Name: 从长期来看，高解析度激光共聚焦时间流逝成像拟南芥子叶表皮萌发过程中 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: 了解利用高解析度激光共聚焦时间流逝成像技术观察拟南芥子叶表皮细胞萌发过程中的动态基因表达与蛋白定位。该方法通过琼脂固定样本实现长期活细胞成像，为研究植物气孔发育及细胞分化提供实时可视化工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

感谢Amanda Rychel在制定延时成像方案过程中提供的帮助，以及Lynn Pillitteri构建POLAR::POLAR-eGFP。我们还感谢ABRC提供pm-rb载体。本方案的开发得到了日本科学技术振兴机构（JST）PRESTO项目资助。对POLAR的研究还获得了华盛顿大学专利研究基金（RRF-4098）和美国国家科学基金会（MCB-0855659）的支持。KMP是美国国家科学基金会研究生研究学者（DGE-0718124），KUT是霍华德·休斯医学研究所GBMF项目研究员。

1. 种子灭菌
<ol>
	<li>配制种子消毒液：33% 家用漂白剂，0.1% Triton X-100。</li>
	<li>将携带目标荧光报告基因构建体及基因型的种子放入 1.7 ml 离心管中，加入 1 ml 消毒液。在摇床上孵育 15 分钟。</li>
	<li>在无菌操作台中，使用移液器将消毒液从管中吸出，保留种子；加入 1 ml 无菌水进行清洗。重复清洗四次。</li>
	<li>在 4 °C 下孵育两天或更长时间。</li>
</ol>
2. 培养皿培养基的制备
<ol>
	<li>在200 ml的烧瓶中混合20 ml的0.5% Bacto琼脂溶液（非纯琼脂糖）与水，微波加热至完全溶解。煮沸时需小心操作。</li>
	<li>将溶液冷却至约60 °C。</li>
	<li>用移液器吸取1 ml琼脂溶液，缓慢滴加至腔室载玻片（Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System）内的盖玻片上。若溶液温度过高或添加过快，可能导致胶体熔化或玻璃破裂。</li>
	<li>立即加入第二毫升琼脂溶液。此时琼脂培养基应完全覆盖载玻片腔室的底部。这种极简培养基足以维持植物子叶在四到五天内的发育，因其含有储存的营养物质，同时可保持湿度并允许气体扩散。</li>
	<li>将载玻片置于实验台面上冷却，并用盖子覆盖腔室。若烧瓶密封良好，剩余溶液可保存并在后续使用时重新加热。</li>
</ol>
3. 种子解剖
<ol>
	<li>从4 °C保存环境中取出无菌种子管。</li>
	<li>将一张纸巾置于解剖显微镜载物台上，并用水润湿。调整纸巾使其表面平整。纸巾用于固定种子，便于解剖操作。</li>
	<li>用移液器将20–30粒种子从管中转移至纸巾上，注意将其放置在解剖显微镜的视野范围内。</li>
	<li>使用尖头镊子（Roboz，#5生物尖头）小心去除种子内部幼苗的种皮。必须去除外种皮和内种皮。</li>
	<li>在对子叶进行成像时，建议同时去除下胚轴和胚根。子叶含有足够的营养物质，可在本实验方案下维持发育数天。若保留完整，下胚轴会显著伸长并变直，导致子叶移出延时成像的视野范围。使用解剖刀将子叶与下胚轴分离。</li>
	<li>将解剖后的子叶浸没于水中，保存在微量离心管或其他类似容器中。</li>
	<li>重复步骤3.4–3.6，直至获得所需数量的子叶。建议在装片前完成15–20个成功的解剖样本。</li>
</ol>
4. 将子叶装入载玻片腔室
<ol>
	<li>使用小尺寸（18 mm2）盖玻片，切穿琼脂培养基，并将整个琼脂层从载玻片腔室的玻璃基底上轻轻抬起。</li>
	<li>用移液管将保存管中带有少量水的子叶样本转移至腔室载玻片内，置于抬起的琼脂层下方。</li>
	<li>轻柔地将琼脂层放回覆盖在子叶上。若存在多余水分，可用纸巾小心吸除，注意不要扰动子叶。封片完成后，样本不应再轻易移动。</li>
	<li>盖上腔室盖片，将载玻片移至显微镜载物台上。</li>
</ol>
5. 时间序列成像
<ol>
	<li>设置倒置共聚焦显微镜以成像所需的荧光团。LSM700 参数设置如下：GFP 采用 488 nm 激发，使用 440-530 nm 带通滤光片收集信号；RFP 采用 555 nm 激发，使用 570-610 nm 带通滤光片收集信号。</li>
	<li>检查已封片的样品是否受损。将完整且正确安装的子叶位置编程输入显微镜软件。在 Zen 2009 中：使用 20 倍物镜对准一个子叶，并将物镜移至腔室载玻片中心。在采集模式下，将缩放设为 0.5，帧大小设为 48×48 像素。选中位置复选框，并点击位置下的扫描概览图像...按钮，然后将水平和垂直拼图数量增加至 30-35。扫描完成后，点击维度选项卡下的位置按钮，并在每个子叶处放置十字光标进行观察。</li>
	<li>为所有样品设置涵盖子叶表皮的 z 序列。在 Zen 2009 中：点击Z-Stack复选框。在位置列表中选择每个位置，点击移至按钮。聚焦于子叶表皮最上层平面，并点击Z-Stack下的设为第一层按钮。然后聚焦至表皮仍可清晰可见的最底层平面，点击设为最后一层按钮。点击最优旁的按钮（显示最佳 z 层厚度）以确认设置。检查每个子叶，确保这些参数覆盖所有样品；注意在 Zen 2009 中无法为各个位置单独设置 z 参数。</li>
	<li>按所需分辨率和时长设置时间序列。对于表皮细胞分裂中的蛋白质动态研究，连续三天、每 15-30 分钟采集一次图像效果良好。可根据需要调整该时间间隔。在 Zen 2009 中：点击时间序列复选框。在时间序列下，通过滑块或直接输入文本框的方式设置循环次数以确定所需图像数量。将间隔设为 30，并通过下拉菜单选择min（分钟）。</li>
	<li>开始 xyzt 多位置扫描。请注意，扫描位置的数量必须受扫描参数限制；如果总扫描时间超过设定的时间间隔，则时间点将不准确。在本系统中，当以 30 分钟间隔、59 个 z 层同时成像 GFP 和 RFP 时，最多可支持六个位置同时扫描。在 Zen 2009 中：将帧大小调整至所需分辨率，然后点击开始实验。</li>
</ol>
6. 视频编辑
<ol>
	<li>从共聚焦数据文件中，对每个时间点/位置组合生成最大强度Z轴投影，并以无损格式（如TIFF）导出为图像文件。文件名应按每个位置分别编号为一个序列例如，POLAR-GFP_pos1_0001、POLAR-GFP_pos1_0002 等（而非 POLAR-GFP_0001_pos1）命名文件，以便软件将其合并为视频。在 Zen 2009 中：使用 复制：子集 在……之下 处理 选项卡将位置拆分为单独的文件，然后 最大强度投影最后，导出为 TIFF 格式（文件：导出，全分辨率图像窗口 - 系列).</li>
	<li>使用 FIJI7,8 通过运行 bUnwarpJ 宏来对齐连续图像9(插件：配准：bUnwarpJ）。将配准模式更改为单通道（Mono）。所有高级选项均可使用默认值。对于长时间延时序列，请下载并安装宏“Affine + Consistent Elastic 2D Image Registration”，该宏将自动对一系列图像应用 bUnwarpJ，并使用该宏打开您的数据 文件：导入：图像序列 以使用它。取消选中 MOPS 特征点提取 并运行。</li>
	<li>使用 FIJI/ImageJ 或 Quicktime Pro 打开对齐后的图像序列，并以所需的视频格式保存（AVI 是一种较好的选择）。</li>
</ol>

<ol><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Embryonic+Cell+Lineage+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The Embryonic Cell Lineage of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> Developmental Biology. 100, 64(1983).</li>
<li>Foe, V., Odell, G., Edgar, B. A. Chapter 3 Mitosis and Morphogenesis: Point and Counterpoint. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFoe%2C+V+%22Development+of+Drosophila+melanogaster%22">Development of Drosophila melanogaster</a>. Bate, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, NY. (1993).</li>
<li>Vincent, C. A., Carpenter, R., Coen, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Lineage+Patterns+and+Homeotic+Gene+Activity+During+Antirrhinum+Flower+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell Lineage Patterns and Homeotic Gene Activity During Antirrhinum Flower Development.</a> Current Biology. 5, 1449(1995).</li>
<li>Beemster, G. T. S., De Vusser, K., De Tavernier, E., De Bock, K., Inzé, D. Variation in Growth Rate between Arabidopsis Ecotypes Is Correlated with Cell Division and A-Type Cyclin-Dependent Kinase Activity. Plant Physiology. 129 (2), 854(2002).</li>
<li>Grandjean, O., Vernoux, T., Laufs, P., Belcram, K., Mizukami, Y., Traas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Analysis+of+Cell+Division%2C+Cell+Growth%2C+and+Differentiation+at+the+Shoot+Apical+Meristem+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">In Vivo Analysis of Cell Division, Cell Growth, and Differentiation at the Shoot Apical Meristem in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 16 (1), 74(2004).</li>
<li>Pillitteri, L. J., Peterson, K. M., Horst, R. J., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Profiling+of+Stomatal+Meristemoids+Reveals+New+Component+of+Asymmetric+Cell+Division+and+Commonalities+among+Stem+Cell+Populations+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular Profiling of Stomatal Meristemoids Reveals New Component of Asymmetric Cell Division and Commonalities among Stem Cell Populations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 23 (9), 3260(2011).</li>
<li>Fiji Is Just ImageJ. , Fiji. Available from: 
		
 <a target="_blank" href="http://fiji.sc/wiki/index.php/Fiji">http://fiji.sc/wiki/index.php/Fiji</a> (2008).</li>
<li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+Processing+with+ImageJ%5BTitle%5D)+AND+%22Biophotonics+International%22%5BJournal%5D)">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 36(2004).</li>
<li>Arganda-Carreras, I., Sorzano, S. ánchez, Marabini, C. O., Carazo, R., de Solorzano, J. M. O. rtiz-, C,, Kybic, J. Consistent and Elastic Registration of Histological Sections Using Vector-Spline Regularization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aArganda-Carreras%2C+I+%22Computer+Vision+Approaches+to+Medical+Image+Analysis%2C+ser.+Lecture+Notes+in+Computer+Science%22">Computer Vision Approaches to Medical Image Analysis, ser. Lecture Notes in Computer Science</a>. 4241, Springer. Heidelberg, Berlin. 85-95 (2006).</li>
<li>Peterson, K. M., Rychel, A. L., Torii, K. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Out+of+the+Mouths+of+Plants%3A+The+Molecular+Basis+of+the+Evolution+and+Diversity+of+Stomatal+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Out of the Mouths of Plants: The Molecular Basis of the Evolution and Diversity of Stomatal Development.</a> Plant Cell. 22 (2), 296(2010).</li>
<li>Czymmek, K. J., Fogg, M., Powell, D. H., Sweigard, J., Park, S. -Y., Kang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Time-lapse+Documentation+Using+Confocal+and+Multi-Photon+Microscopy+Reveals+the+Mechanisms+of+Invasion+into+the+Arabidopsis+Root+Vascular+System+by+Fusarium+oxysporum%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo Time-lapse Documentation Using Confocal and Multi-Photon Microscopy Reveals the Mechanisms of Invasion into the Arabidopsis Root Vascular System by Fusarium oxysporum.</a> Fungal Genetics and Biology. 44 (10), 1011(2007).</li>
<li>Campilho, A., Garcia, B., Toorn, H. V., Wijk, H. V., Campilho, A., Scheres, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-Lapse+Analysis+of+Stem-cell+Divisions+in+the+Arabidopsis+thaliana+Root+Meristem%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Time-Lapse Analysis of Stem-cell Divisions in the Arabidopsis thaliana Root Meristem.</a> Plant Journal. 48, 619(2006).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

这种延时共聚焦技术可实现对单个细胞中荧光标记蛋白表达及定位的长期研究 拟南芥 子叶表皮，对于POLAR及其他动态变化的蛋白质而言，这是正确理解其功能的关键。此前，持续的时间推移成像已被用于研究 拟南芥 根部真菌感染11 和分生组织生长5,12但添加子叶表皮可扩展该技术的适用性，使其可用于更多蛋白质的研究，尤其有助于气孔发育这一不断拓展的研究领域。
该方案的主要局限性在于目前仅限于子叶，而子叶含有其早期发育所需的营养物质。此外，由于凝胶培养基限制了气体交换，子叶的发育过程与在空气中发生的发育并不完全相同。扫描激光照射和室内光照足以支持光形态建成，诱导子叶展开和叶绿体成熟，但由于CO2浓度较低，气孔偶尔会成对发育。按照本方案所述，仅使用薄层培养基和最少的封片用水，可降低这种倾向。
荧光染料的选择对于该技术的成功也至关重要。绿色荧光蛋白（GFP）和红色荧光蛋白（RFP）均表现良好，可用于双重标记以观察细胞边缘或评估蛋白质的共定位。定...

<table><tbody><tr><td>细菌琼脂</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>单室载玻片</td><td>Nunc (Thermo Scientific)</td><td>155360</td><td>或双室载玻片（155379）</td></tr><tr><td>激光扫描共聚焦显微镜</td><td>Zeiss</td><td>LSM700</td><td>Zen 2009 软件</td></tr><tr><td>20倍物镜</td><td>Zeiss</td><td>420650-9901</td><td>数值孔径 0.8，平场复消色差物镜</td></tr><tr><td>解剖显微镜</td><td>Benz (National)</td><td>431TBL</td><td>底部照明</td></tr><tr><td>#5 镊子，生物尖头</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS-4978</td><td>极细的尖端至关重要</td></tr></tbody></table>

长期、高分辨率共聚焦延时成像 拟南芥子叶 萌发期间的表皮

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

成像 体内 在发育序列过程中研究细胞行为的动态变化，是理解组织模式形成机制的一种有力技术。在动物发育过程中，关键的细胞增殖和模式形成事件发生得非常迅速。例如，在 秀丽隐杆线虫 受精后六小时内完成幼虫体轴构建所需的所有细胞分裂，共经历七次有丝分裂周期1；十六次或更多的有丝分裂 果蝇 胚胎发生发生在24小时以内2相比之下，植物发育过程中的细胞分裂较为缓慢，通常需要一天左右的时间 3,4,5 这为记录植物器官发生过程中细胞分裂和分化动态行为带来了独特的挑战，需要进行长期活体成像。 拟南芥 表皮是研究植物信号传导、细胞命运决定和发育过程的优良模型系统。在子叶中，该组织由抗空气和抗水分的铺面细胞构成，其间均匀分布着气孔，气孔作为可开闭的阀门，调控气体交换和水分流失。气孔的合理间距对其功能至关重要，其发育经历一系列不对称分裂和细胞分化步骤，最终形成有序的表皮结构。图1).
该方案允许在数天的发育过程中对表皮中的细胞和蛋白质进行观察。这一时间范围可实现对干细胞分裂及表皮细胞分化（包括气孔和表皮铺地细胞）的精确记录。可通过将荧光蛋白与目标蛋白融合，以评估其在细胞分裂和分化过程中的动态变化。该技术有助于我们理解一种新型蛋白POLAR的定位6气孔谱系细胞增殖阶段期间 拟南芥 子叶表皮中，该蛋白在不对称分裂事件前的细胞中表达，并在分裂发生前短暂地移向细胞皮层的特定区域。可利用公共领域软件对图像进行配准并生成简洁的视频，以可视化蛋白质动态定位及随时间变化的细胞类型。

通过该方法采集的一组具有信息意义的时间点如图3所示。细胞膜以RFP（pm-rb）标记，GFP在天然启动子驱动下与POLAR蛋白融合（POLAR::POLAR-GFP）6。在30分钟的时间尺度上，可观察到细胞分裂过程以及分裂前蛋白质定位的变化。气孔谱系中的不对称细胞分裂产生具有干细胞特性的气孔前体细胞，称为分生组织样细胞（meristemoids），其保留进一步进行不对称分裂的能力；同时产生其姐妹细胞，即气孔谱系基底细胞（SLGCs）。SLGCs不会发育为气孔前体细胞，通常会转分化为铺板细胞，但随着叶片扩展，也可能重新获得不对称分裂能力，从而产生另一个与初始分生组织样细胞相隔一定距离的新分生组织样细胞。所有这些细胞命运均反映在POLAR::POLAR-GFP的表达与定位中（图3，视频1）。
<img alt="气孔发育示意图：SPCH、MUTE、FAMA 的作用，细胞分化，不对称分裂过...

我们介绍一种利用培养皿和培养基固定植物子叶的方法，以便在数天的发育过程中对表皮进行共聚焦成像，记录气孔分化过程。通过荧光蛋白标记，可动态追踪蛋白的表达及其亚细胞定位，从而加深对其在细胞分裂和细胞类型分化过程中可能作用的理解。

对发育过程中细胞行为的体内动态进行成像，是一种理解组织力学机制的有力技术……

以下实验的目的是在细胞水平上观察种子萌发后表皮发育的早期事件。首先去除种皮，以便清晰地观察毛状体原基（kosin），这是第二步操作。将毛状体原基置于一层琼脂培养基下固定，以支持其发育，随后进行连续数天的延时成像，从而在活体条件下观察表皮细胞的生长与分裂过程。实验结果通过可见荧光显示了基因表达的动态变化以及蛋白质的定位。该技术相较于现有方法（如Gus染色或GFP融合蛋白的静态图像）的主要优势在于，能够展示蛋白质在细胞分裂和分化过程中的动态移动。本实验所用的拟南芥种子需在种子消毒液中进行灭菌处理，消毒液由33%家用漂白剂和0.1%Triton X-100配制而成。将携带目标荧光报告载体和基因型的种子放入1.7毫升离心管中，加入1毫升消毒液，在摇床中孵育15分钟。在无菌操作台中，使用移液器将灭菌溶液从管中吸出，留下种子。用一毫升无菌水冲洗。第四次冲洗后，再重复四次。在 4 摄氏度下孵育两天或更长时间。准备腔室载片培养基时，在 200 毫升锥形瓶中加入 20 毫升 0.5% 的 Bacto-agar 水溶液，微波加热至溶解。煮沸溶液时需小心谨慎。将溶液加热至约 60 摄氏度。溶液温度过高或添加过快可能导致腔室载玻片的胶水融化或玻璃破裂。当琼脂溶液冷却至适宜温度后，用移液器吸取一毫升，立即缓慢地将其加至腔室载玻片内的盖玻片上。加入第二毫升琼脂溶液。此时琼脂培养基应完全覆盖腔室载玻片的底部。这种最低限度的培养基足以支持植物胚乳的发育，其内含储存的营养物质，可通过保持湿度并允许气体扩散，维持四到五天的发育需求。将带有培养室的载玻片放在实验台面上。开始此操作前，从4°C保存环境中取出无菌种子管。在解剖显微镜的载物台上放置一张纸巾，用清水润湿，并调整使其形成平整的表面。使用组织在解剖过程中固定种子。用移液器将20至30粒种子从离心管转移到组织上，注意将其放置在解剖显微镜的视野范围内。解剖卷曲的顶端分生组织是该实验步骤中最困难的部分。使用低倍镜和锋利的镊子并格外小心，有助于确保解剖操作成功。使用锋利的镊子，仔细去除内部幼苗的种皮，必须将外珠被和内珠被均移除。接下来，使用解剖刀将子叶从胚轴和胚根处切离。在成像前去除高光棉絮和根系是有利的，因为如果保留完整，高光棉絮会显著伸直并大幅延长。将Koss引导物移出延时成像的视野范围，同时保持已解剖的cos引导物浸没在水中。重复种子解剖过程，直至达到所需的Olean数量。建议在将 olean 装载到腔室载玻片之前，先完成 15 至 20 次成功的解剖操作。准备用于装载 cotan 的腔室载玻片时，使用小块盖玻片切穿琼脂培养基，并将整层从腔室的玻璃底面轻轻抬起。用移液管将解剖好的 cotan 连同少量水从保存管中转移至腔室内。将载玻片插入抬高的琼脂层下方，轻轻将琼脂放至沉降物上。若存在过多水分，用纸巾吸除。安装完成后需小心操作，避免扰动沉降物。此时样本应不再轻易移动。将盖玻片盖在腔室载玻片上，并将载玻片转移至显微镜载物台。成像前，设置倒置共聚焦显微镜以观察目标荧光素。LSM 700 的参数设置为：GFP 激发波长 488 纳米，采集波长范围通过 440 至 530 纳米的带通滤光片；RFP 激发波长为 555 纳米，并进行相应信号采集。使用570至610纳米的带通滤光片和20倍物镜。聚焦于ACO导入区域，并将物镜移至腔室中心。在采集模式下切换至0.5倍缩放，帧尺寸调整为48乘以48像素。选中“位置”复选框并扫描概览图像，然后将水平和垂直拼图数量增加至30到35。单击扫描按钮以开始扫描。扫描完成后，单击“尺寸”选项卡下的“位置”按钮，并在每个引线入口处放置十字准线进行观察。检查已固定的标本是否有损伤。删除对应于受损样本的位置，仅保留适合成像的标本。接下来，设置一个Z轴序列，涵盖所有样本的表皮层。单击 Zack 复选框。在位置列表中选择每个位置，然后单击“移至”按钮。聚焦于表皮中 cos 引线的最上层平面，然后单击 Zack 下方的“设置第一个”按钮。将焦点调整至表皮清晰可见的最低位置，然后点击“设置末位”按钮。接着点击“最优”旁的按钮，该按钮会显示最佳的Z轴切片厚度设置。检查每个Kos导入设置，以确认这些参数涵盖所有样品。Z参数无法针对各个位置单独设置。在本实验所使用的Zen 2009软件中，建议设置为期三天、时间间隔为15至30分钟、具有理想分辨率的时间序列，以有效观察表皮细胞分裂过程中的蛋白质动态变化，但可根据需要调整时间间隔。在时间序列设置中，通过在文本框中输入数值将时间间隔设为30，并从下拉菜单中选择MIN，以启动XY、ZT多点位置扫描；调整帧尺寸至所需分辨率，然后开始实验并采集图像。请注意，扫描位置的数量必须受限于扫描参数的限制。如果总扫描时间超过设定的时间间隔，则时间点将不准确。利用该系统，在30分钟间隔内对GFP和RFP进行59个Z层成像时，最多可同时监测六个位置。此处展示的是使用该方法采集的一组具有代表性的时序图像。细胞膜通过在其天然启动子驱动下表达与极性蛋白融合的RFP和GFP进行标记。系列A中的图像显示，极性GFP最初呈均匀分布，随后在不对称分裂前约两小时（由箭头指示）开始分离。在系列B中，初始不对称分裂后（箭头指示为47小时），极性GFP从即将形成的主OID位点分离。随后，两个细胞中的极性GFP均消失。由拟小孔快速转变为保卫母细胞状态，图中由星号标示的保卫母细胞进行对称分裂并分化形成气孔保卫细胞，而拟细胞则重新获得极性GFP表达，可能预示其后续将发生不对称分裂。此处展示的是在气孔前体细胞扩增与间距过程中，极性GFP定位的简化注册视频。在萌发后39小时，极性GFP最初在整个细胞中均匀出现。在40小时即将分裂前，它会强烈极化，使较小的子细胞位于细胞的另一端。右侧较大的细胞也重新获得气孔谱系特性，到45小时时，Polar GFP的定位移动至气孔前体细胞附近。47小时的分裂在右侧产生一个新的保卫细胞，其方向远离左侧已有的第一个拟保卫细胞。最终结果是两个气孔之间相隔一个细胞。观看本视频后，您应能充分理解如何利用萌发的子叶进行长期延时成像，以评估发育过程中表皮内的基因表达和蛋白质定位。

long-term-high-resolution-confocal-time-lapse-imaging-arabidopsis

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

从长期来看，高解析度激光共聚焦时间流逝成像<em&gt;拟南芥子叶</em&gt;表皮萌发过程中

我们介绍了全氟十氢化萘作为浸润性封片介质的使用方法。这是一种简单的方法，可最大限度地减少生理影响，从而改善拟南芥（Arabidopsis...

一种简单的成像方法 拟南芥 使用全氟十氢萘作为浸润性成像介质的叶片成像

本文提供了一种在RootChip中培养拟南芥幼苗的实验方案。RootChip是一种微流控成像平台，可自动控制生长条件，同时实现根部的显微监测以及基于FRET的细胞内代谢物水平检测。...

利用RootChip快速调控根际环境对拟南芥根生长进行延时荧光成像

Ca2+ 信号调控植物中多种多样的生物学过程。本文介绍了利用基因编码的 Ca2+ 探针 Aequorin 或 Case12，监测非生物胁迫在拟南芥细胞和组织中诱导产生的时空 Ca2+...

测量拟南芥植物中的空间和时间Ca2+信号

本实验方案的目的是演示如何利用变角落射荧光显微镜监测植物细胞表面荧光标记蛋白的动态变化，展示拟南芥（Arabidopsis...

利用可变角度落射荧光显微镜对植物细胞表面动态进行实时成像

活体共聚焦成像为生物学家研究发育过程提供了强有力的工具。本文中，我们介绍了一种对发育中的拟南芥（Arabidopsis）花进行活体共聚焦成像的详细实验方案。...

活体共聚焦成像观察拟南芥花的发育过程

本文介绍了一种简单的方法，利用高数值孔径物镜和全氟十氢化萘作为浸没介质，对根和下胚轴发育进行长达3天的高分辨率共聚焦延时成像。...

一种用于根和下胚轴发育长期共聚焦成像的简易培养室

我们报道了一种简单且通用的方法，可用于对拟南芥（Arabidopsis...

一种通用的封片方法 拟南芥 用于活体时间序列成像的叶片

我们提供了一种通过大规模筛选化合物文库来鉴定叶片蒸腾作用调节剂的方法。...

通过大规模热成像筛选鉴定向日葵（Helianthus annuus）中植物蒸腾作用的新调控因子

本文介绍了两种无需使用表皮撕取法的表型分析方法，用于鉴定调控气孔发育的基因。第一种方法展示了如何利用甲苯胺蓝O染色的植物表皮来分析气孔表型。第二种方法描述了如何鉴定气孔配体并监测其生物学活性。...

通过表皮表型评分鉴定参与气孔发育的基因 via

本文介绍了一种先进的工具，用于监测拟南芥（Arabidopsis）幼苗去黄化早期阶段的叶绿素生物合成过程。该新方法可实现高空间和时间分辨率的非侵入式实时叶绿素荧光成像。...

早期阶段叶绿素生物合成动力学的无创检测方法 拟南芥 去黄化

本实验方案描述了拟南芥（Arabidopsis...

发育和成熟胚乳细胞层显微分析用完整组织的制备 拟南芥 种子

了解利用高解析度激光共聚焦时间流逝成像技术观察拟南芥子叶表皮细胞萌发过程中的动态基因表达与蛋白定位。该方法通过琼脂固定样本实现长期活细胞成像，为研究植物气孔发育及细胞分化提供实时可视化工具。

长期、高分辨率共聚焦延时成像拟南芥子叶萌发期间的表皮

探索更多视频

长期、高分辨率共聚焦延时成像 拟南芥子叶 萌发期间的表皮

探索更多视频

长期、高分辨率共聚焦延时成像拟南芥子叶萌发期间的表皮