基于微流控培养平台（MCP）的神经元轴突与胶质细胞共培养系统中神经元-胶质细胞相互作用的成像分析
2012年10月14日
本研究描述了一种新型神经元轴突与（星形）胶质细胞共培养平台的建立步骤。在此共培养系统中，可实现对单个轴突（及单个胶质细胞）之间直接相互作用的操控，从而能够对神经元与胶质细胞之间的相互信号传导机制进行分析。
本方案建立了一种新型的神经元轴突与星形胶质细胞共培养平台，用于通过高分辨率成像分析神经元与胶质细胞之间的相互作用。首先，组装微流控培养室，制备神经元培养物，并诱导神经元轴突进入微流控芯片（MCP）的另一侧。随后，加入培养的星形胶质细胞，建立区室化共培养系统；实验结果表明，采用共聚焦免疫荧光显微镜进行活细胞延时成像有助于深入理解轴突、星形胶质细胞以及神经元轴突之间的相互作用。
我们最初是在尝试分离神经元突起与神经元分泌物对GT信号调控的影响时，提出了该方法的构想。通常情况下，刚接触该方法的研究人员在诱导轴突进入细胞区室的其他部分时会遇到困难。这要求在神经元侧接种高密度的健康神经元，且神经元需靠近中央通道。
MCP 开放式培养室适用于不同类型细胞的分隔共培养，共培养中接种神经元和星形胶质细胞需要使用聚氨酯和层粘连蛋白涂层。首先，将浓度为每毫升一毫克的聚氨酯溶液加入无菌玻璃底培养皿中，于 37 摄氏度孵育过夜。用双蒸水将包被后的玻璃底培养皿清洗三次，然后置于无菌超净台中干燥。
接下来，用浓度为每毫升一毫克的层粘连蛋白包被培养皿，并在紫外光下干燥一小时。使用前应 freshly 制备 MCP 在玻璃底培养皿上的组装。将微流控培养平台的中央连接通道朝下放置，与包被过的玻璃表面形成紧密密封。
底部培养皿。在组装好的MCP两侧加入常规的神经元或星形胶质细胞培养基。将培养室置于37摄氏度孵育2至4小时，并确认MCP与玻璃之间无泄漏。
底部培养皿。皮质神经元细胞培养物从胚胎期14至16天的小鼠脑组织中新鲜制备。在解剖小鼠脑组织后，在解剖显微镜下剥离大脑皮层的脑膜。
使用剃须刀片将组织切成小块，离心后将组织块放入离心管中。弃去沉淀上方的培养基，加入0.05%胰蛋白酶，在37摄氏度水浴中孵育10分钟。用火焰抛光的巴斯德移液管轻轻吹打，使细胞解离。
将样品通过70微米滤网，利用神经元铺板法收集清晰的神经元细胞悬液。使用添加5% FBS的培养基进行接种，在组装好的MCP板右侧加入150微升神经元。
神经元密度较高，因为只有附着在细胞滞留区域的神经元才能通过中央通道生长轴突，延伸至组装好的 MCP 的另一侧。第二天，小心吸出培养室细胞接种区域中的培养基，并将神经元接种培养基更换为常规神经元培养基。
在培养基中加入20纳克/毫升的胶质细胞源性神经营养因子（GDNF），添加至培养小室的星形胶质细胞侧。这将形成一种化学梯度，有助于诱导神经元侧的轴突穿过组装好的MCP中央通道生长。两天后，观察是否有轴突进入中央通道。
轴突一旦进入中央通道，通常在一天内到达对侧。轴突在进入对侧后通常保持完整至少一周。我将小鼠脑组织从P1至P3的脑片中分离后，将星形胶质细胞接种于聚氨酯包被的10厘米培养皿中。
培养时，前两天每天更换星形胶质细胞培养基，之后每三天更换一次，持续七天，直至星形胶质细胞形成约90%融合的单层，用胰酶消化收获细胞。神经元接种后约五天，吸除GDNF。然后将重悬的星形胶质细胞取150 µL接种至组装好的MCP左侧。当轴突即将进入或刚刚进入MCP左侧时，这些轴突会与星形胶质细胞直接接触，或通过释放可溶性因子与之相互作用。
观察星形胶质细胞是否附着于细胞滞留区域。对隔室化共培养系统中的细胞进行免疫染色，以观察轴突与星形胶质细胞相互作用相关特异性蛋白的表达。隔室化神经元与星形胶质细胞共培养系统仅允许神经元突起（尤其是轴突）选择性地与星形胶质细胞发生相互作用。
本文描述了轴突诱导的星形胶质细胞谷氨酸转运体的转录激活。这些研究使用了转基因小鼠，其在GT1基因组启动子控制下表达EGF荧光报告基因。在组装的MCPA装置的细胞滞留区域培养高密度神经元，放大视图显示，经βIII微管蛋白染色标记的轴突穿过中央通道并延伸至对侧，显示出轴突生长锥的形态。
MCP 系统可用于监测轴突束在穿过中央通道并进入另一侧时的生长情况。对 GT1 进行免疫染色可识别 MCP 系统胶质侧出现的星形胶质细胞。图像显示此处轴突与 GLT1 阳性星形胶质细胞之间的接触。
EGFP 报告基因的表达与内源性 GT1 启动子的激活、蛋白表达及功能活性相关。在 C2 的单个星形胶质细胞中对 GT1 启动子活性的评估显示，在区室化共培养系统中 GLT1 免疫反应性显著增强。重要的是，MCP 系统可实现延时成像，用于监测动态变化。
例如，这些数据表明，在星形胶质细胞接种一天后，轴突可诱导GT1启动子在反向GT1-EGFP星形胶质细胞与野生型神经元共培养体系中的激活。此时仅观察到极微弱的EGFP荧光信号。在共培养48小时后，EGFP荧光强度显著增强，此时轴突已深入星形胶质细胞区域，并在此处与星形胶质细胞发生直接接触。
在组装的MCP神经元侧施用奎宁可诱导神经元细胞死亡。有趣的是，它还刺激了轴突回缩和退化，以及轴突EGFP荧光的减弱。EGFP荧光强度在轴突响应下的这些动态变化明确表明，星形胶质GT1启动子活性受到轴突相互作用的调控。
观看本视频后，您应能充分理解如何利用微流控培养平台建立核心培养体系。一旦掌握该技术，便可在数天内正确完成操作。
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概述
本研究建立了一种新型的神经元轴突与星形胶质细胞共培养平台，用于通过高分辨率成像分析神经元与胶质细胞之间的相互作用。该平台能够调控单个轴突与单个胶质细胞之间的直接相互作用，有助于对其信号传导机制进行深入分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 神经生物学
背景
- 理解神经元-胶质细胞相互作用对于阐明神经功能至关重要。
- 现有方法在分离特定细胞相互作用方面常常存在困难。
- 共培养系统旨在克服这些局限性。
- 高密度神经元接种对于成功诱导轴突生长至关重要。
研究目的
- 建立一个用于研究神经元-胶质细胞信号传导的平台。
- 实现对细胞相互作用的高分辨率成像。
- 促进对神经元过程的机制性理解。
使用的方法
- 微流控培养室的组装。
- 神经元培养物的制备。
- 诱导神经元轴突进入独立隔室。
- 使用共聚焦免疫荧光显微镜进行延时成像。
主要结果
- 成功建立一种区室化共培养系统。
- 可视化轴突与星形胶质细胞之间的相互作用。
- 深入理解神经元-胶质细胞信号传导的动力学过程。
- 识别初学者在使用该方法时面临的技术挑战。
结论
- 共培养平台是神经科学研究中一种有价值的工具。
- 它能够实现对神经元-胶质细胞相互作用的详细分析。
- 未来的研究可在此方法基础上进一步探索多种神经生物学问题。
常见问题
行业高管相关性
这种微流控共培养平台解决了神经科学靶点验证中的一个关键挑战：在排除胞体或树突输入干扰的情况下，分离轴突-胶质细胞信号传导机制。通过实现分区培养以及对单个轴突-胶质细胞相互作用进行高分辨率成像，该系统有助于降低与神经退行性通路相关的治疗靶点的机制性风险。该方法通过明确观察到的表型是源于直接的膜接触还是可溶性因子释放，从而提高早期发现阶段的预测可信度。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够研究胶质细胞中轴突特异性的信号通路（例如谷氨酸转运体的调控），以验证相关机制假说。
- 操作价值：在靶点验证实验中，通过区分直接接触介导的效应与可溶性因子的作用，减少假阳性结果。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：通过荧光报告分子强度，提供一个标准化、可重复的平台，用于量化胶质细胞对轴突刺激的反应。
- 操作价值：借助微流控设计，减少试剂使用，并支持多种条件的平行测试，从而提升检测的可扩展性。
转化与临床前研究
- 科学价值：通过将轴突输入与胶质细胞功能读数（例如 GLT-1 表达）相关联，促进生物标志物的一致性，适用于兴奋性毒性模型。
- 操作价值：实现对动态相互作用的延时监测，支持在临床前模型中对靶点结合进行纵向评估。
流程与工作流整合
该系统适用于从靶点假设验证到先导化合物发现的研究连续体，尤其适用于靶向神经元-胶质细胞通讯通路的神经治疗药物研发。
- 发现生物学：通过分离轴突对胶质细胞转录激活的贡献，减少靶点验证中的机制模糊性，从而支持通路解析。
- 筛选：提供基于成像的定量读数（例如EGFP强度），实现对化合物在轴突-胶质细胞信号传导中作用的剂量-反应分析。
- 分析：生成可测量的输出，如启动子活性和蛋白质表达水平，允许在不同实验条件下进行统计学比较。
- 转化研究：通过模拟与肌萎缩侧索硬化症（ALS）及其他神经退行性疾病机制相关的轴突-胶质细胞相互作用，衔接临床前研究的连续性。
- 企业级复用：该微流控平台可适配多种细胞类型和信号轴，支持在多个发现项目中重复使用。
运营与企业影响
- 科学价值：通过降低对疾病模型中神经元-胶质细胞通讯机制假设的风险，提高靶点验证的可信度。
- 操作价值：通过标准化的腔室设计和明确的包被方案，增强实验可重复性，减少不同实验室间的变异性。
- 战略价值：通过明确治疗效应是否需要直接轴突接触或可由可扩散因子介导，为“推进/终止”决策提供依据。
- 项目组合影响：基于生理相关形式下已验证的轴突依赖性胶质细胞反应，实现对靶点的风险调整后优先排序。
实施注意事项
- 可靠的轴突诱导和数据采集需要具备神经元培养、微流控操作和共聚焦成像方面的专业技术。
- 依赖于适当的表面包被（聚氨酯和层粘连蛋白）以及无泄漏的装置组装，以在共培养过程中维持各腔室的分隔性。
- 需要优化神经元接种密度和GDNF浓度梯度的建立，以确保轴突稳定进入胶质细胞腔室。
- 若将该系统应用于其他类型的神经元或胶质细胞，可能需要重新验证包被条件和微通道尺寸，以适应特定过程的迁移需求。
- 实际应用中的限制包括需要专用的成像设备和技术能力，以随时间分辨单个轴突-胶质细胞接触事件。
生物制药常见问题
Chapters in this video
0:05
Title
1:27
Assembly of the Microfluidic Culture Chamber (MCP)
2:43
Preparation of Neuronal Culture
3:33
Induction of Neuronal Axons in Assembled MCP
4:48
A Compartmentalized Co-culture System: Adding Cultured Astrocytes
6:15
Results: Axon-induced GLT1 Promoter Activation in Astrocytes
9:07
Conclusion
