Name: 研究DNA损伤检验点爪蟾卵提取物 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 学习利用非洲爪蟾卵提取物研究DNA损伤检验点机制。本方法通过制备低速提取物和诱导DNA损伤，帮助研究人员深入理解细胞周期调控与基因组稳定性维护的关键过程。

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本工作部分得到了北卡罗来纳大学夏洛特分校、Wachovia基金会教师卓越基金以及美国国立普通医学科学研究所（NIGMS）资助（R15GM101571）的支持。

1. LSE 样品制备
<ol>
 <li>对雌性非洲爪蟾（Xenopus laevis）进行两次注射以收集卵子。第一次注射（引 priming）为每只蛙皮下注射 100 U PMSG（孕马血清促性腺激素），使用 3 ml 注射器和 27 G 针头注入背侧淋巴囊。引 priming 至少需在诱导产卵前两天进行，引 priming 后的蛙可在两周内使用。</li>
 <li>为诱导产卵，对已引 priming 的蛙每只皮下注射 500 U hCG（人绒毛膜促性腺激素），使用 27 G 针头注入背侧淋巴囊。将注射后的蛙分别置于盛有 2 升 1×Marc's 改良林格液（MMR）的桶中孵育。让蛙在收集卵子前孵育 14–20 小时。</li>
 <li>将蛙从桶中移出，倒去 MMR 溶液，保留约 100 ml。通过将卵子转移至 250 ml 烧杯中收集卵子。</li>
 <li>通过加入 100 ml 2% 半胱氨酸溶液（用 10 M KOH 调节 pH 至 7.8）对卵子进行去胶膜处理。每隔约 30 秒，用倒置的玻璃巴氏移液管（直径 0.7 cm）轻轻搅动卵子。孵育过程中更换两次新鲜的半胱氨酸溶液。当卵子在烧杯底部形成更致密的一层时，去胶膜过程即完成，通常耗时约 5–15 分钟。</li>
 <li>弃去半胱氨酸溶液，用 0.25× MMR 洗涤卵子三次。用玻璃移液管在溶液中轻轻搅动卵子。“坏”卵可通过肉眼观察识别，外观呈蓬松白色。搅动后，“坏”卵会聚集在烧杯中央，用巴氏移液管将其移除。</li>
 <li>用卵裂解缓冲液（ELB）洗涤卵子三次。再次用巴氏移液管移除任何额外的“坏”卵。将卵子倒入 14 ml Falcon 管中。</li>
 <li>使用 CL2 IEC 临床台式离心机配备摆动桶转子，以 188 × g（1,100 rpm）离心 55 秒，使卵子压紧。吸除卵层上方多余的缓冲液。每毫升压紧的卵子中加入 0.5 μl 抑肽酶/亮抑蛋白酶素原液和 0.5 μl 细胞松弛素 B 原液。</li>
 <li>使用 Sorvall RC6 plus 超速离心机配备 HB6 摆动桶转子，在 4 °C 下以 16,500 × g（10,000 rpm）离心 15 分钟。离心后，卵子在管中分为三层：从上至下依次为脂质层、提取物层和卵黄/色素层。用 21 G 针头在 Falcon 管侧面中间提取物层的下部穿刺一个小孔。小心拔出穿刺针，以防塑料堵塞。将连接于 1 ml 注射器的新鲜 21 G 针头插入穿刺孔以收集提取物。缓慢吸取提取物，避免产生气泡或混入脂质层和卵黄/色素层。</li>
 <li>将提取物置于预冷的 1.5 ml 微量离心管中。每毫升卵提取物中加入以下化学原液至指定终浓度（括号内所示）：（1）环己酰亚胺 10 μl（100 μg/ml）；（2）抑肽酶/亮抑蛋白酶素各 1 μl（10 μg/ml）；（3）细胞松弛素 B 1 μl（5 μg/ml）；（4）二硫苏糖醇 1 μl（1 mM）；（5）诺考达唑 0.33 μl（3 μg/ml）。轻柔翻转混合卵提取物至少 10 次。此即为 LSE（卵提取物），必须新鲜配制并在 4 小时内使用。LSE 超过 4 小时或经历冻融后质量将下降。</li>
</ol>
2. 精子染色质的DNA损伤处理方法
<ol>
 <li>按照先前描述的方法制备正常精子染色质13。</li>
 <li>制备MMS处理的精子染色质
 <ol>
 <li>将正常精子染色质重悬于0.5 ml Buffer X中。</li>
 <li>向500 μl重悬的染色质中加入约5.5 μl MMS（储存液浓度为9.1 M），使终浓度为100 mM。</li>
 <li>将精子染色质置于微量离心管中，在室温下旋转孵育30分钟。</li>
 <li>使用IEC CL2临床离心机配备摆动桶转子和管适配器，以686 × g（2,100 rpm）在室温下离心10分钟。</li>
 <li>弃去上清液，并将沉淀重悬于0.5 ml含BSA（3%）、DTT（0.1 mM）和抑蛋白酶肽/亮抑蛋白酶肽（各10 μg/ml）的Buffer X中。</li>
 <li>重复步骤（4）和（5）两次，以洗涤精子染色质。</li>
 <li>使用血细胞计数板测定精子染色质浓度，并稀释至100,000 精子/μl。分装5 μl至-80 °C冰箱保存，以备后续使用。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>制备UV处理的精子染色质
 <ol>
 <li>将所需量（例如 10 μl）的正常精子染色质加至一片Parafilm表面。</li>
 <li>将Parafilm放入紫外交联仪中。根据实验需求设定合适的能量参数，启动紫外线照射以损伤精子染色质。例如，达到1,000 J/m2约需21秒。</li>
 <li>紫外照射后，应立即将UV处理的精子染色质加入卵提取物中。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
3. DNA损伤模拟结构（AT70）的制备
<ol>
 <li>将两种合成寡核苷酸 poly-(dA)70（简称为 A70）和 poly-(dT)70（简称为 T70）分别溶于水中，配制成浓度为 2 μg/μl 的溶液。</li>
 <li>取 100 μl A70 和 100 μl T70 加入一个 1.5 ml 微量离心管中。将混合的合成寡核苷酸溶液置于加热块中，95 °C 煮沸 5 分钟。</li>
 <li>将加热块（连同含有 AT 混合物的离心管）取出，放置在实验台上自然冷却至室温。此温度下降过程约需 45–60 分钟。</li>
 <li>冷却后的混合物即为 AT70，终浓度为 2 μg/μl。将 10 μl AT70 分装后储存于 -20 °C 冰箱中以备后续使用。</li>
</ol>
4. 在LSE中利用受损的精子染色质或模拟DNA损伤的结构激活DNA损伤检查点
<ol>
 <li>使用受损精子染色质在 LSE 中诱导 DNA 损伤检查点
 <ol>
 <li>将 50 μl LSE 加入 1.5 ml 微量离心管中，并加入 1 μl 能量混合物和 2 μl 受损精子染色质（终浓度约为 4,000 精子/μl 反应体系）。</li>
 <li>将反应管在室温下孵育 90 分钟，每 10 分钟轻弹混匀一次。</li>
 <li>在孵育 30 分钟后，取 1 μl 反应混合物滴加到载玻片上，加入 1 μl 核染料溶液。盖上盖玻片，通过荧光显微镜观察细胞核形成情况。通常在孵育 30 分钟后可观察到圆形细胞核的形成，表明 DNA 复制已启动。</li>
 <li>取 10 μl 反应混合物加入 90 μl 样品缓冲液中。样品通过免疫印迹分析，使用抗-Chk1 P-S344 或抗-Chk1 抗体检测。</li>
 </ol>
 </li>
 <li>使用 AT70 在 LSE 中诱导 DNA 损伤检查点
 <ol>
 <li>将 50 μl LSE 加入 1.5 ml 微量离心管中，并加入 1 μl 能量混合物和 1.6 μl Tautomycin 储液。</li>
 <li>向每个反应体系中加入 1.25 μl 预制的 AT70（2 μg/μl）或水（作为阴性对照）。在室温下孵育反应体系 90 分钟，每 10 分钟轻弹混匀一次。</li>
 <li>将 10 μl 反应混合物加入 90 μl 样品缓冲液中。样品通过免疫印迹分析，使用抗-Chk1 P-S344 或抗-Chk1 抗体检测。</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
5. 代表性结果
受损的精子染色质或模拟DNA损伤的结构可在Xenopus卵提取物系统中触发由ATR/Chk1介导的DNA损伤检查点。图2A显示，MMS可诱导Chk1在Ser344位点的磷酸化（Chk1 P-S344），这是ATR激酶激活的标志。图2B显示，AT70作为一种模拟DNA损伤的结构，同样可触发Chk1的磷酸化。在这两个示例中，总Chk1样本均用作上样对照。
<img alt="DNA损伤反应示意图；ATR和Chk1通路；细胞周期阻滞；转录激活。" src="/files/ftp_upload/4449/4449fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
图1. DNA损伤检查点信号通路示意图。
<img alt="Chk1 磷酸化检测，Chk1 P-S344 条带，Western 印迹结果，蛋白质表达分析。" src="/files/ftp_upload/4449/4449fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 在 Xenopus 卵提取物中，MMS 或 AT70 处理均可诱导 Chk1 磷酸化。（A）将经 MMS 损伤的精子染色质（MMS）或正常精子染色质（Con）在卵提取物中孵育 90 分钟。通过免疫印迹检测卵提取物中 Ser344 位点的 Chk1 磷酸化（Chk1 P-S344）以及总 Chk1 的表达。（B）分别向卵提取物中加入 AT70 或水（Con）。样品也按照（A）中的方法进行免疫印迹分析。

<ol><li>Lohka, M. J., Masui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+in+vitro+of+sperm+pronuclei+and+mitotic+chromosomes+induced+by+amphibian+ooplasmic+components%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components.</a> Science. 220 (4598), 719-721 (1983).</li>
<li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATR%3A+an+essential+regulator+of+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">ATR: an essential regulator of genome integrity.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).</li>
<li>Lupardus, P. J., Van, C., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+the+ATR-mediated+checkpoint+using+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analyzing the ATR-mediated checkpoint using Xenopus egg extracts.</a> Methods. 41 (2), 222-231 (2007).</li>
<li>Lupardus, P. J., Byun, T., Yee, M. C., Hekmat-Nejad, M., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+requirement+for+replication+in+activation+of+the+ATR-dependent+DNA+damage+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A requirement for replication in activation of the ATR-dependent DNA damage checkpoint.</a> Genes Dev. 16 (18), 2327-2332 (2002).</li>
<li>Stokes, M. P., Van Hatten, R., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+is+required+for+the+checkpoint+response+to+damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA replication is required for the checkpoint response to damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> J. Cell Biol. 158 (5), 863-872 (2002).</li>
<li>Kato, K., Strauss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+an+intermediate+in+DNA+synthesis+by+HEp.2+cells+treated+with+methyl+methanesulfonate%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Accumulation of an intermediate in DNA synthesis by HEp.2 cells treated with methyl methanesulfonate.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 71 (5), 1969-1973 (1974).</li>
<li>Paulovich, A. G., Hartwell, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+checkpoint+regulates+the+rate+of+progression+through+S+phase+in+S.+cerevisiae+in+response+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A checkpoint regulates the rate of progression through S phase in S. cerevisiae in response to DNA damage.</a> Cell. 82 (5), 841-847 (1995).</li>
<li>Guo, Z., Kumagai, A., Wang, S. X., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+Atr+in+phosphorylation+of+Chk1+and+cell+cycle+regulation+in+response+to+DNA+replication+blocks+and+UV-damaged+DNA+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Requirement for Atr in phosphorylation of Chk1 and cell cycle regulation in response to DNA replication blocks and UV-damaged DNA in Xenopus egg extracts.</a> Genes Dev. 14 (21), 2745-2756 (2000).</li>
<li>Jazayeri, A., Balestrini, A., Garner, E., Haber, J. E., Costanzo, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mre11-Rad50-Nbs1-dependent+processing+of+DNA+breaks+generates+oligonucleotides+that+stimulate+ATM+activity%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO.+J%22%5BJournal%5D)">Mre11-Rad50-Nbs1-dependent processing of DNA breaks generates oligonucleotides that stimulate ATM activity.</a> EMBO. J. 27 (14), 1953-1962 (2008).</li>
<li>Kumagai, A., Dunphy, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claspin%2C+a+novel+protein+required+for+the+activation+of+Chk1+during+a+DNA+replication+checkpoint+response+in+Xenopus+egg+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Claspin, a novel protein required for the activation of Chk1 during a DNA replication checkpoint response in Xenopus egg extracts.</a> Mol. Cell. 6 (4), 839-849 (2000).</li>
<li>Yan, S., Lindsay, H. D., Michael, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+requirement+for+Xmus101+in+ATR-mediated+phosphorylation+of+Claspin+bound+Chk1+during+checkpoint+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct requirement for Xmus101 in ATR-mediated phosphorylation of Claspin bound Chk1 during checkpoint signaling.</a> J. Cell Biol. 173 (2), 181-186 (2006).</li>
<li>Shiotani, B., Zou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-stranded+DNA+orchestrates+an+ATM-to-ATR+switch+at+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-stranded DNA orchestrates an ATM-to-ATR switch at DNA breaks.</a> Mol. Cell. 33 (5), 547-558 (2009).</li>
<li>Tutter, A. V., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+DNA+replication+in+a+soluble+cell-free+system+derived+from+Xenopus+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs.</a> Methods Mol. Biol. 322, 121-137 (2006).</li>
<li>Cross, M. K., Powers, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Fractionation+of+Xenopus+laevis+Egg+Extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation and Fractionation of Xenopus laevis Egg Extracts.</a> J. Vis. Exp. (18), e891(2008).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

利用非洲爪蟾（Xenopus）卵提取物研究DNA损伤检查点具有多个优势。使用卵提取物可获得大量处于细胞周期间期且同步化的无细胞提取物。卵提取物的制备方法简便且成本低廉。在从卵提取物中免疫耗竭目标蛋白后，可相对容易地对DNA或染色质造成损伤，并揭示DNA损伤检查点的缺陷。随后，通过回补野生型或突变型重组蛋白，可“挽救”潜在的功能缺陷。因此，非洲爪蟾（Xenopus）卵提取物是分析DNA损伤检查点结构与功能的一个强大模型系统。
LSE 的制备方法此前已有报道14，但我们的实验方案进行了一些改进。注射hCG后孵育青蛙的温度（18 °C）对产卵至关重要。有关青蛙处理与注射的更多资源可参考以往研究13,14以及互联网资料，例如 <a href="http://tropicalis.berkeley.edu/home/obtaining_embryos/hcg/hCG.html" target="_blank">tropicalis.berkeley.edu/home/obtaining_embryos/hcg/h...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>抗-Chk1 P-S344 抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>2348L</td><td></td></tr><tr><td>抗-Chk1 抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>SC7898</td><td></td></tr><tr><td>抑肽酶</td><td>MP Biomedicals</td><td>0219115880</td><td></td></tr><tr><td>放线菌酮</td><td>Sigma</td><td>C7698-5G</td><td></td></tr><tr><td>细胞松弛素 B</td><td>EMD</td><td>250233</td><td></td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）</td><td>VWR</td><td>JTF780-2</td><td></td></tr><tr><td>hCG</td><td>Sigma</td><td>CG10-10VL</td><td></td></tr><tr><td>L-半胱氨酸</td><td>Sigma</td><td>C7352-1KG</td><td></td></tr><tr><td>亮抑蛋白酶肽</td><td>VWR</td><td>97063-922</td><td></td></tr><tr><td>甲基磺酸甲酯（MMS）</td><td>Sigma</td><td>129925-5G</td><td></td></tr><tr><td>诺考达唑</td><td>Sigma</td><td>M1404-2MG</td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Calbiochem</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>上样缓冲液</td><td>Sigma</td><td>S3401</td><td></td></tr><tr><td>梭链孢酸</td><td>Wako Chemicals USA</td><td>209-12041</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>产卵桶</td><td>Rubbermaid commercial products</td><td>6308</td><td></td></tr><tr><td>CL2 IEC 离心机（带摆动转子）</td><td>Thermo Scientific</td><td>004260F</td><td></td></tr><tr><td>HB6 摆动转子</td><td>Thermo Scientific</td><td>11860</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall RC6 plus 超速离心机</td><td>Thermo Scientific</td><td>46910</td><td></td></tr><tr><td>紫外交联仪</td><td>UVP</td><td>95-0174-01</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;溶液&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>1x MMR</td><td></td><td></td><td>100 mM NaCl, 2 mM KCl, 0.5 mM MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 2.5 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 5 mM HEPES, 用 10 M NaOH 调节 pH 至 7.8</td></tr><tr><td>抑肽酶/亮抑蛋白酶肽储存液</td><td></td><td></td><td>各 10 mg/ml 溶于水。分装 20 &amp;mu;l，于 -80 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>缓冲液 X</td><td></td><td></td><td>0.2 M 蔗糖，80 mM KCl，15 mM NaCl，5 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，1 mM EDTA，10 mM HEPES，用 HCl 调节 pH 至 7.5</td></tr><tr><td>放线菌酮储存液</td><td></td><td></td><td>10 mg/ml 溶于水。分装 1 ml，于 -20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>细胞松弛素 B 储存液</td><td></td><td></td><td>5 mg/ml 溶于 DMSO。分装 20 &amp;mu;l，于 -20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>二硫苏糖醇（DTT）储存液</td><td></td><td></td><td>1 M 溶于水。分装 1 ml，于 -20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>ELB</td><td></td><td></td><td>0.25 M 蔗糖，1 mM DTT，50 &amp;mu;g/ml 放线菌酮，2.5 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;，50 mM KCl，10 mM HEPES，pH 7.7</td></tr><tr><td>诺考达唑储存液</td><td></td><td></td><td>10 mg/ml 溶于 DMSO。分装 5 &amp;mu;l，于 -80 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>能量混合液</td><td></td><td></td><td>375 mM 磷酸肌酸，50 mM ATP，25 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;。分装后于 -80 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>细胞核染色液</td><td></td><td></td><td>0.4 &amp;mu;g/ml H&amp;#8211;chst 33258，25% 甘油（v/v），溶于 1x PBS</td></tr><tr><td>梭链孢酸储存液</td><td></td><td></td><td>100 &amp;mu;M 溶于 DMSO。分装 10 &amp;mu;l，于 -80 &amp;deg;C 保存。</td></tr></tbody></table>

使用xenopus卵提取物研究dna损伤检查点

Study of the DNA Damage Checkpoint using Xenopus Egg Extracts

每天，细胞都会受到多种内源性和环境因素的损伤。为应对这些损伤，细胞在进化过程中形成了DNA损伤检查点信号通路，作为一种监控机制，用于识别DNA损伤并引导细胞对DNA损伤作出响应。在DNA损伤检查点信号通路中，包含几类蛋白质，分别称为感应蛋白（sensors）、转导蛋白（transducers）和效应蛋白（effectors）（图1）。在这一复杂的信号通路中，ATR（ATM和Rad3相关蛋白）是能够响应DNA损伤和复制应激的主要激酶之一。活化的ATR可磷酸化其下游底物，例如Chk1（检查点激酶1）。随后，被磷酸化并激活的Chk1会引发DNA损伤检查点的多种下游效应，包括细胞周期阻滞、转录激活、DNA损伤修复以及细胞凋亡或细胞衰老（图1）。当DNA受损时，若未能激活DNA损伤检查点，将导致损伤无法修复，进而引起基因组不稳定。对DNA损伤检查点的研究将有助于阐明细胞如何维持基因组完整性，并加深我们对癌症等人类疾病发生机制的理解。
Xenopus laevis 卵提取物正成为DNA损伤检查点研究中一种强大的无细胞提取模型系统。低速提取物（LSE）最初由Masui研究组描述1。将去膜精子染色质加入LSE后，可形成细胞核，其中DNA在每个细胞周期中以半保留方式复制一次。
由DNA损伤或复制应激可激活ATR/Chk1介导的检查点信号通路2。目前有两种方法用于诱导DNA损伤检查点：DNA损伤诱导法和模拟DNA损伤结构法3。DNA损伤可通过紫外线（UV）照射、γ射线照射、甲基磺酸甲酯（MMS）、丝裂霉素C（MMC）、4-硝基喹啉-1-氧化物（4-NQO）或阿非迪霉素（aphidicolin）来诱导3,4。MMS是一种烷化剂，可抑制DNA复制并激活ATR/Chk1介导的DNA损伤检查点4-7。紫外线照射同样可触发依赖ATR/Chk1的DNA损伤检查点8。模拟DNA损伤结构AT70是由两条寡核苷酸poly-(dA)70和poly-(dT)70退火形成的复合物。AT70系统由Bill Dunphy实验室开发，现已被广泛用于诱导ATR/Chk1检查点信号通路9-12。
本文描述了以下实验方案：（1）制备无细胞卵提取物（LSE）；（2）使用两种不同的DNA损伤方法（MMS和UV）处理Xenopus精子染色质；（3）制备模拟DNA损伤结构的AT70；以及（4）利用受损的精子染色质或模拟DNA损伤的结构在LSE中激活ATR/Chk1介导的DNA损伤检查点。

Xenopus 卵提取物是研究DNA损伤检查点的一个有用模型系统。本方案介绍了Xenopus 卵提取物及DNA损伤检查点诱导试剂的制备方法。这些技术可适用于多种DNA损伤方法，用于研究DNA损伤检查点信号通路。

使用Xenopus卵提取物研究DNA损伤检查点

每天，细胞都会遭受各种内源性和环境因素的损伤。为应对这些损伤，细胞进化出了DNA损伤修复机制……

本实验的总体目标是利用非洲爪蟾卵提取物作为模型系统，研究DNA损伤检查点。首先，从非洲爪蟾卵中制备低速提取物。然后，采用甲基磺酸甲酯（MMS）和紫外光（UV）等DNA损伤方法处理精子染色质，以制备受损的精子染色质。同时制备模拟DNA损伤的结构。使用T70或受损的精子染色质处理LSE，以激活DNA损伤检查点。最终，印迹实验结果可揭示非洲爪蟾卵提取物中由ATR介导的DNA损伤检查点的激活情况。大家好。我是来自北卡罗来纳大学夏洛特分校生物系的CH Y。今天我们将向您展示如何利用脓液提取物作为模型系统来研究损伤触发的信号通路。该方法有助于解答动态不稳定性研究领域中的关键问题，例如D损伤检查点是如何被激活的。本方案适用于制备卵母细胞提取物和DNA损伤检查点诱导试剂，并用于分析DNA损伤检查点和xap。这些技术可适用于多种DNA损伤方法，包括四氮醌（NQO）和依托泊苷。为了研究DNA损伤检查点，让我们开始实验。通过向非洲爪蟾雌蛙的背侧淋巴囊皮下注射100单位的PMSG，对其进行促排卵预处理。在预处理至少两天后，通过向每只已预处理的青蛙背侧淋巴囊皮下注射500单位的人绒毛膜促性腺激素（hCG）以诱导产卵。将注射后的青蛙分别置于装有两升Marx改良林格溶液的桶中，于14至20小时内孵育。将青蛙从桶中取出，倒掉MMR溶液，直至剩余约100毫升。然后将卵从桶中转移至250毫升烧杯中，通过每隔约30秒加入100毫升pH 7.8的2%半胱氨酸溶液进行去胶处理。使用直径为0.7厘米的倒置玻璃巴氏吸管轻轻搅动卵，倾去并更换新鲜的半胱氨酸溶液两次。脱膜过程大约需要5到15分钟。当卵子在烧杯底部形成更为致密的一层后，弃去半胱氨酸溶液，用0.25 XMMR溶液将卵子洗涤三次。用玻璃移液管轻轻搅动卵子，并检查位于烧杯中央的膨胀发白的坏卵。用移液管去除坏卵。接着，用卵裂解缓冲液洗涤卵三次。去除任何额外的坏卵，然后将卵倒入一个14毫升的离心管中。将卵通过离心在188 × g下压缩55秒。使用带有摆动桶转子的临床台式离心机，除去卵层上方多余的缓冲液。现在，每1毫升压缩后的卵中加入0.5 µL浓度为10 mg/mL的抑肽酶、瘦素或AL，以及0.5 µL浓度为5 mg/mL的细胞因子B或cyto B，在4°C下以16,500 × g离心15分钟。使用Sarva RC 6 Plus超速离心机配备HB 6摆动桶转子，离心后卵在离心管中分为三层，从上至下分别为脂质提取物和卵黄色素。用21号针头在Falcon管中层提取物下部侧面穿刺。小心移除针头，因为穿刺针可能会被塑料堵塞。将连接在一毫升注射器上的新21号针头插入穿刺部位，以收集提取物。缓慢吸取提取物，避免产生气泡，并防止与脂质层和卵黄色素层发生污染。将提取物转移至预冷的1.5毫升微量离心管中。每1毫升卵黄提取物中加入10微升10毫克/毫升的试剂。环己酰亚胺：1 微升，10 毫克/毫升；蛋白酶抑制剂亮肽素：1 微升，5 毫克/毫升；细胞因子 B：1 微升，1 摩尔 DTT；以及 0.33 微升，10 毫克/毫升的油酸。通过轻轻倒置卵提取物至少 10 次进行混合。但低速提取物必须在四小时内使用，因为 LSE 的质量会随之下降。四小时后或自然解冻后，将两种合成寡核苷酸溶解于水中，浓度为每微升2微克。取每种寡核苷酸各100微升加入一个1.5毫升微量离心管中，在95摄氏度的加热块中孵育5分钟。取出含有寡核苷酸混合物的离心管，让其冷却至室温，分装成每份10微升，于零下20摄氏度保存。AL 样品现为最终浓度为每微升 2 微克的 A T 70 双链。按照 Tudor 和 Walter 的方法制备正常精子染色质，得到 0.5 毫升染色质。加入 5.5 微升 9.1 摩尔的 MMS。使用IE CCL两用临床离心机，配旋转摇摆桶转子和试管适配器，将样品管置于室温下旋转混匀30分钟。在室温下以686 ×g离心10分钟。弃去上清液，用0.5 mL含有BSA、DTT、Aproin和瘦素的缓冲液X重悬沉淀。重复此步骤三次，并将沉淀重悬于 0.5 毫升缓冲液 x 中。使用血细胞计数板测定精子染色质的浓度。然后将样品稀释至每微升100,000个精子，并将5微升分装样品于-80摄氏度保存。取适量正常精子染色质加至一片param表面，将样品放入紫外交联仪中。设定所需的能量参数，通过紫外光照射损伤精子染色质。立即使用经紫外线处理的精子染色质，以在制备好的低速提取物中诱导DNA损伤检查点。将50微升LSE、1微升能量混合物和2微升受损的精子染色质混合。将反应体系在B室温下孵育90分钟，确保自孵育开始至少30分钟后，每隔10分钟轻轻振荡试管一次。孵育后，取一微升反应混合物滴加到显微镜载玻片上，并加入一微升细胞核裂解液。盖上盖玻片，通过荧光显微镜观察细胞核的形成情况。通常在孵育30分钟后会形成圆形细胞核，表明DNA复制已启动。同时，使用抗 Check One 抗体通过免疫印迹法检测 10 µL 反应混合物。在微量离心管中加入 50 µL LSE、1 µL 能量混合物和 1.6 µL Toto Mycin 储存液。然后，加入 1.25 µL 浓度为 2 µg/µL 的 T70 DNA 双链体，或在阴性对照中加入等体积的水。将反应物在室温下孵育90分钟，每隔10分钟轻弹反应管。随后，取10微升反应混合物加入90微升上样缓冲液中，用于Western blot检测目标蛋白。与对照组MMS诱导相比，受损的精子染色质或模拟DNA损伤的结构在xop卵提取物系统中能更有效地激活TR check one介导的DNA损伤检查点。检测叙利亚蛋白344位丝氨酸的磷酸化，这是TR激酶活化的标志。类似地，T70作为一种模拟DNA损伤的结构，也能触发检查点1的磷酸化。一旦掌握LSE制备技术，可在大约一小时内完成。由于提取物的质量在大约四小时后会下降，因此速度和效率至关重要。这些方法可与其他方法联用，以解答有关DNA损伤检查点信号传导的关键问题。例如，可通过免疫耗竭实验来检测目标蛋白是否在DNA损伤检查点中发挥作用。观看本视频后，您应该能够充分理解如何利用爪蟾卵提取物作为模型系统来研究DNA损伤检查点。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。

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研究DNA损伤检验点<em&gt;爪蟾</em&gt;卵提取物

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我们提出了一种用于生成 体外 通过包封卵母细胞提取物在单细胞水平实现自我维持的有丝分裂振荡 非洲爪蟾...

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通过免疫荧光技术观察DNA修复蛋白的相互作用

我们描述了一种制备和实时成像非洲爪蟾（Xenopus...

Xenopus laevis 卵提取物制备及活体成像方法用于可视化动态胞质结构

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利用活体成像技术观察氧化损伤对果蝇卵室的影响

本文介绍了免疫染色和染色质免疫沉淀的关键步骤。这些实验方案常用于研究与DNA损伤相关的细胞过程，并用于可视化及定量分析参与DNA修复的蛋白质的募集情况。...

可视化与定量内切酶介导的位点特异性DNA损伤

维持卵母细胞基因组的完整性对于确保胚胎遗传信息的准确性至关重要。本文介绍了一种用于检测哺乳动物雌性生殖细胞中DNA双链断裂的精确方案。...

小鼠卵母细胞中DNA双链断裂的检测

学习利用非洲爪蟾卵提取物研究DNA损伤检验点机制。本方法通过制备低速提取物和诱导DNA损伤，帮助研究人员深入理解细胞周期调控与基因组稳定性维护的关键过程。

使用Xenopus卵提取物研究DNA损伤检查点

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