠所获得的、来自两个不同膀胱肿瘤的代表性共聚焦激光内窥显微图像。由于成像探头可在不同类型的膀胱镜之间互换，共聚焦激光内窥显微技术可与其他新兴成像模式相结合，从而提高单一技术的诊断准确性，包括此处所示的荧光膀胱镜检查以及此处所示的窄带成像。因此，该方法可能为膀胱癌的研究提供新的见解，并可应用于其他系统，如上尿路尿路上皮癌，这类癌症在活检中可能难以诊断。

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利用生物发光成像对小鼠尿路感染及其治疗进行纵向随访

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