Name: 神经元对神经胶质细胞在微流控文化互动平台（MCP）的神经元轴突和神经胶质细胞共培养系统的影像学分析 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 学习利用微流控培养平台建立神经元轴突与星形胶质细胞共培养系统，通过高分辨率共聚焦免疫荧光成像技术实时观察神经元与胶质细胞的相互作用机制，为神经科学研究提供重要的实验方法。

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我们感谢 Jeffrey Rothstein 博士提供 BAC GLT1 eGFP 小鼠和 GLT1 抗体；感谢塔夫茨神经科学研究中心（NIH P30 NS047243；项目负责人：Rob Jackson）提供宝贵的核心设施；感谢塔夫茨大学神经科学系新教员招聘基金（NIH P30 5P30NS069254-02；项目负责人：Phil Haydon）。

1. 微流控培养室（MCP）的组装
<ol>
 <li>MCP（图1）是设计用于不同类型细胞分隔培养的开放式腔室4。它通常具有两个通过中央通道（直径3 μm）相连的培养区。将MCP与玻璃底培养皿组装在一起，是进行培养及后续成像分析的必要步骤。</li>
 <li>首先，将多聚鸟氨酸（Polyornithine，Sigma-Aldrich，1 mg/ml）溶于四硼酸钠（sodium tetraborate，Sigma-Aldrich，10 mM，pH 8.5）中，涂布于无菌的玻璃底培养皿表面，并在37 °C下孵育过夜。</li>
 <li>次日，用ddH2O将已涂布的玻璃底培养皿清洗三次，并在无菌通风橱中干燥。随后，将层粘连蛋白（laminin，Sigma-Aldrich，1 mg/ml）涂布于培养皿表面，并在紫外光下照射干燥1小时。涂布完成的培养皿可立即使用，或保存于-20 °C备用。这些涂层对于共培养体系中神经元和星形胶质细胞的贴壁生长至关重要。</li>
 <li>为组装培养平台，需将微流控培养装置放置于已涂布的玻璃底培养皿上，使其底部的中央连接通道对准，形成紧密密封。从细胞接种区域向MCP两侧加入常规的神经元或星形胶质细胞培养基（图1），并在37 °C孵育2–4小时，以确保MCP与玻璃底培养皿之间无泄漏。我们在接种细胞前已使用培养基进行过泄漏测试。MCP与玻璃底培养皿的组装应于使用前新鲜制备。</li>
</ol>
2. 神经元培养的制备及在组装的 MCP 中诱导神经元轴突
<ol>
 <li>皮层神经元细胞培养物由胚胎14-16天的小鼠脑组织新鲜制备。神经元培养基由Neurobasal培养基、2% B27神经元培养添加剂、通过添加1%的100倍浓缩GlutaMAX获得的2 mM谷氨酰胺，以及1%青霉素-链霉素组成。在解剖显微镜下分离小鼠脑组织后，去除大脑皮层表面的软脑膜。随后用刀片将组织切碎成小块，以增加暴露于胰蛋白酶的表面积。组织块在37 °C水浴中用胰蛋白酶（Sigma-Aldrich，0.05%胰蛋白酶）消化10分钟，然后用火焰抛光的巴斯德移液管轻柔吹打使细胞分散。将分散后的细胞通过70 μm细胞筛过滤，以获得澄清的神经元细胞悬液。</li>
 <li>将新鲜制备的神经元（2-3 × 106/ml，150 μl）接种于组装好的MCP右侧的细胞接种区（图1），使神经元能够附着于细胞滞留区（图1）。使用补充了5%胎牛血清（Hyclone）的神经元接种培养基，将新鲜制备的神经元接种至常规神经元培养基中。由于只有附着在细胞滞留区的神经元才能通过中央通道向MCP的另一侧生长轴突，因此在细胞接种区接种高密度神经元至关重要，以确保足够数量的神经元附着于细胞滞留区。高密度神经元轴突的代表性图像见图2A。</li>
 <li>次日，将神经元接种培养基更换为常规神经元培养基。换液时需小心地从培养室的细胞接种区吸除培养基，但不得从MCP组装体的细胞滞留区吸液，以避免在细胞滞留区及中央连接通道中产生气泡。气泡会严重抑制轴突的生长及其进入MCP中央通道的过程。同一天，还需在培养室的另一侧（左侧）加入胶质细胞源性神经营养因子（GDNF，10-20 ng/ml），以促进神经元侧轴突的生长5，并使其穿过MCP组装体的中央通道（图2A）。即使未添加GDNF，也可观察到神经元侧出现一定量的自发性神经突起生长，并穿过MCP组装体的中央通道。通常在接种后2-3天可观察到轴突进入中央通道，一旦进入，通常在一天内即可到达对侧。轴突在进入对侧后通常可保持完整至少一周。</li>
</ol>
3. 向MCP中添加培养的星形胶质细胞以建立区室化共培养系统
原代星形胶质细胞培养物从小鼠出生后1至3天（P1-3）的幼鼠脑组织中分离获得。脑组织解离步骤与上述神经元细胞分离步骤类似。星形胶质细胞首先接种于预先包被多聚鸟氨酸（Polyornithine，Sigma-Aldrich，1 mg/ml）的10 cm培养皿中。星形胶质细胞培养基（DMEM，10%胎牛血清，1%青霉素-链霉素）在接下来的两天内每天更换，以去除碎片；之后每三天更换一次培养基。
<ol>
 <li>星形胶质细胞在培养7天后达到约90%融合，并形成单层。当轴突即将进入或刚刚进入组装好的MCP左侧时，将融合的星形胶质细胞用胰酶消化，并将150 μl重悬的星形胶质细胞（1×106/ml）重新接种至MCP左侧的细胞接种区域。星形胶质细胞通常在神经元接种后4–5天进行接种。在将星形胶质细胞重新接种至MCP左侧之前，需先去除GDNF。重新接种的星形胶质细胞附着于细胞滞留区域，GFAP免疫染色结果如图1所示。如先前研究所示4,6，在MCP中，室两侧之间的培养基流动极小（通过荧光染料测定）。</li>
 <li>星形胶质细胞在培养7天后达到约90%融合，并形成单层。当轴突即将进入或刚刚进入组装好的MCP左侧时，将融合的星形胶质细胞用胰酶消化，并将150 μl重悬的星形胶质细胞（1×106/ml）重新接种至MCP左侧的细胞接种区域。星形胶质细胞通常在神经元接种后4–5天进行接种。在将星形胶质细胞重新接种至MCP左侧之前，需先去除GDNF。重新接种的星形胶质细胞附着于细胞滞留区域，GFAP免疫染色结果如图1所示。如先前研究所示4,6，在MCP中，室两侧之间的培养基流动极小（通过荧光染料测定）。</li>
 <li>重新接种星形胶质细胞后，进入组装好的MCP左侧的轴突可通过直接的轴突接触或释放可溶性因子的方式与星形胶质细胞直接相互作用。通过GLT1（星形胶质细胞质膜谷氨酸转运体）和神经元βIII-微管蛋白的免疫染色，可观察轴突与星形胶质细胞之间的相互作用，结果如图2D–F所示。</li>
</ol>

<ol><li>Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-astrocyte+signaling+in+the+development+and+plasticity+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Signals%22%5BJournal%5D)">Neuron-astrocyte signaling in the development and plasticity of neural circuits.</a> Neuro-Signals. 16, 278-288 (2008).</li>
<li>Paixao, S., Klein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuron-astrocyte+communication+and+synaptic+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">Neuron-astrocyte communication and synaptic plasticity.</a> Current opinion in neurobiology. 20, 466-473 (2010).</li>
<li>Fields, R. D., Stevens-Graham, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+neuron-glia+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">New insights into neuron-glia communication.</a> Science. 298, 556-562 (2002).</li>
<li>Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+culture+platform+for+neuroscience+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Microfluidic culture platform for neuroscience research.</a> Nature. 1, 2128-2136 (2006).</li>
<li>Wang, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neuromuscular+synapse+development+by+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor+and+neurturin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of neuromuscular synapse development by glial cell line-derived neurotrophic factor and neurturin.</a> The Journal of biological chemistry. 277, 10614-10625 (2002).</li>
<li>Yang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+regulation+of+astroglial+excitatory+neurotransmitter+transporter+GLT1%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Presynaptic regulation of astroglial excitatory neurotransmitter transporter GLT1.</a> Neuron. 61, 880-894 (2009).</li>
<li>Regan, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variations+in+promoter+activity+reveal+a+differential+expression+and+physiology+of+glutamate+transporters+by+glia+in+the+developing+and+mature+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Variations in promoter activity reveal a differential expression and physiology of glutamate transporters by glia in the developing and mature CNS.</a> The Journal of neuroscience. 27, 6607-6619 (2007).</li>
<li>Swanson, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+regulation+of+glutamate+transporter+subtype+expression+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal regulation of glutamate transporter subtype expression in astrocytes.</a> The Journal of neuroscience. 17, 932-940 (1997).</li>
<li>Schlag, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+glial+Na%2B-dependent+glutamate+transporters+by+cyclic+AMP+analogs+and+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+pharmacology%22%5BJournal%5D)">Regulation of the glial Na+-dependent glutamate transporters by cyclic AMP analogs and neurons.</a> Molecular pharmacology. 53, 355-369 (1998).</li>
<li>Ponomarev, E. D., Novikova, M., Maresz, K., Shriver, L. P., Dittel, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+culture+system+that+supports+adult+microglial+cell+proliferation+and+maintenance+in+the+resting+state%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological%22%5BJournal%5D)">Development of a culture system that supports adult microglial cell proliferation and maintenance in the resting state.</a> Journal of immunological. 300, 32-46 (2005).</li>
<li>Espinosa-Jeffrey, A., Wakeman, D. R., Kim, S. U., Snyder, E. Y., de Vellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+system+for+rodent+and+human+oligodendrocyte+specification%2C+lineage+progression%2C+and+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+stem+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Culture system for rodent and human oligodendrocyte specification, lineage progression, and maturation.</a> Current protocols in stem cell biology. Chapter 2, (2009).</li>
<li>Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+and+magic+of+glia%3A+a+perspective+on+their+roles+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease.</a> Neuron. 60, 430-440 (2008).</li>
<li>Debanne, D., Rama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytes+shape+axonal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science+signaling%22%5BJournal%5D)">Astrocytes shape axonal signaling.</a> Science signaling. 4, pe11(2011).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

基于微流控芯片（MCP）的神经元与星形胶质细胞共培养系统，可通过仅允许轴突穿过中央通道并与星形胶质细胞相互作用，从而解析神经元到星形胶质细胞之间详细的信号通路。该共培养系统可方便地结合传统的神经元和星形胶质细胞培养步骤建立。我们还描述了该共培养系统的一个实际应用，即利用基于eGFP的报告基因系统，展示星形胶质细胞中轴突依赖性的GLT1启动子激活。
	基于微流控芯片（MCP）的神经元与星形胶质细胞共培养系统相较于传统共培养方法具有多项优势：1）可在高分辨率显微镜下实时观察并明确识别单根轴突与星形胶质细胞之间的形态学相互作用；2）提供高度可控的独立微环境，便于实施药理学干预以研究细胞特异性效应；3）可分析仅在受轴突接触调控的星形胶质细胞中被诱导或上调的启动子激活及蛋白表达。原代小胶质细胞的培养步骤10 和少突胶质细胞11 已得到充分验证，该MCP共培养系统也可应用于神经元与小胶质细胞、神经元与少突胶质细胞的共培养。同时，我们认识到，该共培养系统适用于单细胞水平的高灵敏度图像分析，可与传统的大量细胞分析方法（如RNA或蛋白质分析）形成互补。此外...

<table><tbody><tr><td>胎牛血清</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td>用于神经元接种的神经元培养基</td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135</td><td>用于星形胶质细胞培养基</td></tr><tr><td>胶质细胞源性神经营养因子</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>212-GD</td><td>在室的神经元侧加入10-20 ng/ml</td></tr><tr><td>高糖型达尔伯克改良伊格尔培养基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11995</td><td></td></tr><tr><td>70 mm 细胞筛</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>无菌玻璃底培养皿</td><td>MatTek Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>微流控培养平台</td><td>Xona Microfluidics LLC</td><td>SND150</td><td></td></tr><tr><td>培养板中的6个孔</td><td>Cellstar</td><td>657 160</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;神经元培养基&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; &lt;ul&gt; &lt;李&gt;Neurobasal 培养基&lt;/li&gt; &lt;李&gt;2% B27 神经基础培养基添加剂&lt;/li&gt; &lt;李&gt;通过加入1% 100倍浓缩的GlutaMAX，添加至终浓度为2 mM谷氨酸&lt;/li&gt; &lt;李&gt;1% 青霉素-链霉素&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt; </td></tr><tr><td colspan="4"> &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;用于细胞接种的神经元培养基&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; &lt;ul&gt; &lt;李&gt;Neurobasal 培养基&lt;/li&gt; &lt;李&gt;2% B27 神经基础培养基添加剂&lt;/li&gt; &lt;李&gt;通过加入1% 100倍浓缩的GlutaMAX，添加至终浓度为2 mM谷氨酸&lt;/li&gt; &lt;李&gt;1% 青霉素-链霉素&lt;/li&gt; &lt;李&gt;5% 胎牛血清 SH30070.03&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt; </td></tr><tr><td colspan="4"> &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;星形胶质细胞培养基&lt;/strong&gt;&lt;/p&gt; &lt;ul&gt; &lt;李&gt;高糖型达尔伯克改良伊格尔培养基&lt;/li&gt; &lt;李&gt;10% 胎牛血清 F4135&lt;/li&gt; &lt;li&gt;1% 青霉素-链霉素&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt; </td></tr><tr><td colspan="4"> &lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;强&gt;表1. &lt;/strong&gt; 基于微流控培养平台的神经元轴突与胶质细胞共培养系统所用材料&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

基于微流控培养平台（mcp）的神经元轴突与胶质细胞共培养系统中神经元-胶质细胞相互作用的成像分析

Imaging Analysis of Neuron to Glia Interaction in Microfluidic Culture Platform (MCP)-based Neuronal Axon and Glia Co-culture System

神经元与胶质细胞之间的正常相互作用对中枢神经系统（CNS）的生理功能至关重要。这种双向通信由神经元与胶质细胞之间特定的信号通路精密介导1,2。鉴定并表征这些信号通路，对于理解神经元-胶质细胞相互作用如何塑造中枢神经系统的生理功能具有重要意义。以往，神经元与胶质细胞共培养体系被广泛用于测试和表征神经元与胶质细胞之间的信号通路。然而，从这些培养体系及其他体内工具所获得的研究结果表明，神经元与胶质细胞之间的相互信号传递通常发生在神经元的特定区室中（例如，轴突、树突或胞体）3。因此，建立一种能够分离神经元区室、并可特异性研究胶质细胞与神经元轴突/树突之间相互作用的新型培养系统显得尤为重要。此外，传统的混合培养体系无法区分神经元与胶质细胞之间的可溶性因子信号与直接膜接触信号。同时，传统共培养体系中大量神经元和胶质细胞的存在，也缺乏观察单根轴突与单个胶质细胞之间相互作用所需的分辨率。
	在本研究中，我们描述了一种利用微流体培养平台（MCP）构建的新型轴突与胶质细胞共培养系统。在此共培养系统中，神经元和胶质细胞分别培养于两个通过多个中央通道相连的独立腔室中。在该微流体培养平台上，只有神经元的突起（尤其是轴突）能够通过中央通道进入胶质细胞侧。结合高效的荧光蛋白标记技术，该系统可直接观察轴突/树突与胶质细胞之间相互作用的信号通路，例如轴突介导的胶质细胞转录调控、胶质细胞介导的神经元末端受体运输以及胶质细胞介导的轴突生长。此外，通道的狭窄直径显著阻止了富含神经元的培养基流入胶质细胞腔室，从而有助于探究轴突/树突与胶质细胞表面之间的直接膜蛋白相互作用。

星形胶质细胞中轴突诱导的GLT1启动子活化的时间推移成像分析
分隔式神经元与星形胶质细胞共培养系统可使神经元突起（尤其是轴突）选择性地与星形胶质细胞相互作用。在组装好的微流控装置（MCP）中成功建立轴突与星形胶质细胞（或其他胶质细胞）的共培养后，可研究多种类型的轴突-胶质细胞相互作用，例如：轴突诱导的星形胶质细胞基因启动子激活、星形胶质细胞诱导的轴突导向、轴突诱导的星形胶质细胞Ca2+反应，以及轴突诱导的少突胶质细胞髓鞘合成。上述所有应用均得益于可用于胶质细胞的高效荧光报告系统或加载至这些细胞的荧光染料。
在此，我们利用细菌人工染色体（BAC）GLT1 eGFP 转基因小鼠及这种区室化共培养系统，描述了轴突诱导的星形胶质细胞谷氨酸转运体1（GLT1）启动子的转录激活。在BAC GLT1 eGFP转基因小鼠中，eGFP荧光报告基因在GLT1基因组启动子的调控下过表达。7eGFP 报告基因的表达与内源性 GLT1 启动子激活、蛋白表达及功能活性相关7 从而允许对单个星形胶...

本研究描述了一种新型神经元轴突与（星形）胶质细胞共培养平台的建立步骤。在此共培养系统中，可实现对单个轴突（及单个胶质细胞）之间直接相互作用的操控，从而能够对神经元与胶质细胞之间的相互信号传导机制进行分析。

基于微流控培养平台（MCP）的神经元轴突与胶质细胞共培养系统中神经元-胶质细胞相互作用的成像分析

神经元与胶质细胞之间的正常相互作用对中枢神经系统（CNS）的生理功能至关重要。这种双向通信是……

本方案建立了一种新型的神经元轴突与星形胶质细胞共培养平台，用于通过高分辨率成像分析神经元与胶质细胞之间的相互作用。首先，组装微流控培养室，制备神经元培养物，并诱导神经元轴突进入微流控芯片（MCP）的另一侧。随后，加入培养的星形胶质细胞，建立区室化共培养系统；实验结果表明，采用共聚焦免疫荧光显微镜进行活细胞延时成像有助于深入理解轴突、星形胶质细胞以及神经元轴突之间的相互作用。我们最初是在尝试分离神经元突起与神经元分泌物对GT信号调控的影响时，提出了该方法的构想。通常情况下，刚接触该方法的研究人员在诱导轴突进入细胞区室的其他部分时会遇到困难。这要求在神经元侧接种高密度的健康神经元，且神经元需靠近中央通道。MCP 开放式培养室适用于不同类型细胞的分隔共培养，共培养中接种神经元和星形胶质细胞需要使用聚氨酯和层粘连蛋白涂层。首先，将浓度为每毫升一毫克的聚氨酯溶液加入无菌玻璃底培养皿中，于 37 摄氏度孵育过夜。用双蒸水将包被后的玻璃底培养皿清洗三次，然后置于无菌超净台中干燥。接下来，用浓度为每毫升一毫克的层粘连蛋白包被培养皿，并在紫外光下干燥一小时。使用前应 freshly 制备 MCP 在玻璃底培养皿上的组装。将微流控培养平台的中央连接通道朝下放置，与包被过的玻璃表面形成紧密密封。底部培养皿。在组装好的MCP两侧加入常规的神经元或星形胶质细胞培养基。将培养室置于37摄氏度孵育2至4小时，并确认MCP与玻璃之间无泄漏。底部培养皿。皮质神经元细胞培养物从胚胎期14至16天的小鼠脑组织中新鲜制备。在解剖小鼠脑组织后，在解剖显微镜下剥离大脑皮层的脑膜。使用剃须刀片将组织切成小块，离心后将组织块放入离心管中。弃去沉淀上方的培养基，加入0.05%胰蛋白酶，在37摄氏度水浴中孵育10分钟。用火焰抛光的巴斯德移液管轻轻吹打，使细胞解离。将样品通过70微米滤网，利用神经元铺板法收集清晰的神经元细胞悬液。使用添加5% FBS的培养基进行接种，在组装好的MCP板右侧加入150微升神经元。神经元密度较高，因为只有附着在细胞滞留区域的神经元才能通过中央通道生长轴突，延伸至组装好的 MCP 的另一侧。第二天，小心吸出培养室细胞接种区域中的培养基，并将神经元接种培养基更换为常规神经元培养基。在培养基中加入20纳克/毫升的胶质细胞源性神经营养因子（GDNF），添加至培养小室的星形胶质细胞侧。这将形成一种化学梯度，有助于诱导神经元侧的轴突穿过组装好的MCP中央通道生长。两天后，观察是否有轴突进入中央通道。轴突一旦进入中央通道，通常在一天内到达对侧。轴突在进入对侧后通常保持完整至少一周。我将小鼠脑组织从P1至P3的脑片中分离后，将星形胶质细胞接种于聚氨酯包被的10厘米培养皿中。培养时，前两天每天更换星形胶质细胞培养基，之后每三天更换一次，持续七天，直至星形胶质细胞形成约90%融合的单层，用胰酶消化收获细胞。神经元接种后约五天，吸除GDNF。然后将重悬的星形胶质细胞取150 µL接种至组装好的MCP左侧。当轴突即将进入或刚刚进入MCP左侧时，这些轴突会与星形胶质细胞直接接触，或通过释放可溶性因子与之相互作用。观察星形胶质细胞是否附着于细胞滞留区域。对隔室化共培养系统中的细胞进行免疫染色，以观察轴突与星形胶质细胞相互作用相关特异性蛋白的表达。隔室化神经元与星形胶质细胞共培养系统仅允许神经元突起（尤其是轴突）选择性地与星形胶质细胞发生相互作用。本文描述了轴突诱导的星形胶质细胞谷氨酸转运体的转录激活。这些研究使用了转基因小鼠，其在GT1基因组启动子控制下表达EGF荧光报告基因。在组装的MCPA装置的细胞滞留区域培养高密度神经元，放大视图显示，经βIII微管蛋白染色标记的轴突穿过中央通道并延伸至对侧，显示出轴突生长锥的形态。MCP 系统可用于监测轴突束在穿过中央通道并进入另一侧时的生长情况。对 GT1 进行免疫染色可识别 MCP 系统胶质侧出现的星形胶质细胞。图像显示此处轴突与 GLT1 阳性星形胶质细胞之间的接触。EGFP 报告基因的表达与内源性 GT1 启动子的激活、蛋白表达及功能活性相关。在 C2 的单个星形胶质细胞中对 GT1 启动子活性的评估显示，在区室化共培养系统中 GLT1 免疫反应性显著增强。重要的是，MCP 系统可实现延时成像，用于监测动态变化。例如，这些数据表明，在星形胶质细胞接种一天后，轴突可诱导GT1启动子在反向GT1-EGFP星形胶质细胞与野生型神经元共培养体系中的激活。此时仅观察到极微弱的EGFP荧光信号。在共培养48小时后，EGFP荧光强度显著增强，此时轴突已深入星形胶质细胞区域，并在此处与星形胶质细胞发生直接接触。 在组装的MCP神经元侧施用奎宁可诱导神经元细胞死亡。有趣的是，它还刺激了轴突回缩和退化，以及轴突EGFP荧光的减弱。EGFP荧光强度在轴突响应下的这些动态变化明确表明，星形胶质GT1启动子活性受到轴突相互作用的调控。观看本视频后，您应能充分理解如何利用微流控培养平台建立核心培养体系。一旦掌握该技术，便可在数天内正确完成操作。

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神经科学

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近期研究揭示了神经元对高级别儿童胶质瘤（pHGG）细胞的影响及其双向相互作用。本研究展示了 体外...

谷氨酸能神经元与儿童高级别胶质瘤细胞在微流控装置中的共培养以评估电相互作用

本方案描述了一种小胶质细胞-神经元共培养体系，该体系由从小鼠胚胎第15-16天分离的原代神经元细胞以及从出生后第1-2天新生小鼠脑组织中获取的原代小胶质细胞建立而成。...

生成并共培养小鼠原代小胶质细胞与皮层神经元

本方案描述了一种用于模拟轴突损伤后神经元代谢动态的微流控系统，可实现成像、多组学分析以及内在代谢重塑的机制研究。...

用于构建轴突损伤模型并实现多组学分析的微流控芯片

学习利用微流控培养平台建立神经元轴突与星形胶质细胞共培养系统，通过高分辨率共聚焦免疫荧光成像技术实时观察神经元与胶质细胞的相互作用机制，为神经科学研究提供重要的实验方法。

基于微流控培养平台（MCP）的神经元轴突与胶质细胞共培养系统中神经元-胶质细胞相互作用的成像分析

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