海马区胰岛素微量注射及 在体内的 空间记忆测试期间的微透析技术

本实验的总体目标是在行为学测试期间测量海马体的代谢活动。为此，需通过手术为经过良好处理的动物植入微透析引导套管。在测试当天，将微透析探针插入套管中，并确认PERFUSE eight系统的灌流正常。

接下来，让探针在动物处于对照室时进行平衡。最终，采用适当的分析方法，例如葡萄糖氧化酶、NADP、NADPH反应及荧光分析法。若通过测定葡萄糖水平来反映整个测试期间的代谢水平或神经化学物质释放情况，则该技术最具挑战性的方面之一是在操作微透析管时所需的高度谨慎，若操作不当，动物常会啃咬或缠绕导管线路。

因此，我第一次在行为测试中使用海马区微透析技术是在攻读研究生期间，当时我们想验证现有的葡萄糖供应模型是否与已知的葡萄糖增强记忆的心理学数据相符。这一方法使我们得以证明，实际上，应用于大脑的现有葡萄糖模型完全错误。

按照标准外科手术流程，准备动物，暴露颅骨，并钻孔以放置套管。在预定坐标处插入套管，然后缓慢将其降至目标深度。确认位置正确后，用牙科水泥固定套管。

必要时使用无菌外科缝线闭合伤口。最后，使用套管维持装置以保持套管通畅。接下来，准备用于微透析的 PERFUSE 八通道灌注系统。

需要注意的是，精确的液体成分对于获得最佳结果至关重要。在测试当天，应加入牛血清白蛋白 BSA 并充分溶解。制备完成后，PERFUSE eight 应通过 0.2 微米滤器过滤。

接下来，如有需要，使用已配制的 A ECF 部分样品制备将要给予脑部的处理试剂。此处准备将胰岛素递送至海马体。应在测试前一天准备好新的微透析探针和管路。

分别建立进液管路和出液管路。使用 PE 50 管路连接两段一米长的 FEP 管路，并确保管路之间的死体积最小。应按图示修剪管路，使其末端呈斜面，以便于插入 PE 50 连接头。

将进液管连接至装有经无菌过滤的去离子水的1毫升Hamilton注射器，并将探头连接至另一端，以便在测量时允许动物自由活动。将进液管和出液管连接至双通道旋转连接器。接着，将出液管连接至泵，并以1.5 µL/min的流速运行，直至观察到去离子水从探头的出液管端流出。

关闭泵，将另一根管路连接在流出管与样品收集管之间。使五毫升液体流经管路，然后将探针放入含有无菌去离子水的小瓶中过夜，确保探针尖端始终处于湿润状态。测试前24小时，通过移除假性导丝并插入仅用于此目的的微透析探针，对受试对象进行预处理。

此后10分钟内，更换假的探针并把大鼠放回笼中。或者，在此阶段使用新的探针，并保持其位置不变，直到进行测量。第二天。

在进行微透析的当天，用过滤后的 A ECF 填充 Hamilton 注射器和闪烁瓶，并让泵平衡一小时。如有需要，用准备好的处理液填充第二支 Hamilton 注射器，并将其放入注射泵中。该操作成功的关键在于保持冷静，并对动物进行充分而细致的操作。

因此，请保持冷静，动作缓慢而精准，最重要的是多加练习。当平衡完成后，取出假性导丝，通过套管将已平衡的微透析探针轻轻插入大鼠脑内。将大鼠放入一个透明的塑料箱中，箱内放置一些该大鼠笼舍中的垫料。

务必平衡好管路。将一个装有水的1.6毫升微量离心管连接到笼外的管路上，调整位置使重力作用保持微透析管路无扭曲但不过于紧绷。让探针和大鼠平衡适应两小时。

在此阶段开始时，确认 Perfuse eight 的流路畅通无阻。为此，需在确定的时间段内收集 PERFUSE eight 的流出液并称重，以确认系统流出的体积符合预期，然后再进行样品收集。确保准确计算样品透析与收集之间的对应关系。

此处探针与收集点之间的灌流体积为 30 µL，流速为 1.5 µL/min。样品从脑部流出至被收集之间存在 20 分钟的延迟。在平衡期结束后，当大鼠处于饲养笼内静息状态时，至少收集三个样品。

在行为学测试之前，为了建立稳定的测量基线，需仔细规划向脑内给药的时间。在此实验设置中，注射器尖端与进入动物脑内的探针之间有 30 µL 的容积，因此我们会在目标治疗物质到达海马体前 20 分钟，更换为灌注第八种治疗溶液的注射器。以完成注射器的更换。

只需将灌注管路从对照 PERFUSE EIGHT 注射器上断开，并迅速连接至处理用 PERFUSE EIGHT 注射器。整个操作应不超过五秒，以避免中断 PERFUSE EIGHT 的灌注流。注意避免引入气泡，以免在适当的时间段内降低灌注效率。

给药结束后，轻柔地将大鼠转移至选定的行为学测试装置中。此处，采用前臂加号形迷宫测量自发交替行为。让动物在迷宫中自由探索 20 分钟。

使用录像或手动记录 Aries 臂的动作顺序和时间，以收集样本。在此期间，将流出管移至新的收集管。每五分钟握住管路一次，使其自由移动。

它不应妨碍大鼠的移动，也不应移动到动物前方或分散其注意力，应保持静止，以免你的动作影响大鼠的行为。测试结束后，轻柔地将大鼠从迷宫中取出，并放回对照室。继续进行至少四次微透析样本采集，以覆盖任务执行后的恢复期。

在采集完所需样本后，轻柔地将探头从动物头部取出，并放入储存管中。将动物放回其饲养笼内，并密切观察其健康状况或行为是否出现任何实验后的变化。最后，更换为含有氯化胆碱溶液的注射器，冲洗管路，以防止微生物生长。

该示例显示了与任务相关的海马区细胞外液葡萄糖水平下降。灰色区域表示动物在迷宫中停留的时间。紫色线条显示未进行迷宫测试动物的海马区葡萄糖水平，而红色线条表示执行前肢自发交替任务动物的海马区葡萄糖水平。

橙色线条显示了动物执行较简单的三臂版本任务时的测量结果。此处展示了注射胰岛素后海马体中葡萄糖和乳酸的变化。需要注意的是，这些变化是在未进行任何行为测试的情况下观察到的，因此反映了在基线条件下仅由胰岛素引起的影响。

进行该操作时，保持冷静至关重要。大鼠能够感知实验者的压力，从而变得焦躁，这不仅会使操作更加困难，还可能干扰实验结果。这种技术组合使得对行为过程的神经化学研究更加准确。

目前，类似的技术也已应用于人类患者。例如，癫痫患者在植入电极以定位癫痫发作病灶的同时，也可能植入微透析套管，以便进行代谢物的测量。