Name: 在啮齿动物的行为测听的低成本设置 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 学习使用低成本设备通过惊跳反射前脉冲抑制技术评估啮齿动物的听阈和主观耳鸣感知。该方法利用可编程AD/DA转换器和压电传感器，为听觉神经科学研究提供经济实用的行为学检测方案。

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本工作由埃尔朗根-纽伦堡大学大学医院的临床研究跨学科中心（IZKF，项目E7）资助。

1. 设备组装与软件编程
<ol>
	<li>在个人计算机中安装D/A卡例如：NI PCI 6229，National Instruments）并将其连接至接线盒（例如：BNC-2110，National Instruments），两者均应至少支持一个输入通道和一个输出通道，每个通道的采样率至少为 44.1 kHz。</li>
	<li>通过 BNC 电缆将接线盒的输出端连接至声音放大器（例如：AMP75 宽带功率放大器，Thomas Wulf）</li>
	<li>安装一个红外网络摄像头（例如：Grand IP Camera Pro（GrandTec Electronics）用于动物在黑暗环境中的监测。</li>
	<li>安装集成开发环境（例如：Matlab）根据给定的流程图编写程序 图1. 可向通讯作者免费获取在 Matlab 2007b 上运行的版本。</li>
	<li>在隔音室内，将扬声器安装在桌面上。将扬声器连接至声音放大器。</li>
	<li>安装压电传感器（例如 力传感器 FSG15N1A（Honeywell）置于绝缘板上，连接电源，并通过 BNC 电缆将其输出端连接至接线盒的输入端；将传感器信号接地。</li>
	<li>使用丙烯酸玻璃管制作一个测量室，其尺寸需与待测啮齿动物（如沙鼠）的大小相匹配 例如：长15 cm，内径4.3 cm，外径4.8 cm）。在管前端固定一个网孔宽度为0.5 mm的金属筛网，并安装带锁紧机构的缓冲门例如，挂钩）固定到后部。可以使用热熔胶进行固定，对于门，仅将铰链和挂钩的扣环固定在管子上。</li>
	<li>将与测量管尺寸匹配的泡沫塑料支脚安装在绝缘传感器板上。支脚应支撑测量管的前端和后端，并将测量管抬升至传感器水平位置。确保压电传感器与测量室之间保持轻微接触。</li>
	<li>将传感器板固定，使测量室居中对准扬声器前方，并在其旁边放置一个用于声音控制的麦克风（例如 B&amp;K 型 2669 / B&amp;K型4190连接至测量放大器B&amp;K 型 2610，全部：Bruel 和 Kjaer）置于动物头部水平位置，以避免干扰管道。</li>
	<li>请注意，您的听力测量数据质量取决于声音系统的质量。无论何种情况，在首次实验前，请使用麦克风和测量放大器确定系统的频率传递函数，并在软件中加入校正该频率传递函数的程序，以使扬声器的频谱输出保持平坦。</li>
	<li>将网络摄像头与实验装置对齐，以便监测动物行为。</li>
</ol>
2. 听力阈值（听力图）的行为学测定
<ol>
	<li>从动物的饲养笼中取出动物，将其头部朝前放入管中；关闭管门。</li>
	<li>将管子放置在泡沫脚垫和传感器上。关闭所有光源并关上实验舱门。实验舱本身无空调系统，其温度、湿度及其他环境参数与周围实验室保持一致。由于通风设备产生的噪音干扰，不建议使用通风换气，但实验舱的容积足以在数小时内维持动物所需的氧气供应。等待15分钟，使动物适应实验装置。适应期对动物有益，可使其以自身节奏平静下来并熟悉管子环境。另一方面，多次实验观察发现，在适应期间动物的行为并无明显变化，这表明实验前无需额外进行专门的适应性训练来让动物熟悉管子和实验舱。</li>
	<li>启动程序并设定刺激参数（另见参考文献5）：刺激信号为不同频率的纯音。惊跳刺激需以足够高的声压级呈现，以可重复地诱发惊跳反应。在本实验室中，我们采用105 dB SPL的强度（刺激持续时间为6 ms，包含2 ms的余弦平方上升和下降斜坡）来诱发蒙古沙鼠的惊跳反应。在惊跳刺激前呈现的测试刺激，其频率和强度在待测范围内变化，通常从听阈以下至远高于听阈的水平，并覆盖该物种整个可听频率范围。每次试验中，惊跳刺激与测试刺激的频率和持续时间保持一致，两者之间的刺激间间隔设为100 ms。每种测试刺激的频率与强度组合至少重复15次，刺激间间隔随机设定为10 ± 2.5秒（参见图2A，左侧）。后续测试刺激可按随机或非随机顺序呈现。若采用非随机方式（e.g.，对所有测试频率固定同一测试刺激强度），不同刺激组之间应留出5分钟的恢复时间。需注意，所测定的绝对听阈会受刺激呈现顺序随机化的影响，但可能发生的听阈相对偏移则不受影响（e.g. 声损伤后情况，参见参考文献5）。</li>
	<li>在分析数据前，从数据集中剔除无效试验（e.g. 动物在惊跳刺激前发生移动的情况；参见图2B）。</li>
	<li>在惊跳刺激后最初的50 ms时间窗内，计算每次试验的反应幅度（反应波形中第一个峰值到第一个谷值的峰峰值）和反应潜伏期（从刺激开始到反应起始的时间）。</li>
	<li>将某一频率下所有有效单次试验的反应幅度数据按预刺激强度排序后，拟合Boltzmann函数。该Boltzmann函数的50%点7即代表该刺激频率下的听阈。</li>
</ol>
3. 声音创伤与听力损伤的量化
<ol>
	<li>使用盐酸氯胺酮：96 mg/kg（Ketamin-ratiopharm，Ratiopharm）；盐酸赛拉嗪：4 mg/kg（Rompun 2%，Bayer）；硫酸阿托品：1 mg/kg（Atropinsulfat，B. Braun Melsungen AG）和生理氯化钠溶液（Berlin-Chemie AG，Berlin），按9:1:2:8的比例配制氯胺酮-赛拉嗪麻醉剂。</li>
	<li>以3 ml/kg剂量皮下注射麻醉剂。等待动物进入深度麻醉状态（约5分钟，检查反射，例如，使用足底回缩反射）。在测量期间为维持麻醉，使用注射泵以3 ml/kg/hr的速率持续输注麻醉液。使用适当设备监测生命体征（例如，通过摄像头监测呼吸），并将动物置于加热垫上以保持体温。</li>
	<li>诱导声创伤，例如使用高强度纯音：例如 2 kHz、115 dB SPL，持续75分钟。</li>
	<li>声创伤结束后停止注射泵，将动物置于安静处的复苏笼内加热垫上使其苏醒。在苏醒过程中定期检查生命体征是否稳定。仅当动物完全清醒后，再将其放回饲养笼。让动物在饲养笼中恢复麻醉状态（至少2天）并充分休息。</li>
	<li>重复步骤2.1至2.6。通过计算各频率下的听力损失百分比，比较声创伤前后的听阈。所有实验结束后，对动物实施安乐死。</li>
</ol>
4. 声学幻觉感知测试（主观性耳鸣）
<ol>
	<li>在声创伤前后进行这些测量。</li>
	<li>如果动物尚未放置于装置中，请按照 2.1 至 2.2 步骤操作。</li>
	<li>可采用多种刺激范式来检测啮齿类动物的主观耳鸣。这些方法的共同原理是检测动物对背景噪声中短暂静音间隙的感知显著性。如果动物能够感知该间隙，则可将其作为测试刺激，以减弱惊吓反应，其原理类似于第2节所述方法。如果动物患有耳鸣（通常在声创伤后出现），耳鸣感知会填充静音间隙，从而使间隙的感知显著性降低。因此，与健康对照动物相比，耳鸣动物的惊吓抑制效应会减弱（前脉冲抑制减少，参见PPI）。 8）。该感知通过两种略有不同的方案进行测试。</li>
	<li>在本文介绍的第一种主观性耳鸣实验范式中（图2A，中心，参见 9使用以下参数进行刺激：惊吓声音强度为105 dB SPL，频率范围为1至16 kHz，以1个八度为步长；刺激持续时间为6 ms，包含2 ms的余弦平方上升和下降斜坡。实验期间呈现50 dB SPL的白噪声背景，白噪声中可包含或不包含一个在惊吓刺激前100 ms出现的15 ms间隙；每种频率和间隙条件至少呈现15次试验。若采用非随机化方案，不同刺激组之间应留出5分钟恢复时间。使用不同的惊吓刺激频率可粗略估计动物感知到的耳鸣频率。</li>
	<li>作为第二种主观性耳鸣范式（图2A，右侧）可采用以下刺激参数：惊跳声音强度为105 dB SPL，双脉冲点击刺激，每个点击持续时间为0.1 ms，点击间间隔0.1 ms，第二个点击的相位方向与第一个相反。提供中心频率从1 kHz到16 kHz以八度为步长的带通滤波噪声背景，噪声强度为50 dB SPL，高斯滤波器带宽为0.5个八度。该噪声可包含或不包含一个在惊跳刺激前100 ms出现的15 ms间隙；每种频率和间隙条件至少呈现15次试验。若采用非随机化方案，不同刺激组之间应留出5分钟恢复时间。使用不同中心频率的带通背景噪声可粗略估计动物感知到的耳鸣频率。</li>
	<li>按照步骤2.4至2.5操作；针对每种测试频率和每种创伤条件，使用参考数据集对所有获取的数据进行归一化处理。 即在声学创伤前后，该参考值是指无任何预刺激情况下对纯音惊跳刺激的反应幅度（参见2.3）。频率由纯音频率或带通滤波噪声的中心频率确定。计算每次参考反应的平均值，并将每个计算得到的反应幅度除以其对应的参考值进行标准化。</li>
	<li>通过将间隙条件下的归一化反应幅度除以每个测试频率下无间隙条件归一化反应幅度的平均值来计算PPI。</li>
	<li>计算每次测试频率下创伤后PPI的百分比变化。</li>
</ol>
动物的惊吓反应易于产生和分析。图2B展示了一只动物在无预刺激条件下，接受15次105 dB SPL纯音刺激后的典型结果概览。大多数试验为有效试验，无效试验易于识别（以红色方框标记的试验）。反应幅度和潜伏期仅根据有效试验计算得出。
典型的动物行为阈值变化如图3A所示。图中展示了使用第2节所述方法获得的一个代表性动物在2 kHz声创伤前（蓝色）和创伤后（红色）的听力图（黄色区域为创伤频率范围）。在2 kHz处可明显观察到听力损失。与主观耳鸣感知相关的结果如图3B所示，以相同动物为例，展示了在创伤频率上下各一个八度音程刺激下的归一化反应幅度（见4.5节描述）。通过比较创伤前后存在间隙与无间隙刺激的反应（创伤前为蓝色，创伤后为红色），可判断是否存在潜在的耳鸣感知。在创伤频率以下，反应模式未发生改变；而在创伤频率以上，创伤后间隙效应消失，提示在此频率处存在异常感知。
<img alt="听觉刺激实验的流程图；包括声音惊吓起始和数据记录过程。" src="/files/ftp_upload/4433/4433fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
图1. 流程图，显示用于获取行为阈值和主观耳鸣数据的程序。请注意，这仅是程序代码的简化版本。缩写：GUI - 图形用户界面；ISI - 刺激间间隔。
<img alt="静态平衡；ΣFx=0；方程；科学示意图；反应幅度数据分析；刺激起始时间。" src="/files/ftp_upload/4433/4433fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
图2. 听觉惊吓反应（ASR）刺激方案。A 所采用的三种不同刺激方案示意图。左图：在惊吓声刺激（红色）之前不施加任何纯音测试刺激（绿色）的ASR前脉冲抑制（PPI）测量；反应期以蓝色表示。中图：在白噪声背景下，以不同频率呈现纯音惊吓刺激的间隙/噪声范式。右图：在具有不同中心频率的带通滤波背景噪声上，呈现点击式惊吓刺激的间隙/噪声范式。B 采用阈值范式、在1 kHz刺激频率下且无任何预刺激时记录的15次试验的典型听觉惊吓反应示例。其中三次试验被判定为无效（红色方框），因为动物在刺激开始前已发生移动。
<img alt="听力频率响应图显示声创伤效应；在1kHz和4kHz处的振幅测量图表。" src="/files/ftp_upload/4433/4433fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 一只动物ASR的典型实验结果。A 在2 kHz（黄色区域）声创伤前（蓝色）和创伤后（红色）的行为阈值。阈值是通过使用Boltzmann函数拐点作为阈值，从对PPI调制ASR方案的反应中计算得出。注意，在2 kHz处的听力损失超过66%，而在远离创伤频率的区域，听力阈值反而常可见改善。B 使用间隙/噪声点击ASR方案（4.5）在1 kHz和4 kHz中心频率刺激期间的归一化反应振幅（空心圆：单次试验，实心圆：均值，须线：标准差）。数据按创伤前后在噪声中是否存在间隙的试验进行分类。仅在4 kHz时，创伤后间隙效应消失，表明在此频率附近存在主观性耳鸣感知。

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<li>Engineer, N. D., Riley, J. R., Seale, J. D., Vrana, W. A., Shetake, J. A., Shetake, J. A., Sudanagunta, S. P., Borland, M. S., Kilgard, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversing+pathological+neural+activity+using+targeted+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reversing pathological neural activity using targeted plasticity.</a> Nature. 470, 101-104 (2011).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

我们介绍一种基于声学惊吓反应前脉冲抑制的啮齿类动物听力测量装置，该装置成本低廉且易于搭建，可用于测定行为听阈（即听力图）。 10以及主观性耳鸣等听觉幻觉感知 11尤其是后者的测量已成为多篇近期报告的关注重点 8,12,13,14 并且可被视为研究该疾病神经机制所需电生理学研究的一项先决条件。利用该方法，可以区分在声创伤后是否产生主观耳鸣感知的动物，并对这些个体进行进一步研究。 例如，结合初级听觉皮层的电生理记录。 
声创伤后惊跳反射数据的关键分析步骤是将数据归一化至在无先前测试刺激条件下可引发的最大惊跳幅度：这尤其有助于区分由听力损失引起的惊跳反应减弱与耳鸣动物的前脉冲抑制（PPI）降低。声创伤的影响会随时间发生变化，动物对其有部分恢复，但大约50%的听力损失是永久性的。与上述文献中仅测试但未用于校准听阈的研究不同，我们尝试通过使用参考值对每个反应幅度进行归一化，以尽量减少各频率听阈差异以及声创伤本身的影响。此外，我们采用两种不同的实验方案来评估可能的耳鸣感知，其中第一种方案（4.4）更适用于创伤后...

一种用于啮齿类动物行为听觉测量的低成本装置

A Low Cost Setup for Behavioral Audiometry in Rodents

在听觉动物研究中，精确掌握实验所涉及动物受试者的基本听觉参数至关重要。这些参数可能包括听觉通路的生理反应特征，例如通过脑干听觉诱发电位（BERA）进行检测。然而，这些方法仅能对与生理参数相对应的听觉感知进行间接且不确定的推断。要评估听觉的感知水平，必须采用行为学方法。在动物模型中使用行为学方法描述感知时，一个潜在的问题是大多数此类方法在对受试动物进行行为测试之前，都需要某种形式的学习范式，例如动物需要学会在听到声音时按压杠杆。由于这些学习范式本身会改变感知过程1,2，因此它们必然会影响通过这些方法获得的任何关于感知的结果，故需谨慎解读。例外情况是利用反射性反应的实验范式，因为在这些范式中，感知测试前无需进行学习训练。其中一种反射性反应是声学惊跳反射（ASR），在未经训练的动物中，突然的高强度声音可高度可重复地诱发该反射。而这种ASR又会受到先于其出现的声音的影响，影响程度取决于该前置刺激的可感知性：远高于听阈的声音会完全抑制ASR的幅度；接近听阈的声音则仅轻微抑制ASR。这一现象被称为前脉冲抑制（PPI）3,4，ASR的PPI程度随前脉冲的可感知性逐渐变化。因此，ASR的PPI非常适合用于测定未经训练、未经历学习范式的动物的行为听阈图，用于评估听力损伤，甚至检测这些动物中可能存在的主观耳鸣感知。本文中，我们展示了该方法在一种啮齿类动物模型（参见亦参考文献5）——蒙古沙鼠（Meriones unguiculatus）中的应用。该物种是研究正常人类听觉范围内的惊跳反射的知名模式物种（例如6）。

本文描述了一种快速且低成本的行为学方法，用于测定听觉参数，如听阈、听力损伤或幻觉感知（主观性耳鸣）。该方法利用声学惊吓反应的前脉冲抑制，可借助可编程的模数/数模转换器和压电传感器，在个人计算机上轻松实现。

在听觉动物研究中，必须精确掌握参与实验的动物受试者的基本听觉参数信息，这些信息对于……至关重要

本实验的总体目标是通过低成本装置获取啮齿类动物听觉惊吓反应的行为前脉冲抑制数据，以确定其听觉阈值及主观耳鸣感知。该目标首先通过对健康动物获取完整的行为学数据来实现，随后通过轻度频率特异性声学损伤诱导听力损伤。第三步是在听力受损的动物中获取相同的行為數據。然後分析這些數據以測量聽力損失程度及可能存在的耳鳴感知。最終，結果不僅可以顯示聽力閾值的變化，還能揭示特定頻率的耳鳴情況。通过惊吓反应的行为学测量来评估感知能力。演示该实验操作的将是本实验室的博士后SA和博士生Z ave。首先，需要组装一台配备必要设备的计算机。此装置的总成本约为3,500欧元，相比之下，标准设备的成本通常在15,000至20,000欧元之间。这包括一个连接到接线盒和放大器的数模转换器、一个红外网络摄像头，以及运行集成开发环境的MATLAB软件。放大器连接至隔音室内的扬声器，该隔音室由网络摄像头监控，并配备有绝缘传感器板、压电传感器和用于固定啮齿类动物的装置。此外，还配有用于声音控制的麦克风。无论放大器和扬声器的质量如何，都必须使用测量放大器对系统进行校准，以确定该系统的频率传递函数。此外，系统必须根据受试动物的听觉范围进行调整。从动物的饲养笼中将其取出，并使其头部朝前放入固定管中。关闭门，将试管放入泡沫底座上的腔室中，并关闭传感器以切断环境光。关闭腔室门，等待15分钟，使动物适应实验装置。启动程序并设定刺激参数。刺激由不同频率的纯音组成。在惊吓刺激之前呈现的测试刺激，其频率和强度各不相同。若采用非随机化方案（例如，所有测试频率均使用固定的测试刺激强度），每组刺激之间应留出五分钟的恢复时间。在分析数据之前，需从数据集中剔除无效试验，例如动物在惊跳刺激呈现前已发生移动的试验。单次试验的有效性验证至关重要，因为动物发生移动后，其对惊跳刺激的反应往往显著增强，此类反应必须予以排除。现在，在惊跳刺激后最初的 50 毫秒时间窗口内获取惊跳反应的幅度和潜伏期。反应幅度定义为反应波形中第一个波峰到第一个波谷之间的距离。潜伏期是指从刺激开始到反应起始的时间。通过将 Boltzmann 函数拟合到按单次试验前刺激强度排序的某一频率下的完整反应幅度数据集，可获得听觉阈值。玻尔兹曼函数的50%点表示该刺激频率下的听觉阈值。无任何预刺激的纯惊吓刺激反应可作为后续计算的参考基准。为了造成啮齿类动物的听力创伤，首先需对动物进行麻醉，皮下注射每千克体重3毫升的麻醉剂，并同时给予一次阿托品推注。等待约五分钟并检查其反射。在测量过程中，为维持麻醉状态，需通过注射泵持续注入相同体积的麻醉溶液。在腔室中每过一小时，均应使用加热垫保持动物体温。持续75分钟使动物暴露于高强度纯音以诱导声学创伤。等待五天让动物状态稳定后，生成新的听力图；至少五天的耳鸣发展期对于获得可靠结果至关重要。在第一种主观性耳鸣实验范式中，采用以下刺激参数。将惊吓

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

在啮齿动物的行为测听的低成本设置

本报告中，我们介绍一种完全自动化且高度多功能的系统，该系统能够同时检测啮齿类动物的多种认知行为并记录其神经元活动。...

一种用于检测啮齿类动物多认知功能及记录神经元活动的全自动化且高度多功能的系统

本视频演示了一种记录幼鼠听觉脑干反应（ABRs）的方法。该方法概述了电极放置、声音刺激施加以及脑干信号处理分析的步骤，以评估神经反应。...

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来源：Lee, D., 等．小鼠噪声性听力损失的改良实验条件及听力功能与外毛细胞损伤评估．J. Vis.

测量小鼠的听觉脑干反应

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使用低成本开源资源在啮齿类动物模型中进行高密度脑电图采集

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本文介绍了一种通过手术穿刺鼓膜诱导可重复的传导性听力损失的方案，并通过耳镜观察和拍击惊跳行为评估进行验证。...

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脑干诱发电位测听是临床神经生理学中的重要工具。如今，脑干诱发电位测听也广泛应用于基础科学研究和涉及药理学及遗传学动物模型的临床前研究中。本文详细描述了如何在小鼠中成功记录和分析听觉脑干反应。...

小鼠脑干诱发电位听觉测试中的数据采集与分析

本文介绍了一种新型的自动化实验系统，该系统为三室实验提供了一种替代方案，并解决了多个现有局限性。该系统可提供多种行为学参数，从而在社交偏好和社会新颖性偏好测试期间，实现对小型啮齿类动物行为动态的严格分析。...

一种用于追踪小型啮齿类动物社会偏好行为动态的系统

本方案介绍了一种基于微控制器的行为学检测箱，通过采集置于箱体下方传感器的加速度数据，评估 Prepulse...

开发用于评估精神疾病动物模型中脉冲前抑制及神经活动的行为箱

实验室大鼠和小鼠的超声波发声（USVs）可用于研究发声功能和神经功能。本方案描述了一种基于食物奖励的实验范式，可稳定诱发与奖赏相关的USVs，且避免了与交配相关因素的干扰。该方法详细说明了动物的条件化训练、刺激呈现、声音记录及声学分析，为研究情感-动机以及颅脑感觉运动功能提供了一种可重复的实验方法。...

实验室大鼠和小鼠在预期食物奖赏时引发的趋近性超声 vocalizations

学习使用低成本设备通过惊跳反射前脉冲抑制技术评估啮齿动物的听阈和主观耳鸣感知。该方法利用可编程AD/DA转换器和压电传感器，为听觉神经科学研究提供经济实用的行为学检测方案。

一种用于啮齿类动物行为听觉测量的低成本装置

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