使用Xenopus卵提取物研究DNA损伤检查点

本实验的总体目标是利用非洲爪蟾卵提取物作为模型系统，研究DNA损伤检查点。首先，从非洲爪蟾卵中制备低速提取物。然后，采用甲基磺酸甲酯（MMS）和紫外光（UV）等DNA损伤方法处理精子染色质，以制备受损的精子染色质。

同时制备模拟DNA损伤的结构。使用T70或受损的精子染色质处理LSE，以激活DNA损伤检查点。最终，印迹实验结果可揭示非洲爪蟾卵提取物中由ATR介导的DNA损伤检查点的激活情况。

大家好。我是来自北卡罗来纳大学夏洛特分校生物系的CH Y。今天我们将向您展示如何利用脓液提取物作为模型系统来研究损伤触发的信号通路。

该方法有助于解答动态不稳定性研究领域中的关键问题，例如D损伤检查点是如何被激活的。本方案适用于制备卵母细胞提取物和DNA损伤检查点诱导试剂，并用于分析DNA损伤检查点和xap。这些技术可适用于多种DNA损伤方法，包括四氮醌（NQO）和依托泊苷。

为了研究DNA损伤检查点，让我们开始实验。通过向非洲爪蟾雌蛙的背侧淋巴囊皮下注射100单位的PMSG，对其进行促排卵预处理。在预处理至少两天后，通过向每只已预处理的青蛙背侧淋巴囊皮下注射500单位的人绒毛膜促性腺激素（hCG）以诱导产卵。将注射后的青蛙分别置于装有两升Marx改良林格溶液的桶中，于14至20小时内孵育。

将青蛙从桶中取出，倒掉MMR溶液，直至剩余约100毫升。然后将卵从桶中转移至250毫升烧杯中，通过每隔约30秒加入100毫升pH 7.8的2%半胱氨酸溶液进行去胶处理。使用直径为0.7厘米的倒置玻璃巴氏吸管轻轻搅动卵，倾去并更换新鲜的半胱氨酸溶液两次。

脱膜过程大约需要5到15分钟。当卵子在烧杯底部形成更为致密的一层后，弃去半胱氨酸溶液，用0.25 XMMR溶液将卵子洗涤三次。用玻璃移液管轻轻搅动卵子，并检查位于烧杯中央的膨胀发白的坏卵。

用移液管去除坏卵。接着，用卵裂解缓冲液洗涤卵三次。去除任何额外的坏卵，然后将卵倒入一个14毫升的离心管中。

将卵通过离心在188 × g下压缩55秒。使用带有摆动桶转子的临床台式离心机，除去卵层上方多余的缓冲液。现在，每1毫升压缩后的卵中加入0.5 µL浓度为10 mg/mL的抑肽酶、瘦素或AL，以及0.5 µL浓度为5 mg/mL的细胞因子B或cyto B，在4°C下以16,500 × g离心15分钟。使用Sarva RC 6 Plus超速离心机配备HB 6摆动桶转子，离心后卵在离心管中分为三层，从上至下分别为脂质提取物和卵黄色素。用21号针头在Falcon管中层提取物下部侧面穿刺。

小心移除针头，因为穿刺针可能会被塑料堵塞。将连接在一毫升注射器上的新21号针头插入穿刺部位，以收集提取物。

缓慢吸取提取物，避免产生气泡，并防止与脂质层和卵黄色素层发生污染。将提取物转移至预冷的1.5毫升微量离心管中。每1毫升卵黄提取物中加入10微升10毫克/毫升的试剂。

环己酰亚胺：1 微升，10 毫克/毫升；蛋白酶抑制剂亮肽素：1 微升，5 毫克/毫升；细胞因子 B：1 微升，1 摩尔 DTT；以及 0.33 微升，10 毫克/毫升的油酸。通过轻轻倒置卵提取物至少 10 次进行混合。但低速提取物必须在四小时内使用，因为 LSE 的质量会随之下降。

四小时后或自然解冻后，将两种合成寡核苷酸溶解于水中，浓度为每微升2微克。取每种寡核苷酸各100微升加入一个1.5毫升微量离心管中，在95摄氏度的加热块中孵育5分钟。取出含有寡核苷酸混合物的离心管，让其冷却至室温，分装成每份10微升，于零下20摄氏度保存。

AL 样品现为最终浓度为每微升 2 微克的 A T 70 双链。按照 Tudor 和 Walter 的方法制备正常精子染色质，得到 0.5 毫升染色质。加入 5.5 微升 9.1 摩尔的 MMS。

使用IE CCL两用临床离心机，配旋转摇摆桶转子和试管适配器，将样品管置于室温下旋转混匀30分钟。在室温下以686 ×g离心10分钟。弃去上清液，用0.5 mL含有BSA、DTT、Aproin和瘦素的缓冲液X重悬沉淀。

重复此步骤三次，并将沉淀重悬于 0.5 毫升缓冲液 x 中。使用血细胞计数板测定精子染色质的浓度。

然后将样品稀释至每微升100,000个精子，并将5微升分装样品于-80摄氏度保存。取适量正常精子染色质加至一片param表面，将样品放入紫外交联仪中。设定所需的能量参数，通过紫外光照射损伤精子染色质。

立即使用经紫外线处理的精子染色质，以在制备好的低速提取物中诱导DNA损伤检查点。将50微升LSE、1微升能量混合物和2微升受损的精子染色质混合。将反应体系在B室温下孵育90分钟，确保自孵育开始至少30分钟后，每隔10分钟轻轻振荡试管一次。

孵育后，取一微升反应混合物滴加到显微镜载玻片上，并加入一微升细胞核裂解液。盖上盖玻片，通过荧光显微镜观察细胞核的形成情况。通常在孵育30分钟后会形成圆形细胞核，表明DNA复制已启动。

同时，使用抗 Check One 抗体通过免疫印迹法检测 10 µL 反应混合物。在微量离心管中加入 50 µL LSE、1 µL 能量混合物和 1.6 µL Toto Mycin 储存液。然后，加入 1.25 µL 浓度为 2 µg/µL 的 T70 DNA 双链体，或在阴性对照中加入等体积的水。

将反应物在室温下孵育90分钟，每隔10分钟轻弹反应管。随后，取10微升反应混合物加入90微升上样缓冲液中，用于Western blot检测目标蛋白。与对照组MMS诱导相比，受损的精子染色质或模拟DNA损伤的结构在xop卵提取物系统中能更有效地激活TR check one介导的DNA损伤检查点。

检测叙利亚蛋白344位丝氨酸的磷酸化，这是TR激酶活化的标志。类似地，T70作为一种模拟DNA损伤的结构，也能触发检查点1的磷酸化。一旦掌握LSE制备技术，可在大约一小时内完成。

由于提取物的质量在大约四小时后会下降，因此速度和效率至关重要。这些方法可与其他方法联用，以解答有关DNA损伤检查点信号传导的关键问题。例如，可通过免疫耗竭实验来检测目标蛋白是否在DNA损伤检查点中发挥作用。

观看本视频后，您应该能够充分理解如何利用爪蟾卵提取物作为模型系统来研究DNA损伤检查点。感谢您的观看，祝您的实验顺利成功。