在体外合成的原住民，纤维长间距"和"分段长间距胶原蛋白

这些程序的总体目标是展示如何使用胶原蛋白单体可重复地制造三种不同类型的高阶胶原蛋白结构。天然胶原蛋白是通过提高胶原蛋白单体溶液的 pH 值制成的，纤维长间距。胶原蛋白是通过将胶原蛋白单体与 α 1 酸性糖蛋白和节段长间距相结合制成的。

胶原蛋白是通过将胶原蛋白单体与 TP 混合制成的。最终，原子力显微镜用于表征形成的三种不同类型的胶原蛋白结构。与以前发布的程序相比，这些方案的主要优点是它们在形成所需的胶原蛋白结构方面更简单且非常可重复。这些协议是在过去 10 年中在我们的实验室开发的，利用胶原蛋白单体的可靠商业来源作为证明该程序的起始材料将是我实验室的研究生 Calvin Chang，为了创建具有清晰 67 纳米 DB 带的天然胶原纤维。

首先将加热块预热至 37 摄氏度。接下来，在微量离心管中以每毫升 3 毫克的 4 微升胶原蛋白单体溶液制备缓冲溶液并充分混合。所得溶液应为透明无色。

将混合物放在 37 摄氏度的预热加热块上 3 到 4 小时，以形成天然胶原蛋白原纤维。最终溶液应略微浑浊，主要包含天然胶原纤维，以制备纤维状长间距胶原。首先，将 1 毫升 3 毫克/毫升胶原蛋白单体溶液放入 12 至 14 道尔顿分子量截留膜中。

接下来用 400 毫升水透析，在 24 小时内换水 4 次。接下来，将 20 微升透析胶原蛋白单体与 20 微升超纯水和 20 微升每毫升 3 毫克混合。将 α1 酸性糖蛋白水溶液一起放入微量离心管中并混合。

让纤维肺间距胶原蛋白在室温下组装 30 分钟。在此期间，溶液将从晴朗变为浑浊，形成病态的心理长间距。胶原。首先，在微量离心管中制备酸性缓冲液。

向缓冲溶液中加入 40 微升每毫升 10 毫克，即 TP 水溶液并混合。最后加入 33 微升每毫升 3 毫克的胶原蛋白单体溶液，即 0.01。正常盐酸混合。

让节段性长间距胶原蛋白在室温下组装 2 小时。与所描述的其他两种形式的胶原蛋白不同，最终解决方案在这种制剂中将是明确的。为了获得用于原子力显微镜或 FM 的干净平面，请将一条胶带贴在由 MICA 制成的 A FM 基材上，并撕下至少一层。

检查磁带以确认已删除整个层。获得适当的表面后，将 20 微升胶原蛋白 FI 溶液涂抹在云母基材上，静置 5 分钟。5 分钟后，在 MICA 底物边缘加水，让其流过样品 10 至 15 秒，冲洗掉多余的原纤维。

不要直接向样品区域加水。然后使用来自基材一侧边缘的温和氮气流干燥表面。注意不要将液流对准样品的中心。

在光学显微镜下以 200 倍放大倍率检查天然和纤维长间距的样品。胶原蛋白样品显示纤维块，而节段性长间距胶原蛋白不可见。最好观察不同胶原蛋白的独特特性。

使用 A FM 进行初始 100 x 100 微米见方的扫描，然后放大到 10 x 10 平方微米的扫描尺寸，最后是 2 x 2 平方微米的扫描尺寸。观察天然肺间距和纤维肺间距的条带周期性。胶原蛋白是节段性肺间距胶原蛋白的更精细特征。

对于天然胶原菌，使用硅 a FM 探针在间歇接触模式下运行原子力显微镜，用于纤维长间距和节段长间距。胶原蛋白 fis 在接触模式下运行原子力显微镜，并使用亚硝酸硅 a FM 探针以获得最佳结果。检查胶原蛋白样品上的至少两个其他区域，以验证初始扫描是否具有代表性。

FM 的高空间分辨率非常适合表征本视频中描述的不同胶原蛋白制备物。它很容易区分天然胶原纤维、纤维长间距胶原和节段性长间距胶原光学显微镜技术，例如微分干涉对比显微镜显示 FIS，但无法显示纳米级特征，从而区分了在这些方法中制备的三种类型的胶原蛋白。在一个典型的样品中，FM 的 100 x 100 微米正方形随机扫描显示至少几个 5 到 50 微米长的原纤维被单独分离。

在这个阶段可以很容易地识别胶原 fis，放大 10 平方尺的扫描大小表明所有的 fis 都是带状的。为了准确测量条带周期，最好放大到 2 x 2 微米的方形扫描尺寸。放大 10 x 10 微米的正方形扫描尺寸表明，所有原纤维都是带状的。

为了准确测量条带周期，最好放大到 2 x 2 微米的方形扫描尺寸。当根据长间距胶原蛋白程序制备胶原蛋白时，条带期增加，沿纤维长度产生 270 纳米重复。在典型样品中，FM 的 100 x 100 微米正方形随机扫描至少显示一些原纤维。

放大 10 x 10 微米的方形扫描可以看到条带周期性，并且可以通过 2 x 2 微米的方形扫描轻松测量。最后，节段长间距胶原蛋白根本不形成纤维，而是形成单个节段。在一个典型的样品中，FM 的 100 x 100 微米正方形随机扫描显示了许多单独的点。

更近的 10 x 10 微米方形扫描显示了几颗 SLS 晶体，而 2 x 2 微米的方形扫描显示了 SLS 晶体光的更精细结构。看完这个视频，你应该对如何从市售的胶原蛋白单体制备均匀的成熟天然 FLS 和 SLS 胶原蛋白构建体有一个很好的了解。胶原蛋白是一种生物相容性材料，可用作生长细胞和组织的基质或支架。

该程序将使您能够从这些和其他应用所需的胶原蛋白结构开始。