Name: 异基因骨髓间充质干细胞植入兔子的膝关节软骨缺损治疗纤维蛋白凝块 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-05-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: 学习利用异基因骨髓间充质干细胞结合纤维蛋白凝块修复兔子膝关节软骨缺损的标准化方法。该技术通过体外制备纤维蛋白细胞凝块并植入缺损部位，为骨软骨修复研究提供可重复的实验方案。

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本项目由德国研究联合会（资助号 HE 4578/3-1）资助，并由欧盟第七框架计划项目“GAMBA”（NMP3-SL-2010-245993）提供部分资助。

A. 供体兔的准备以分离间充质干细胞（手术室）
<ol>
	<li>从4月龄、体重约3 kg的雄性新西兰白兔（NZW）中分离细胞。</li>
	<li>通过静脉注射丙泊酚（10 mg/kg 体重）诱导麻醉，并通过静脉注射戊巴比妥钠（100 mg/kg 体重）实施安乐死。</li>
	<li>使用电动剪刀剃除后肢、背部和腹部的毛发，并用吸尘器清理毛发。</li>
	<li>用70%乙醇彻底消毒剃毛区域。</li>
	<li>使用钝头镊子、锐利剪刀（或手术刀）和骨剪处理组织和韧带。</li>
	<li>沿腿部和小腿的颅侧表面做切口。</li>
	<li>通过锐性或钝性分离法翻起皮肤及皮下组织。</li>
	<li>将肌肉和韧带从胫骨和股骨上分离。切口应尽量贴近骨骼，以实现干净的解剖。此时不要将股骨与胫骨分离。</li>
	<li>切断髋关节，使股骨头与髋臼分离。</li>
	<li>抬起胫股复合体。</li>
	<li>用手术刀片刮除骨骼上残留的软组织，或用无菌布巾擦拭骨骼。此时股骨与胫骨仍保持连接。</li>
	<li>切断髌骨，随后切断膝关节韧带，最终将骨骼完全分离。</li>
	<li>用70%乙醇喷洒分离后的骨骼，晾干后将每根骨骼放入含有细胞培养基（DMEM + 1%青霉素/链霉素（Pen/Strep））的50 ml离心管中，以保持湿润。</li>
	<li>现在转移至无菌细胞培养超净工作台中操作。</li>
</ol>
B. 从兔骨中冲洗MSC并扩增（细胞培养操作台）
<ol>
	<li>使用无菌镊子从试管中取出骨骼，并将其放入150 mm培养皿中。</li>
	<li>使用无菌锯切除两端骨端，并将骨段转移至新的150 mm培养皿中。</li>
	<li>用培养基（DMEM）填充10 ml注射器，安装18号针头，并插入骨髓腔开口处。</li>
	<li>然后用培养基冲洗骨髓腔，将骨髓冲入培养皿中。之后，若可能，从另一端再次冲洗。如有必要，可进一步锯除骨端。若骨骼断裂，只需冲洗骨内部即可。</li>
	<li>将细胞悬液吸入注射器中，并反复冲洗骨髓，直至悬液能自由通过骨髓腔，且不再出现骨髓凝块。</li>
	<li>当所有骨骼的骨髓收集完毕后，通过18号针头反复推注，以打散骨髓团块：将带针头的注射器吸入液体后，强力推出至培养基中。</li>
	<li>随后，将悬液通过细胞滤器过滤至50 ml离心管中。为防止细胞损失，用10 ml培养基洗涤培养皿2次，并同样进行过滤。</li>
	<li>在室温下以500 × g离心5分钟。</li>
	<li>弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10 ml培养基（DMEM + 1% 青霉素/链霉素）中。</li>
	<li>使用Biocoll分离液将血细胞与外周血单个核细胞（PBMC）及间充质干细胞（MSC）分离。</li>
	<li>在15 ml离心管中加入5 ml Biocoll分离液，小心地在其上方叠加5 ml细胞悬液，并在室温下以800 × g离心20分钟（不启用刹车）。</li>
	<li>可能的结果见图1：红细胞密度高于Biocoll，因此沉降至管底，而PBMC和间充质干细胞则停留在界面处。</li>
	<li>小心吸取界面层至15 ml离心管中，加入5 ml PBS洗涤。</li>
	<li>按步骤22所述条件离心，重悬于5 ml PBS中，并重复洗涤2–3次。</li>
	<li>然后在室温下以350 × g离心10分钟（启用刹车）。</li>
	<li>重悬于10 ml培养基中，使用血细胞计数板进行细胞计数。</li>
	<li>以初始接种密度约5 × 106个细胞接种于150 mm培养皿中。</li>
	<li>2–3天后，去除未贴壁细胞。可能需要先用PBS冲洗以清除细胞碎片。随后加入新鲜完全培养基（DMEM + 10% 胎牛血清（FCS）+ 1% 青霉素/链霉素）。</li>
	<li>每3–4天更换培养基一次（图2）。</li>
	<li>5–10天后，首次传代细胞。</li>
</ol>
C. 体外纤维蛋白凝块的制备 in vitro
<ol>
	<li>在移植当天，用0.25%胰蛋白酶-EDTA处理培养瓶/培养皿中的贴壁细胞3分钟，使其脱离；随后加入完全培养基以终止消化。</li>
	<li>将细胞分装至50 ml离心管中，用PBS洗涤两次。</li>
	<li>通过台盼蓝染色法测定细胞活力和数量。</li>
	<li>加入50,000个细胞至微量离心管中，于室温下以500 × g离心5分钟收集细胞沉淀。根据需要，制备足够用于至少一个额外凝块的预混液。</li>
	<li>将细胞沉淀重悬于17 μl PBS中，并取25 μl TISSUCOL-Kit中的纤维蛋白原组分与该17 μl MSC悬液混合。</li>
	<li>取一个带有预钻孔（3×3.6 mm）的无菌培养板，孔位需与钻孔位置对应 体内 (图3).</li>
	<li>首先，将4 μl凝血酶溶液（500 IU/ml）加入一个孔中，立即加入42 μl纤维蛋白原-细胞悬液，并在顶部再加入4 μl凝血酶溶液。不要混合悬液，以避免在移液枪头内发生凝结。最初，移液加入的50 μl纤维蛋白原-细胞悬液会因表面张力而突出于预钻孔的边缘，不会塌陷。然而，在完全凝固后（60分钟后），凝块会收缩并完全嵌入预钻孔中。</li>
	<li>用钝头镊子小心移除血凝块，并放入含有PBS的微量离心管中。每只动物准备2份血凝块。</li>
	<li>将血凝块送至手术室。</li>
</ol>
D. 在纤维蛋白凝块中植入同种异体间充质干细胞
<ol>
	<li>通过静脉注射丙泊酚（10 mg/kg 体重）对兔（新西兰白兔，雄性，体重 3.5–4.0 kg，5–6 月龄）实施麻醉。</li>
	<li>使用电动剃毛器剃除手术侧膝关节部位的毛发，并用吸尘器清除毛发。上述所有操作均在手术准备室中进行，以避免污染手术室的无菌环境。</li>
	<li>气管插管后，持续静脉输注丙泊酚（1.5 mg/kg/min）和芬太尼（0.05 mg/kg/min）以维持麻醉。通过二氧化碳波形图、脉搏血氧饱和度和脉率监测麻醉深度。</li>
	<li>彻底消毒已剃毛的膝关节区域，并用无菌敷料覆盖兔体其余部分。</li>
	<li>触诊髌骨，并在髌骨内侧做皮肤切口。</li>
	<li>在无菌条件下，通过髌骨内侧关节囊切开术打开膝关节。操作时应尽量避免切断任何细小的浅表血管。</li>
	<li>将髌骨向外侧移位（图 4）。</li>
	<li>检查膝关节是否存在合并的软骨损伤或关节异常后，使用带有止动装置的无菌气动骨钻（直径 3.6 mm），在滑车沟内制备两个骨软骨缺损（深 3 mm，8 字形）（图 5）。</li>
	<li>清洗缺损区域，并用无菌生理盐水冲洗。</li>
	<li>植入前，将 20 μl 纤维蛋白胶注入缺损处，并均匀分布于缺损底部。</li>
	<li>随后将凝块压入 8 字形缺损中，实现紧密贴合。</li>
	<li>凝血完成后，将髌骨复位至滑车沟内，并反复屈伸膝关节数次。</li>
	<li>再次将髌骨向外侧移位，检查纤维蛋白原-细胞凝块是否仍处于原位。</li>
	<li>再次复位髌骨，逐层缝合伤口，使用单个结节缝合（4-0 Vicryl）和连续皮内缝合（4-0 Monocryl）（均采用可吸收缝线材料）完成手术。</li>
	<li>最后，使用允许水蒸气透过喷雾敷料封闭伤口。</li>
	<li>术后护理期间，每日检查伤口，持续 7 天。术后镇痛给予卡洛芬 4 mg/kg 皮下注射，每 24 小时一次（共 4 天），以及布托啡诺 0.03 mg/kg 皮下注射，每 12 小时一次（共 2.5 天）。无需对膝关节进行固定（例如 敷料）。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

近年来，利用组织工程技术治疗复杂的关节骨软骨缺损——例如由剥脱性骨软骨炎、骨坏死和创伤引起的缺损——变得越来越具有吸引力。在上述病理情况下，组织损伤累及软骨下骨，并涉及两种具有不同内在愈合能力的组织1。目前对软骨下骨在骨软骨关节损伤致病过程中的作用日益受到关注11,23。关节软骨的功能状态与其下方支撑骨密切相关。任一组织的损伤都会对整个关节的力学环境和稳态平衡产生不利影响24。骨软骨单元的改变，如关节运动的机械性破坏、游离体形成、受累区域的机械磨损以及对侧关节面的磨耗，可能导致骨关节炎更早发生和发展1,11。因此，为了增强与周围宿主组织的有效整合，针对骨软骨缺损的组织工程修复策略应同时实现对下方软骨下骨的充分重建2。间充质干细胞似乎是满足骨软骨修复特定需求的理想细胞来源。本方案重点在于通过促进移植的间充质干细胞向成骨和软骨细胞谱系的选择性分化，从而推动骨与软骨组织的再生修复。
与软骨细胞相比，间充质干细胞具有多项主要优势：它们可轻松从骨髓、滑膜和脂肪组织中分离获得，且不会...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Biochrom AG</td><td>F 0415</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FCS）</td><td>PAN Biotech GmbH</td><td>0401</td><td></td></tr><tr><td>丙泊酚（Propofol）</td><td>Fresenius Kabi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素（Penicillin/Streptomycin）</td><td>Biochrom AG</td><td>A 2210</td><td>1,000 单位/10 &amp;mu;g/&amp;mu;l，溶于 0.9% NaCl</td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（PBS Dulbecco，1×）</td><td>Biochrom AG</td><td>L1815</td><td></td></tr><tr><td>乙醇（70%）</td><td>Merck KGaA</td><td>410230</td><td></td></tr><tr><td>台盼蓝溶液（0.4%）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Biocoll 分离液</td><td>Biochrom AG</td><td>L6115</td><td>等渗溶液，密度：1.077 g/ml</td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA 0.05%</td><td>Invitrogen GmbH</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>芬太尼（Fentanyl）</td><td>DeltaSelect GmbH</td><td>1819340</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠溶液（0.9%）</td><td>BBraun</td><td>8333A193</td><td></td></tr><tr><td>注射器（Injekt）</td><td>BBraun</td><td>4606108V</td><td></td></tr><tr><td>针头（Sterican）</td><td>BBraun</td><td>4657519</td><td></td></tr><tr><td>镊子（钝头/锐头）</td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>剪刀</td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>手术刀</td><td>Feather Safety Razor Co</td><td>02.001.30.022</td><td></td></tr><tr><td>科研用移液器</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>骨剪</td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>组织培养皿（100 mm/150 mm）</td><td>TPP AG</td><td>93100/93150</td><td>生长面积：60.1 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;/147.8 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>组织培养瓶（25/75 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;）</td><td>TPP AG</td><td>90025/90075</td><td>25 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;，75 mm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>离心管（50 ml）</td><td>TPP AG</td><td>91050</td><td>γ射线灭菌</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 培养箱</td><td>Forma Scientific Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>细胞培养超净工作台 Hera Safe</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>无菌锯</td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>离心机 Megafuge 2.0 R</td><td>Heraeus Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Brand GmbH+Co KG</td><td>717810</td><td>Neubauer 型</td></tr><tr><td>气动骨钻</td><td>Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TISSUCOL-Kit 1.0 ml Immuno</td><td>Baxter</td><td>2546648</td><td></td></tr><tr><td>缝线（4-0 Monocryl，4-0 Vicryl）</td><td>Ethicon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>喷雾敷料（OpSite）</td><td>Smith&amp;Nephew</td><td>66004978</td><td>允许水蒸气透过</td></tr></tbody></table>

通过植入含同种异体间充质干细胞的纤维蛋白凝块治疗兔膝关节骨软骨缺损

Treatment of Osteochondral Defects in the Rabbit's Knee Joint by Implantation of Allogeneic Mesenchymal Stem Cells in Fibrin Clots

多年来，骨软骨关节缺损的治疗一直困扰着临床医生。近年来，人们对关节软骨与软骨下骨之间相互作用的理解不断深入，促使医学界更加重视整个骨软骨结构的修复。与单纯的软骨损伤相比，骨软骨缺损的再生过程更为复杂，对外科手术和治疗手段提出了更高的挑战。受损组织不仅包括表层的软骨，还涉及其下方的软骨下骨。对于较深的骨软骨损伤，例如发生于剥脱性骨软骨炎的情况，必须替换缺损的全层组织，才能恢复关节面的完整性1。合适的治疗方案必须同时考虑这两种组织——它们具有不同的内在愈合能力2。在过去几十年中，多种外科治疗方法相继出现，并已在临床实践中得到确立3-6。
自体或同种异体骨软骨移植包含关节软骨和软骨下骨，可实现整个骨软骨单元的替换。通过圆柱形骨软骨移植物填充缺损，旨在提供一个连续的、由透明软骨覆盖的表面3,7,8。该方法的缺点包括可用移植物数量有限、供区并发症（针对自体移植）以及表面不匹配；因此，该技术尤其不适用于大范围缺损的治疗。
组织工程领域的新方法为再生性骨软骨治疗开辟了广阔的前景。自体软骨细胞移植标志着针对全层软骨缺损治疗的首个基于细胞的生物学方法，目前在全球范围内已得到广泛应用，即使在移植后10至20年仍表现出良好的临床效果9,10。然而，迄今为止，该技术尚不适用于所有类型的缺损治疗，例如累及软骨下骨的深层缺损11。
三明治技术 将骨移植与组织工程领域的现有方法相结合5,6。这种结合似乎能够克服单纯使用骨软骨移植所存在的局限性。在将自体骨移植至软骨下缺损区域后，将接种了自体软骨细胞的膜缝合于其上方，有助于使移植物的形态与损伤部位相匹配。当然，先前的骨重建需要额外的手术时间，甚至常常需要另一次手术。此外，迄今为止，尚缺乏长期随访数据12。
在不额外进行骨移植的情况下，组织工程旨在通过移植细胞的软骨生成和成骨潜能，恢复天然关节软骨的复杂结构与特性。然而，实际情况中通常仅有软骨组织得到不同程度的再生。对于合并的骨软骨损伤，则需要特定的进一步治疗。为了实现骨软骨缺损多层结构的再生，接种自体或异体细胞的三维组织工程产品可能具备良好的再生能力11。
除了自体软骨细胞外，间充质干细胞（MSC）似乎是构建全层软骨组织的一种有吸引力的替代选择。在大量临床前的体外（in vitro）和体内（in vivo）研究中，间充质干细胞已展现出优异的组织再生潜力13,14。间充质干细胞在治疗骨软骨缺损方面的一个重要优势在于，它们具有向成骨细胞和软骨细胞分化的潜能，因此有望实现缺损区域的多层结构再生。
近年来，已开发出多种具有骨软骨再生潜力的支架材料，并获得了令人鼓舞的初步研究结果1,15-18。此外，纤维蛋白胶作为细胞载体已成为实验性软骨修复中的首选技术之一，并已在多项动物研究19-21以及早期人体试验中成功应用22。
以下方案将演示一种从兔骨髓中分离间充质干细胞的实验技术，随后进行细胞培养扩增，并制备标准化的 体外-用于纤维蛋白-细胞凝块的模型。最后，将描述一种将预先构建的纤维蛋白-细胞凝块植入兔膝关节人工骨软骨缺损的技术。

所述手术技术可成功分离异体间充质干细胞并将其植入人工骨软骨缺损区域。实验设置实现了移植物与周围软骨的成功整合。
缺损处被修复组织填充，其生物力学特性和耐久性与周围软骨相似。纤维蛋白-细胞凝块已制备完成 体外 在无菌培养皿上预先钻好与骨软骨缺损相同尺寸的孔图3）。因此，植入的纤维蛋白凝块与周围软骨之间无裂隙，而裂隙是导致过早退变或分层的危险因素（图6）。通过穿透软骨下骨，确保了修复组织的基底愈合，从而抵抗剪切力。另一个重要方面是修复组织的刚度，其应与周围健康的软骨组织相匹配，以避免对周围组织造成额外负荷及可能的过早退变。在我们的初步实验中（数据未显示），我们发现术后12周已可达到足够的刚性。此外，移植组织表面完整且均一，有助于降低剪切应力及可能的移植物损伤。图6).
<img alt="离心过程示意图；细胞悬液分离；血浆和血小板；PBM...

介绍了一种用于治疗兔膝关节骨软骨缺损的实验技术。将同种异体间充质干细胞植入骨软骨缺损部位，为组织工程领域提供了有前景的发展方向。体外制备纤维蛋白-细胞凝块为细胞植入提供了一种标准化的方法。

骨软骨关节缺损的治疗多年来一直困扰着临床医生。随着对关节组织间相互作用的深入理解……

本实验的总体目标是展示一种用于骨软骨修复领域实验性干细胞研究的标准化方法。首先从兔骨髓中分离间充质干细胞，以实现这一目标。在第二步中，对分离得到的干细胞进行培养，以促进其增殖。接下来，在体外制备纤维蛋白细胞凝块。最后，将预先构建好的纤维蛋白细胞凝块植入兔膝关节的人工骨软骨缺损处。最终，在体内12周后，可对膝关节进行大体分析，修复组织显示出均匀、完整且质地坚实的表面。该技术的应用前景涉及在实验动物模型中治疗软骨损伤，因为它能够对同种异体间充质干细胞修复软骨缺损的整合能力与再生能力进行活体分析。在手术室中，使用电动剪毛器剃除已安乐死兔后肢、背部及腹部的毛发，同时在用70%乙醇彻底消毒剃毛区域后，立即用吸尘装置清除脱落的毛发。沿腿部和小腿的前侧表面做一切口，然后通过锐性分离将皮肤和皮下组织向两侧牵开。接下来，将胫骨和股骨上的肌肉和韧带分离，切割时应尽量靠近骨骼，以获得干净的解剖效果。然后切断髋关节，将股骨头从髋臼中分离，并抬起胫股复合体。现在使用手术刀片刮除骨骼上残留的所有软组织。然后切除髌骨和膝关节韧带，最终分离腿骨。将分离出的骨骼在空气中干燥后，用70%乙醇喷洒。将每根骨骼分别放入含有细胞培养基的50毫升离心管中，以保持湿润，并置于无菌细胞培养环境中。层流罩。使用无菌镊子将离心管中收获的骨骼转移至150毫米培养皿中。然后使用无菌锯切除骨骼两端，并将骨段转移至新的150毫米培养皿中。接下来，用10毫升培养基填充一支10毫升注射器。在注射器上安装一根18号针头，并将针头尖端插入骨的一端至骨髓腔内。随后用培养基冲洗骨髓腔，将骨髓冲入培养皿中。然后将细胞悬液吸入注射器中，反复冲洗骨髓，直至悬液自由流动，穿过骨髓腔且不再有骨髓凝块出现。当所有骨骼中的骨髓收集完毕后，通过针头将骨髓悬液吸入注射器，再用力将骨髓悬液注入培养基中，以打散骨髓团块。随后，将悬液通过细胞滤器过滤至50毫升离心管中，以防止细胞丢失。用10毫升培养基将培养皿清洗两次，每次均将洗涤液通过滤膜过滤。将悬液在室温下以500 × g离心5分钟。然后弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于10毫升培养基中。接下来，将5 mL的生物分离液加入一个15 mL离心管中，然后小心地将5 mL细胞悬液叠加在分离液上方。离心分层后，红细胞将沉降至管底，而外周血单个核细胞（PBMC）和间充质干细胞将保留在液面交界处。将交界处的细胞转移至一个15 mL的锥形离心管中，并用5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤收集的PBMC和间充质干细胞2至3次。然后再次离心细胞，并将沉淀重悬于10毫升培养基中。最后，使用血细胞计数板对细胞进行计数，随后以每150毫米培养皿约5×10⁶的初始接种密度进行接种。培养两到三天后，通过去除非贴壁细胞来维持培养。在移植当天，用 PBS 清洗培养板以去除细胞碎片，并用新鲜的完全培养基喂养细胞。首先将贴壁细胞暴露于 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 中 3 分钟，随后加入完全培养基终止消化。然后将脱离的间充质干细胞转移至一个50毫升的锥形管中，并用PBS洗涤两次。通过台盼蓝染色确定细胞数量和活力后，根据需要为n等于4准备至少一个以上凝块的主混合液。将200,000个细胞在微量离心管中离心沉淀，然后将沉淀重悬于68微升PBS和100微升组织凝胶试剂盒中的纤维蛋白原组分中。接下来，将4 µL凝血酶溶液接种至预先打孔的无菌板的一个孔中。立即加入全部42 µL纤维蛋白原细胞悬液，然后再在细胞悬液上方覆盖4 µL凝血酶溶液。最初，由于表面张力作用，移液加入的50 µL纤维蛋白原细胞悬液体积会略微高出预打孔的边缘。 然而，一小时后，混合物将完全凝结，并收缩至恰好嵌入预先钻好的孔中。此时，用钝头镊子小心地取出凝块，然后将其放入含有磷酸盐缓冲液（PBS）的微量离心管中。消毒剃毛后的膝关节后，仔细触诊髌骨，并在髌骨内侧做皮肤切口。接下来，在无菌条件下通过髌骨内侧旁关节切开术打开膝关节，然后将髌骨向外侧移位。现在使用带有直径3.6毫米钻头和限位装置的无菌气动骨科钻，在滑车沟处制备两个深3毫米的“8”字形骨软骨缺损。随后用无菌生理盐水冲洗缺损部位，并在纤维蛋白胶干燥前迅速将20微升纤维蛋白胶均匀滴加至缺损底部。将压配合的血凝块植入“8”字形缺损区域。凝血完成后，将髌骨复位至滑车沟内，并反复屈伸膝关节数次。随后再次将髌骨向外侧移位，检查纤维蛋白原细胞凝块是否仍处于原位。再次复位髌骨后，使用单个按钮四号Vicryl缝线逐层缝合切口，并用连续四号Monocryl缝线进行皮肤缝合。最后使用允许水蒸气透过喷雾敷料封闭伤口。在本实验中，缺损处被修复组织填充，其生物力学特性及耐久性与周围软骨相似。该纤维蛋白细胞凝块在无菌培养板上体外制备，培养板上预先钻有与骨软骨缺损相同尺寸的孔。因此，植入的纤维蛋白凝块与周围软骨之间无裂隙，从而避免了过早退变或分层的风险。由于穿透了软骨下骨，修复组织获得了稳固的基底附着，从而有效抵抗了剪切力。另一个重要方面是修复组织的刚度，其应与健康的周围软骨组织相匹配，以避免关节负荷增加以及可能的过早退变。此外，研究发现移植组织具有完整且均匀的表面，这在其形成后可降低剪切应力及可能的植入物损伤。该技术可为骨科干细胞研究领域的研究人员探索骨软骨缺损的治疗方案以及建立实验动物模型提供新的途径。如需更直观地了解某些动物准备和膝关节手术技术，请务必查看我们的配套 JoVE 文章《用于软骨缺损重塑与修复的基质辅助自体软骨细胞移植：兔模型》。

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医学

异基因骨髓间充质干细胞植入兔子的膝关节软骨缺损治疗纤维蛋白凝块

本演示的目的是展示一种高度可重复的方法，用于在软骨缺损中生成可被磁共振成像（MR成像）可视化的基质相关干细胞植入物。干细胞使用美国食品药品监督管理局（FDA）批准的超顺磁性氧化铁颗粒Ferumoxides进行标记，与琼脂糖混合后植入软骨缺损区域，并使用7T磁共振扫描仪进行成像。...

植入氧化铁标记的人类间充质干细胞修复软骨缺损

人类血管周围干细胞（PSCs）是一类新型干细胞，可用于骨骼组织再生，其功能类似于间充质干细胞（MSCs）。PSCs可通过FACS（荧光激活细胞分选）从标准吸脂手术中获取的脂肪组织中分离，随后与成骨诱导性支架材料结合，以实现骨形成。 体内.

使用人血管周围干细胞进行骨再生

本文介绍了一种用于治疗兔膝关节软骨缺损的实验技术。将自体软骨细胞接种于基质后进行植入，是目前广泛认可的关节软骨损伤修复与重建方法，可获得令人满意的长期疗效。基质辅助的自体软骨细胞移植（MACT）提供了一种标准化且已在临床广泛应用的植入技术。...

基质辅助自体软骨细胞移植用于兔模型中软骨缺损的重塑与修复

动物模型是评估组织工程移植物的重要工具。本文介绍了制备用于前交叉韧带组织工程的静电纺可生物降解聚合物移植物的实验方案，以及在大鼠模型中进行移植手术的操作流程。...

用于评估人工前交叉韧带移植物的无胸腺大鼠模型

本研究旨在报道一种利用微骨折技术结合纯化脂肪来源干细胞进行距骨软骨损伤关节镜治疗的操作方案。...

自体微骨折并纯化脂肪组织用于踝关节镜下距骨骨软骨损伤的治疗

本文描述了利用大鼠双侧髌腱缺损模型制备并评估脐带基质来源的间充质干细胞球体的方法。该模型具有可接受的发病率，并能够检测未治疗与治疗肌腱之间的差异，以及所测试的两种治疗方法之间的差异。...

大鼠双侧髌腱损伤模型中干细胞疗法的评估

本文介绍了一种简单且经济的实验方案，用于直接从新西兰白兔的滑膜液中分离和纯化间充质干细胞。...

利用磁激活细胞分选策略从兔模型中分离和纯化滑膜液来源的间充质干细胞

本文介绍了一种制备脂肪组织来源的基质血管组分的方案，并将其应用于骨关节炎患者，通过再生类似软骨的组织以改善膝关节功能。...

用于软骨再生的脂肪组织来源基质血管组分制备的临床方案

通过植入由间充质干细胞构建的人工软骨组织，以软骨内成骨方式实现骨修复，有望克服传统治疗方法的局限性。透明质酸水凝胶在规模化制备均一分化软骨移植物以及促进融合移植物间血管化整合骨形成方面具有显著优势。 体内.

通过整合性骨形成 在体 内 利用间充质干细胞进行软骨内成骨

本方案提出一种综合性方法，通过多模态分析手段在全球范围内评估骨再生过程中的骨形成情况。该方法旨在提供有关新骨形成定性与定量的信息，从而提高基础研究和临床前研究的严谨性与有效性。...

体外模型中组织矿化的全面表征

本文介绍了一种在绵羊膝关节中制备可控性骨软骨缺损的整合性实验方案，旨在建立适用于骨与软骨组织再生研究的实验模型。该方案详细阐述了在股骨髁上诱导全层骨软骨缺损的方法，采用的技术可最大限度减少对动物福利的影响，并降低实验结果的变异性。...

建立与评估一种全层骨软骨缺损的绵羊模型

学习利用异基因骨髓间充质干细胞结合纤维蛋白凝块修复兔子膝关节软骨缺损的标准化方法。该技术通过体外制备纤维蛋白细胞凝块并植入缺损部位，为骨软骨修复研究提供可重复的实验方案。

通过植入含同种异体间充质干细胞的纤维蛋白凝块治疗兔膝关节骨软骨缺损

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