从长期来看，高解析度激光共聚焦时间流逝成像拟南芥子叶表皮萌发过程中
December 31st, 2012
我们描述了一个协议，用玻片和媒体的固定几天的发展，记录植物子叶共聚焦成像的表皮气孔分化。萤光标记的蛋白质，可以动态跟踪的表达和亚细胞定位，细胞分裂和细胞分化过程中增进了解其可能的作用。
以下实验的目的是在细胞水平上可视化种子发芽后表皮发育的早期事件。这是通过首先去除种皮以实现清晰的 kosin 作为第二步来实现的。kosin 安装在一层琼脂培养基下，该琼脂培养基固定它们并支持它们下一次发育 - 在几天内进行延时成像，以观察体内表皮细胞的生长和分裂。
获得的结果显示基于可见荧光的动态基因表达和蛋白质定位。与现有方法（例如 Gus 染色或 GFP 融合的静止图像）相比，该技术的主要优点是它显示了细胞分裂和分化过程中蛋白质的动态运动。将用于该实验的拟南芥种子在由 33% 家用漂白剂和 0.1%Triton X 100 制成的种子灭菌溶液中灭菌，将携带所需荧光报告基因构建体和基因型的种子放入 1.7 毫升试管中，并应用一毫升灭菌溶液，在突变器上孵育 15 分钟。
在无菌罩中，使用移液管从试管中取出灭菌溶液，留下种子。用 1 毫升无菌水冲洗。第四次冲洗后重复四次。
在 4 摄氏度下孵育 2 天或更长时间。为了制备腔室载玻片培养基，在 200 毫升烧瓶中混合 20 毫升 0.5% bact 与琼脂的溶水溶液，然后微波直至溶解。煮沸溶液时要小心。
将解决方案称为 60 摄氏度左右。太热或应用太快的溶液可能会熔化胶水或使腔室载玻片的玻璃破裂。当琼脂溶液足够冷却时，用移液管收集 1 毫升，并立即将其缓慢涂抹在腔室载玻片内的盖玻片上。
加入第二毫升琼脂溶液。琼脂培养基现在应该完全覆盖腔室载玻片的底部。这种最低限度的培养基足以支持植物油精的发育，植物油精通过保持水分和允许气体扩散来储存营养物质四到五天。
将载玻片称为载玻片，将腔室盖在工作台上。要开始此过程，请从 4 摄氏度的储存中取出无菌种子管。将纸巾放在解剖显微镜的载物台上，用水润湿并调整以形成光滑的表面。
该组织用于在解剖过程中稳定种子。从试管中吸取 20 到 30 颗种子到组织上，小心地将它们放在解剖镜的视野中。解剖 co 导联蛋白是该程序最具挑战性的方面。
使用低放大倍率和锋利的镊子并非常小心将有助于确保使用锋利的镊子成功解剖。小心地从幼苗内部去除种皮，必须去除外皮和内皮。接下来，用手术刀将 cot 铅蛋白切成薄片，去除 hyper cottle 和自由基。
去除 hyper cot 和根基进行成像是有益的，因为如果完好无损，hyper cott 会显着拉直和延长。将 Koss Leadin 移出延时视野，将解剖的 cos leadin 浸入水中。重复种子解剖，直到达到所需的 Olean 数量。
建议在将 olean 安装在腔室载玻片中之前成功解剖 15 到 20 次。为了准备用于安装玻璃an 的腔室载玻片，请使用小盖玻片切开琼脂培养基，并从腔室的玻璃底座上提起整个层。将移液管解剖的 cotan，从保持管中加入少量水进入腔室。
滑到提升的琼脂层下。轻轻地将琼脂降低到 sedins 上。如果存在过多的水，请用纸巾将其浸泡掉。
安装完成后要小心不要打扰 sedins。标本不应再轻易移动。将盖子放在腔室载玻片上，然后将载玻片转移到显微镜载物台上。
在成像之前，设置倒置共聚焦显微镜以对所需的 Fluor 进行成像。LSM 700 参数用于 488 纳米的 GFP 激发和收集。使用 440 至 530 纳米的带通滤光片，用于 555 纳米的 RFP 激发和收集。
使用 570 至 610 纳米的带通滤光片，具有 20 倍物镜。专注于 ACO 导入并将物镜移至腔室中心。在采集模式下滑动，将缩放更改为 0.5，将帧大小更改为 48 x 48 像素。
选中 positions 复选框和扫描概览图像，然后将水平和垂直平铺编号增加到 30 到 35。单击 scan 按钮开始扫描。扫描完成后，单击"尺寸"选项卡下的位置按钮，然后将 Cross hairs 放置在每个婴儿床引线上进行观察。
检查镶样试样是否损坏。删除与受损的 coss 导联蛋白对应的位置，只留下合适的标本进行成像。接下来，设置一个 Z 系列，包含所有样品的 coss 铅蛋白表皮。
单击 Zack 复选框。在 position list （位置列表） 下选择每个位置，然后单击 move to 按钮。专注于表皮中 cos 导联的最上平面，然后单击 Zack 下的 set first 按钮。
聚焦于表皮可见的最低位置。然后点击 设置最后 按钮。单击 best 旁边的按钮，它显示要设置的最佳 Z 切片厚度。
检查每个 kos 导入以确认这些设置包含所有样本。不能为单个位置设置 Z 参数。在此处使用的 Zen 2009 软件中，设置具有所需分辨率的时间序列，长度间隔为 15 至 30 分钟，持续三天，对表皮细胞分裂中的蛋白质动力学有效，但可以根据需要更改间隔。
单击时间序列下的时间序列复选框，通过在文本字段中键入，为所需的图像数量设置周期，将间隔设置为 30，然后使用下拉菜单选择 MIN 以开始 XY、ZT 多位置扫描，将帧大小更改为所需的分辨率并收集开始实验。请注意，位置数量必须受扫描规格的限制。如果总扫描时间大于期望的间隔，则时间点将不正确。
使用该系统，在 30 分钟的间隔内以 59 个 Z 切片对 GFP 和 RFP 进行成像时，最多可以同时进行 6 个位置。此处显示了使用此方法收集的一组信息性时间点的示例。细胞膜用 RFP 标记，GFP 在其天然启动子下融合极性蛋白。
系列 A 中的图像显示，极地 GFP 最初呈均匀分布，然后在箭头指示的不对称分裂之前大约两个小时。Polar GFP 在 47 小时时箭头指示的初始不对称分裂后，在 B 系列中从初始 meister OID 的部位分离出来。极性 GFP 在两个细胞中都消失了。
暗示子午线快速过渡到保卫母细胞状态，星号表示的保卫母细胞对称分裂并分化形成气孔保卫细胞，而 cysto 细胞可能在后来的不对称分裂之前重新获得极性 GFP 表达。此处显示的是一个气孔前体细胞扩增和间隔过程中极性 GFP 定位的简化注册视频。最初，极性 GFP 在发芽后 39 小时均匀地出现在细胞中。
它在 40 小时分裂之前强烈极化，将较小的女仆置于细胞的另一端。右侧较大的细胞也重新获得气孔谱系身份，到 45 小时时，极地 GFP 定位移动到气孔前体附近。47 小时时的分裂在右侧产生一个新的类固醇，该类固醇的方向远离左侧现有的 me 标准体，远离第一个 me 标准体。
最终结果是两个造口被一个细胞隔开。观看此视频后，您应该对如何在发育过程中使用发芽 co leadin 的长期延时来评估表皮中的基因表达和蛋白质定位有很好的了解。
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概述
本研究介绍了一种使用腔室载玻片和琼脂培养基固定植物子叶以进行共聚焦成像的协议。该方法允许观察气孔分化和细胞分裂期间荧光标记蛋白的动态跟踪。
研究的关键组成部分
科学领域
- 植物生物学
- 细胞发育
- 成像技术
背景
- 了解表皮发育对植物生物学至关重要。
- 气孔分化在植物气体交换中起着关键作用。
- 动态成像技术提供了超出静态观察的见解。
- 荧光标记蛋白可以实时揭示细胞过程。
研究目的
- 可视化种子发芽后早期表皮发育。
- 记录数天内气孔分化过程。
- 动态跟踪蛋白质定位和表达。
所用方法
- 去除种皮以获得清晰成像。
- 在琼脂培养基下固定子叶以实现固定。
- 进行数天的时间跃进成像。
- 使用荧光报告基因构建体来跟踪蛋白质。
主要结果
- 观察到动态基因表达和蛋白质定位。
- 该技术比传统方法有优势。
- 实时成像揭示了细胞分裂过程中的运动。
- 结果有助于理解细胞类型分化。
结论
- 该协议增强了对表皮发育的研究。
- 动态成像提供了对细胞过程更深入的见解。
- 这种方法可应用于其他植物发育研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
Long-term, high-resolution confocal time-lapse imaging of plant epidermal development enables mechanistic de-risking of target validation in plant-based biopharma discovery. By capturing dynamic protein localization and cell fate decisions over several days, the method supports predictive confidence in early-stage hypothesis testing. This approach addresses the need for longitudinal, quantitative data in systems where cellular events unfold slowly, improving translational continuity from discovery to preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through real-time observation of protein dynamics during asymmetric cell division and differentiation.
- Operational Value: Supports biological de-risking by visualizing spatiotemporal protein localization patterns linked to stem-cell fate decisions.
- Predictive Value: Enhances target confidence by linking fluorophore-tagged protein behavior to functional outcomes in epidermal patterning.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing reproducible, long-term imaging conditions.
- Quantitative Outputs: Enables measurement of protein polarization kinetics and division timing as dependent variables for compound screening.
- Platform Reuse: Facilitates scalable, standardized workflows for evaluating genetic or chemical perturbations in epidermal development.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-stage epidermal dynamics to preclinical validation through conserved mechanisms of stomatal lineage progression.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by providing quantitative thresholds for protein polarization preceding asymmetric division.
- Disease-Relevant System: Uses Arabidopsis epidermis as a model for signaling pathways relevant to plant-derived biopharmaceutical production.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification by providing dynamic, quantitative readouts of cellular behavior in a disease-relevant system.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by tracking protein localization during stem-cell division and differentiation events.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility through immobilized sample preparation and configurable time-lapse intervals.
- Analytics: Generates quantitative dependent variable measurements such as protein polarization timing, subcellular localization shifts, and division symmetry outcomes.
- Translational Research: Connects epidermal development dynamics to preclinical continuity via conserved asymmetric division mechanisms in stomatal lineage.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for longitudinal studies of protein dynamics in plant-based expression systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct observation of protein dynamics during cell fate decisions.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of long-term imaging across multiple samples and time points.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in epidermal development pathways.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets based on quantitative protein localization thresholds linked to functional differentiation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant dissection, confocal microscopy, and fluorescent protein handling.
- Dependent on inverted confocal systems with Z-stack and time-lapse capabilities, such as LSM 700 with appropriate filter sets.
- Necessitates standardization of agar media preparation, temperature control, and sample mounting to prevent developmental artifacts.
- Adaptation considerations include species-specific tissue integrity and fluorescence signal depth in varying epidermal thicknesses.
- Practical limitations include phototoxicity risks over extended imaging and the need for environmental control to maintain sample viability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:00
Seed Sterilization
1:57
Preparation of Chamber Slide
3:11
Seed Dissection
4:47
Mounting Cotyledons in the Chamber Slide
5:40
Time Lapse Imaging
9:29
Results: Changes in Localization of POLAR Protein during Proliferation Stage of Stomatal-lineage Cells in the Cotyledon Epidermis
11:40
Conclusion
