Name: 基质辅助重塑和修复软骨缺损的自体软骨细胞移植在兔模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-21T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 了解基质辅助自体软骨细胞移植技术用于修复兔膝关节软骨缺损的实验方法。该技术通过体外扩增软骨细胞并植入三维基质，十二周后修复组织呈现均匀完整表面，为再生医学研究提供标准化方案。

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本项目由德国研究基金会（DFG, HE 4578/3-1）资助。

A. 软骨活检（手术室；非无菌准备室中的步骤1-5）
<ol>
	<li>对兔子（新西兰白兔，雌性，体重3.5–4.0 kg，6月龄）进行最终体重测定，以确保药物剂量的准确给药，并监测术后体重变化。</li>
	<li>通过静脉注射 10 mg/kg 丙泊酚对兔进行麻醉诱导。</li>
	<li>插管后，以静脉注射丙泊酚 1.5 mg/kg/min 和芬太尼 0.05 mg/kg 维持麻醉。通过二氧化碳图、脉搏血氧饱和度和脉率监测麻醉状态。</li>
	<li>用电动剪毛器剃除待手术侧膝盖的毛发，并用吸尘器清理毛发。</li>
	<li>彻底消毒剃毛后的膝关节，并用无菌敷料覆盖兔子的其余部位。</li>
	<li>触诊髌骨，并在髌骨内侧做皮肤切口。</li>
	<li>在无菌条件下，通过内侧髌旁关节切开术打开膝关节。尽量避免切断任何细小的浅表血管。</li>
	<li>向外侧推移髌骨。</li>
	<li>检查膝关节是否存在任何异常及肉眼可见的软骨病变。</li>
	<li>用无菌手术刀小心地从股骨滑车处剥离出小块软骨（2-3 mm）图1).</li>
	<li>立即将这些软骨活检组织放入含有完全培养基（DMEM + 10% 胎牛血清（FCS）+ 1% 青霉素/链霉素（Pen/Strep））的50 ml离心管中，以继续后续操作 体外 手术后立即进行培养。</li>
	<li>清洁缺损并用无菌生理盐水冲洗。</li>
	<li>将髌骨复位于滑车沟内。</li>
	<li>逐层缝合伤口，使用单个纽扣缝线（4-0 Vicryl）和连续皮内缝线（4-0 Monocryl）。采用可吸收缝线材料。</li>
	<li>最后，使用可透过水蒸气的喷雾敷料封闭伤口。</li>
</ol>
B. 体外 培养
<ol>
	<li>手术后应尽快在无菌超净工作台中的组织培养罩内处理活检所得的软骨组织块。</li>
	<li>用 PBS 将无菌收获的软骨洗涤 2 次，每次洗涤后在室温下以 500 × g 离心 3 分钟。</li>
	<li>将软骨切成1 mm的碎片3转移至50 ml离心管中，加入10 ml胰蛋白酶-EDTA（0.25%）和10 ml PBS，在摇床上消化30分钟</li>
	<li>30分钟后，加入完全培养基终止胰蛋白酶消化。随后，在无血清培养基（DMEM + 1% 青霉素/链霉素）中加入胶原酶A（0.21 U/mg），继续振荡消化软骨组织12小时。</li>
	<li>将所得溶液在室温下以170 × g离心3分钟。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于5 ml完全培养基中。</li>
	<li>将分离的软骨细胞接种到25 cm²培养瓶中2 在5 ml完全培养基中培养组织培养瓶，并置于37℃湿润的组织培养孵育箱中 &deg;C，5% CO2.</li>
	<li>将软骨细胞培养至80%密度。</li>
	<li>用 PBS 洗涤细胞 2 次后，加入 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 处理 3 分钟，使细胞从培养瓶中脱落。软骨细胞脱落后，通过加入 10 &mu;完全培养基</li>
	<li>将悬液在300 × g条件下离心（3分钟），并用完全培养基重悬沉淀。</li>
	<li>组织培养瓶中的种子细胞（75 cm²）2）并以1:3的比例进行传代培养（&sim;5,000 个细胞/cm2每5th 第几天或细胞汇合度达到80%时</li>
	<li>通过台盼蓝染色法测定细胞数量和存活率。</li>
</ol>
C. 基质的细胞接种
<ol>
	<li>植入前，按照上述方法洗涤并重悬细胞。进行细胞计数，并转移 5 x 104 将细胞转入1.5 ml离心管中，室温下以500 × g离心5分钟。</li>
	<li>将沉淀重悬于15 &mu;l 完全培养基以充分饱和基质。</li>
	<li>使用无菌活检打孔器将双层胶原支架切割至与滑车缺损完全匹配的尺寸。</li>
	<li>将基质放入大小合适的组织培养皿中（例如 24孔板</li>
	<li>将种子细胞接种至基质的多孔且具有细胞黏附性的表面，以防止细胞从基质迁移出去。</li>
	<li>将接种细胞的基质置于培养箱中，无需添加额外的细胞培养基，孵育1小时，以确保软骨细胞完全贴壁。</li>
	<li>然后，将细胞-基质-构建物放入培养容器中（例如 24孔板）中加入新鲜的完全培养基。即使细胞与基质黏附牢固，操作时也需小心避免将细胞从基质上冲洗下来。</li>
	<li>现在，细胞-基质-构建物可被送至手术室进行再植入。</li>
</ol>
D. 基质辅助自体软骨细胞移植
<ol>
	<li>进行髌旁关节切开术 对侧 膝关节，如上所述（A. 1-8）。</li>
	<li>使用无菌气动骨钻（直径3.6 mm）在滑车沟内制备两个孤立的软骨缺损。</li>
	<li>用无菌生理盐水清洗缺损并冲洗。</li>
	<li>应注意切勿在任何时候开放骨髓腔。如有必要，可使用电灼法封闭缺损底部以防止出血。</li>
	<li>将接种了培养软骨细胞的支架材料植入，多孔面朝下（图2然后压入钻孔，并冲洗周围表面。</li>
	<li>用少量纤维蛋白胶（Tissucol Duo S）封闭植入的基质，以确保固定牢固。</li>
	<li>凝固后，将髌骨复位至滑车沟内，并对膝关节进行数次全范围活动。</li>
	<li>再次向外侧推移髌骨，检查是否存在任何不稳定固定的迹象或事件。基质必须保持稳定不动。</li>
	<li>重新放置髌骨，并按上述方法逐层缝合伤口，最后进行喷雾敷料处理。</li>
</ol>

<ol><li>Albrecht, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+and+cell+differentiation+in+matrix-associated+chondrocyte+transplantation+grafts%3A+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Gene expression and cell differentiation in matrix-associated chondrocyte transplantation grafts: a comparative study.</a> Osteoarthritis Cartilage. 19, 1219-1227 (2011).</li>
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<li>Kon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Second-generation+autologous+chondrocyte+implantation%3A+results+in+patients+older+than+40+years%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Second-generation autologous chondrocyte implantation: results in patients older than 40 years.</a> Am. J. Sports Med. 39, 1668-1675 (2011).</li>
<li>Gavenis, K., Schmidt-Rohlfing, B., Mueller-Rath, R., Andereya, S., Schneider, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+comparison+of+six+different+matrix+systems+for+the+cultivation+of+human+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev.+Biol.+Anim%22%5BJournal%5D)">In vitro comparison of six different matrix systems for the cultivation of human chondrocytes.</a> In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 42, 159-167 (2006).</li>
<li>Niemeyer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristic+complications+after+autologous+chondrocyte+implantation+for+cartilage+defects+of+the+knee+joint%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Sports+Med%22%5BJournal%5D)">Characteristic complications after autologous chondrocyte implantation for cartilage defects of the knee joint.</a> Am. J. Sports Med. 36, 2091-2099 (2008).</li>
<li>Tay, L. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+outcomes+of+alginate-embedded+allogenic+mesenchymal+stem+cells+versus+autologous+chondrocytes+for+the+repair+of+focal+articular+cartilage+defects+in+a+rabbit+model%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Sports+Medicine%22%5BJournal%5D)">Treatment outcomes of alginate-embedded allogenic mesenchymal stem cells versus autologous chondrocytes for the repair of focal articular cartilage defects in a rabbit model.</a> The American Journal of Sports Medicine. 40, 83-90 (2012).</li>
<li>Brittberg, M., Nilsson, A., Lindahl, A., Ohlsson, C., Peterson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rabbit+articular+cartilage+defects+treated+with+autologous+cultured+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Orthop.+Relat.+Res%22%5BJournal%5D)">Rabbit articular cartilage defects treated with autologous cultured chondrocytes.</a> Clin. Orthop. Relat. Res. , 270-283 (1996).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案提供了一种已确立的9,12,13且易于重复的技术，用于分离自体软骨细胞，随后扩增并重新植入兔膝关节中人工制造的软骨缺损部位。利用自体软骨细胞对关节软骨损伤进行重塑与修复已在临床应用中取得令人满意的长期效果6。
第一代和第二代自体软骨细胞移植技术存在诸多主要问题，例如骨膜增生和钙化、移植物分层或供区并发症14。因此，研究人员开发了利用外源性可生物降解材料将软骨细胞递送至缺损部位的技术。三维培养系统在维持软骨细胞特性方面的积极作用已被反复证实，例如使用琼脂糖15、聚二氧杂环己酮和聚乳酸-羟基乙酸16、聚酯类如聚-L-乳酸（PLLA）和聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)（PLGA）17、纤维蛋白12、透明质酸18、海藻酸盐19、胶原蛋白20或胶原基质9时。
本研究中使用的双层胶原膜Ch...

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂/设备名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Biochrom AG</td><td>F 0415</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶A</td><td>Roche</td><td>10 103 586 001</td><td>0.21 U/mg</td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>PAN Biotech GmbH</td><td>3702-P103009</td><td></td></tr><tr><td>丙泊酚</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Biochrom AG</td><td>A 2213</td><td>10,000 U/ml/10,000 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（1X）</td><td>Biochrom AG</td><td>L1815</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（70%）</td><td>Merck KgaA</td><td>410230</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 0.25%/0.02%</td><td>Biochrom AG</td><td>L2163</td><td>溶于不含 Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;、Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;的PBS中</td></tr><tr><td>芬太尼</td><td>Delta Select GmBH</td><td>1819340</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠溶液（0.9%）</td><td>Bbraun</td><td>8333A193</td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿 100 mm/150 mm</td><td>TPP AG</td><td>93100/93150</td><td>生长面积 60.1 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;/147.8 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>组织培养瓶 25/75 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>TPP AG</td><td>90025/90075</td><td>25 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;，75 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>离心管（50 ml）</td><td>TPP AG</td><td>91050</td><td>γ射线灭菌</td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Brand GmbH+Co KG</td><td>717810</td><td>Neubauer</td></tr><tr><td>台盼蓝溶液 0.4%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8154</td><td></td></tr><tr><td>喷雾敷料（OpSite）</td><td>Smith&amp;amp;Nephew</td><td>66004978</td><td>允许水蒸气透过</td></tr><tr><td>Chondro-Gide&amp;Ograve;</td><td>Geistlich Pharma AG</td><td>30915.5</td><td></td></tr><tr><td>活检打孔器</td><td>pfm medical ag</td><td>48351</td><td></td></tr><tr><td>Tissucol Duo S</td><td>Baxter</td><td>3419627</td><td>0.5 ml</td></tr></tbody></table>

基质辅助自体软骨细胞移植用于兔模型中软骨缺损的重塑与修复

Matrix-assisted Autologous Chondrocyte Transplantation for Remodeling and Repair of Chondral Defects in a Rabbit Model

关节软骨缺损被认为是一个重要的健康问题，因为关节软骨的自我再生能力有限1。未经治疗的软骨损伤会导致持续性疼痛，对生活质量产生负面影响，并增加患骨关节炎的风险。在过去的几十年中，已开发出多种外科技术来治疗此类损伤。然而，迄今为止，尚无法实现完全修复，即无法以透明关节软骨覆盖缺损区域，也无法获得令人满意的长期功能恢复2-4。因此，关节软骨损伤仍然是组织工程等再生技术的主要目标。与其他常导致纤维组织或纤维软骨组织形成的外科技术不同，组织工程旨在利用移植细胞的软骨形成潜能，全面恢复原始关节软骨的复杂结构和功能特性。近年来的发展为软骨再生治疗带来了广阔的前景。
1994年，Lars Peterson 和 Mats Brittberg 首次开展了基于细胞的全层软骨或骨软骨缺损治疗方法，开创了临床自体软骨细胞移植（autologous chondrocyte implantation, ACI）技术5。如今，该技术已广泛应用于膝关节大面积透明软骨缺损的临床治疗，即使在移植后10至20年仍能保持良好的临床效果6。近年来，自体软骨细胞移植技术迅速发展，其中在人工三维胶原基质上进行细胞再移植的方法日益普及7-9。
MACT 包含两种外科手术步骤：首先，为了获取软骨细胞，需要从膝关节非负重区域的软骨处进行软骨活检；随后，从中提取、纯化软骨细胞，并扩增至足够的细胞数量 体外将软骨细胞接种至三维基质上，随后可重新植入体内。在制备组织工程化移植物时，细胞的增殖速率和分化能力对成功实现组织再生至关重要。 10使用三维基质作为细胞载体被认为有助于维持这些细胞特性 11.
以下方案将总结并演示一种从软骨活检组织中分离软骨细胞并促进其增殖的技术 体外 以及将其接种到三维基质上（Chondro-Gide，Geistlich Biomaterials，Wollhusen，瑞士）。最后，将描述将细胞-基质复合物植入兔膝关节人工软骨缺损的技术。该技术可作为软骨修复进一步实验的实验模型。

所述手术技术可成功分离自体软骨细胞并将其植入人工软骨缺损区域。实验结果显示，移植物与周围软骨组织实现了良好整合。
12 周后 体内，软骨缺损被修复组织填充，其表面均匀且完整，可降低剪切应力及对植入物的损伤（图4此外，未见植入物出现肥大或钙化现象。修复组织表现出坚硬且稳固的特性，与周围健康的软骨组织相似。这一点至关重要，因为若植入物的生物力学性能不足，可能导致邻近软骨承受额外负荷，从而增加早期退变的风险。同时，未发生移植物分层现象。术前将膜裁剪至与缺损相同大小，从而避免了植入物与周围软骨之间出现裂隙或裂口。
<img alt="显微镜下的细胞培养，显微图像显示组织生长和细胞形态分析。" src="/files/ftp_upload/4422/4422fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
 ...

本文介绍了一种用于治疗兔膝关节软骨缺损的实验技术。将自体软骨细胞接种于基质后进行植入，是目前广泛认可的关节软骨损伤修复与重建方法，可获得令人满意的长期疗效。基质辅助的自体软骨细胞移植（MACT）提供了一种标准化且已在临床广泛应用的植入技术。

关节软骨缺损被认为是一个重要的健康问题，因为关节软骨的自我再生能力有限1。未经治疗的……

本实验的总体目标是描述一种用于治疗兔膝关节软骨缺损的实验技术。该技术首先通过从膝关节获取软骨活检样本来收集自体软骨细胞；第二步是在体外对活检所得的软骨细胞进行提取、纯化并扩增至足够的细胞数量。接下来，将软骨细胞接种到三维基质上。最后一步是将该三维基质植入兔对侧膝关节中预先钻好的软骨缺损处。最终，在体内经过12周后，可对植入物进行大体观察，修复组织显示出均匀且完整的表面，质量良好。该方法有助于解答关节软骨修复领域的关键问题，并可能促进对生长因子治疗、基因诱导以及力学性能变化的实验分析。在麻醉兔子后，使用电动剪刀剃除将要手术的膝关节部位的毛发。然后吸除毛发并彻底消毒剃净的膝部，用无菌敷料覆盖动物的其余部分。接下来，触诊髌骨。在髌骨内侧做皮肤切口，然后在无菌条件下通过髌骨内侧关节切开术打开膝关节，将髌骨向外侧移位，随后使用无菌手术刀。仔细从股骨滑车处剥离长约2至3毫米的小块软骨组织。立即将软骨活检组织放入含有完全培养基的50毫升离心管中，然后用无菌生理盐水冲洗缺损处。使用镊子去除残留的软骨碎片。现在将髌骨复位至滑车沟内，并用单个纽扣缝合线逐层关闭切口，皮肤缝合则采用连续可吸收缝线。最后，使用可透过水蒸气的喷雾敷料封闭伤口。开始此步骤时，先将无菌收获的软骨在磷酸盐缓冲液（PBS）中清洗两次，随后在室温下以500 × g离心3分钟。接着，将软骨切成1立方毫米的组织块。将它们转移至一个新的50毫升锥形管中，然后在摇床上用10毫升胰蛋白酶（trypsin）、EDTA和10毫升磷酸盐缓冲液（PBS）消化组织块。30分钟后，加入10毫升完全培养基以终止胰蛋白酶消化作用。离心后，弃去上清液，并加入含有胶原酶A的无血清培养基。再将组织块摇动消化12小时。现在将所得溶液离心，然后将细胞沉淀重悬于5 mL完全培养基中，将分离的细胞以5 mL完全培养基接种至25 cm²组织培养瓶中，并在37°C、5% CO₂的湿润化组织培养孵箱中培养细胞。当培养物达到80%密度时，用PBS洗涤细胞两次，然后加入0.05%胰蛋白酶-EDTA作用3分钟。待细胞脱落后，加入5 mL完全培养基以终止胰蛋白酶消化作用。离心收集细胞后，用完全培养基重悬细胞沉淀，然后将细胞接种至75 cm²的组织培养瓶中。如上所述从体外培养物中收获细胞后，计数并转移5 × 10⁴个细胞至1.5 mL微量离心管中。离心沉淀细胞悬液后，将沉淀物重悬于15微升完全培养基中，以充分浸润基质。然后将双层胶原支架切割至滑车缺损的精确尺寸，并将该基质置于24孔板中。接着将软骨细胞接种至基质的多孔细胞黏附面，以防止细胞从基质表面迁移出去。然后将含有细胞的基质在无额外细胞培养条件下孵育，加入培养基一小时，以确保软骨细胞充分贴附。最后，将细胞-基质复合物转移至新的24孔板中，加入新鲜的完全培养基。如上所述，在对侧膝关节行髌旁关节切开术后，开始移植操作

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科研

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Medicine

医学

基质辅助重塑和修复软骨缺损的自体软骨细胞移植在兔模型

介绍了一种用于治疗兔膝关节骨软骨缺损的实验技术。将同种异体间充质干细胞植入骨软骨缺损部位，为组织工程领域提供了有前景的发展方向。体外制备纤维蛋白-细胞凝块为细胞植入提供了一种标准化的方法。...

通过植入含同种异体间充质干细胞的纤维蛋白凝块治疗兔膝关节骨软骨缺损

动物模型是评估组织工程移植物的重要工具。本文介绍了制备用于前交叉韧带组织工程的静电纺可生物降解聚合物移植物的实验方案，以及在大鼠模型中进行移植手术的操作流程。...

用于评估人工前交叉韧带移植物的无胸腺大鼠模型

本研究旨在报道一种利用微骨折技术结合纯化脂肪来源干细胞进行距骨软骨损伤关节镜治疗的操作方案。...

自体微骨折并纯化脂肪组织用于踝关节镜下距骨骨软骨损伤的治疗

我们提出一种方法，用于评估在施加可控机械负荷或冲击后，完整小鼠关节关节面上细胞损伤/死亡的空间范围。该方法可用于研究骨关节炎、遗传因素和/或不同加载方案如何影响关节组织的易损性 原位...

实时可视化与分析机械负荷对完整小鼠软骨外植体中软骨细胞损伤的影响

本文介绍了一种从牛膝关节中分离和培养软骨外植体的实验方案。该方法提供了一种简便且易于获取的工具，可用于描述组织在生物刺激或靶向关节的新型治疗手段作用下的变化。...

牛膝关节软骨外植体中软骨重塑的离体组织培养模型

一种非侵入性建立大鼠膝关节内关节软骨损伤模型的方法

兔内侧股骨髁开放撞击模型是研究创伤后骨关节炎（PTOA）及减缓PTOA进展的新型治疗策略的可靠模型。本方案利用基于滑车的落塔装置配合撞击头，在兔后内侧股骨髁上制造孤立的软骨缺损。...

一种可重复的兔膝关节软骨撞击模型以诱导创伤后骨关节炎

本方案通过在大鼠股骨滑车沟处钻孔，建立全层软骨缺损（FTCD）模型，并检测随后的疼痛行为及组织病理学变化。...

全层软骨缺损大鼠模型的建立与评价

在本实验方案中，采用改良的Videman方法制备膝骨关节炎模型，并详细描述了针刀操作的步骤及注意事项。通过检测股四头肌及其肌腱的力学特性，以及软骨的力学和形态学特性，验证了针刀治疗的有效性。...

应用针刀治疗兔膝骨关节炎模型

本方案描述了一种在膝骨关节炎兔模型中进行推拿干预的方法。...

兔膝骨关节炎模型中的推拿干预

本文介绍了一种在绵羊膝关节中制备可控性骨软骨缺损的整合性实验方案，旨在建立适用于骨与软骨组织再生研究的实验模型。该方案详细阐述了在股骨髁上诱导全层骨软骨缺损的方法，采用的技术可最大限度减少对动物福利的影响，并降低实验结果的变异性。...

建立与评估一种全层骨软骨缺损的绵羊模型

了解基质辅助自体软骨细胞移植技术用于修复兔膝关节软骨缺损的实验方法。该技术通过体外扩增软骨细胞并植入三维基质，十二周后修复组织呈现均匀完整表面，为再生医学研究提供标准化方案。

基质辅助自体软骨细胞移植用于兔模型中软骨缺损的重塑与修复

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