Name: 连续光漂白划定单雪旺细胞在神经肌肉接头处 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: 了解利用连续光漂白技术在神经肌肉接头处可视化单个雪旺细胞的方法。本研究使用表达GFP的转基因小鼠，结合共聚焦显微镜和免疫组织化学技术，揭示单细胞形态及其在神经再生中的分布特征。

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我们感谢 Manuela Budak、Ljiljana Marinković 和 Kristina Wullimann 提供出色的技术支持。感谢 W. Macklin 提供 Plp-GFP 小鼠。T.M. 的研究得到高等研究院（慕尼黑工业大学）、德国研究基金会（DFG；特别研究领域 SFB 596）、亚历山大·冯·洪堡基金会以及德国联邦教育与研究部在 ERA-Net NEURON 项目“iPSoALS”和“2-photon imaging”框架内的资助。T.M. 和 M.B. 得到慕尼黑整合蛋白质科学中心的支持。P.M. 得到慕尼黑工业大学研究生院（TUM-GS）的资助。

1. 胸骨三角肌外植体（图1）
时间：15 分钟。
<ol>
 <li>准备手术器械：两把镊子、一把剪刀、一把弹簧剪、一个组织培养皿（10 cm）。预先通气（至少15分钟）并冷却至4 °C的含5% CO的林格氏液2/ 95% O₂2将15 cm组织培养皿装满冰，并用金属板覆盖。准备好解剖显微镜，将装有冰的15 cm培养皿置于解剖显微镜下，以便在解剖过程中冷却组织块。</li>
 <li>用过量异氟烷（或任何其他批准的处死方法）对小鼠实施致死性麻醉。用70%乙醇喷洒小鼠体表，以防止毛发污染外植体。对于SC漂白，我们使用了 Plp-GFP 小鼠，可与 Thy1-OFP3 或 Thy1-Membow13 用于轴突的同步可视化。</li>
 <li>使用大剪刀，在胸骨上方的皮肤做一正中切口，并在肋缘下侧做两条与之平行的切口。</li>
 <li>使用大剪刀剪除皮肤，切开腹壁，并沿肋骨平行方向一直切至脊柱。随后，在胸骨附近靠近胸肌止点处进行切割，剥离胸肌。</li>
 <li>在剑突软骨下方切开膈肌，并沿其肋部附着处分离膈肌。 </li>
 <li>用镊子夹住剑突部位固定胸廓，从肋骨与脊柱连接处尽可能靠近其附着点开始剪断肋骨。左右两侧的剪切线应在心脏上方朝向胸骨柄会合。注意避免剪到主要血管（尤其是锁骨下静脉）。用镊子夹住剑突并轻轻提起标本，可获得更好的视野。</li>
 <li>在胸骨柄下方稍作横向切口，将移植组织转移至含有冷却的5% CO的10 cm培养皿中2/ 95% O₂2-通入气体的任氏液。将10厘米培养皿置于覆盖在盛有冰的15厘米组织培养皿上的金属板上。所有后续步骤均应在解剖显微镜下进行。</li>
 <li>使用小型弹簧剪去除胸腺残余、胸膜、膈肌（内部）以及胸大肌（外部）； 图1B-D).</li>
 <li>为了将外植体适配至3.5 cm培养皿，需切除所有不与胸骨相连的肋骨。建议使用小型弹簧剪刀，从肋骨之间的组织处进行剪切。图1E).</li>
 <li>用微型钉针（缩短至适当长度）将胸骨三角肌神经-肌肉外植体固定在涂有Sylgard的3.5 cm组织培养皿中 &lt; 4 mm 图1G）。应将两枚针插入胸骨的软骨（白色）部分。在离体组织左右两侧的肋骨上各插入至少两枚针，针应穿过较柔软的软骨部分，并避开三角肌下方或附近的肋骨。使用的针数越多越好（通常使用8-10枚）。固定标本时，应确保肋骨适度展开，使肌肉处于轻微拉伸的状态。</li>
 <li>可选： 通过加入与Alexa染料偶联的α-银环蛇毒素（浓度为0.8 μg/ml，溶于5% CO₂）来可视化含有乙酰胆碱受体的突触位点2/ 95% O₂2-通入气体的任氏液）。将固定好的外植块置于涂有Sylgard的培养皿中，在室温下孵育15–20分钟，随后用5% CO反复洗涤数次2/ 95% O₂2通入气泡的任氏液。</li>
</ol>
2. 漂白 SCs 及可选的时间序列显微镜观察（图 2）
时间：30 - 45 分钟，另可选 1 - 5 小时用于延时成像。
<ol>
 <li>将3.5 cm涂有Sylgard的培养皿转移至配备氩离子激光器（488 nm波长）和水浸物镜（4x，0.13 NA；20x，0.5 NA 和 100x，1.0 NA 或 60x，0.9 NA）的共聚焦显微镜上。</li>
 <li>时间序列显微成像可选步骤：将3.5 cm涂有Sylgard的培养皿插入加热环中，安装灌流系统和温度探针（图2A）。确保这些装置均不接触组织块、培养皿边缘或Sylgard涂层。将样品加热至33–35 °C。若仅进行光漂白而不进行时间序列成像，则室温更佳，因为细胞在漂白步骤之间动态性较低。</li>
 <li>使用4x空气物镜观察胸骨三角肌的神经支配模式，并定位胸骨三角肌终板带。切换至20x浸水锥形物镜，开始在终板带内寻找表浅区域（覆盖肋骨的区域是较理想的选择）。更换为100x或60x浸水锥形物镜以检查单个神经肌肉接头（NMJ）。理想情况是选择一个被多个施万细胞（SC）覆盖且位置非常表浅的NMJ（图2B）。若在漂白后进行时间序列成像，应选择最多3个彼此相对靠近的NMJ，以提高实验成功率。</li>
 <li>在对单个SC进行光漂白前，获取该NMJ的共聚焦图像（图2B）。（对于全分辨率成像，例如在Olympus FV1000显微镜上，使用100x、1.0 NA物镜并设置2.5倍放大，可实现约每像素0.1 μm的奈奎斯特极限采样。）</li>
 <li>使用最大功率将488 nm激光束中心对准SC细胞核，持续照射5秒（也可选用高效的扫描模式作用于小兴趣区域，例如Olympus显微镜上的“tornado scan”功能；由于使用的是共聚焦显微镜，激光聚焦于图像共轭平面，因此在488 nm波长下配合1.0 NA物镜，聚焦光斑直径&lt; 0.5 μm）。重新对焦细胞并评估漂白效果。如有必要，重复漂白步骤，直至GFP信号降至接近背景水平。漂白后获取图像（图2C）。关键是要确保漂白区域不位于两个细胞的重叠区域内——若存在重叠，第二个细胞的漂白将显而易见。</li>
 <li>重复上述步骤，直至除一个SC外其余所有SC均被漂白（图2D–E）。最后一个“未漂白”的SC适用于共聚焦时间序列显微成像。通过图像相减法重建单个细胞，例如使用Photoshop软件，以界定单个SC的形态及其占据区域（图2F）。需注意，两张图像相减会引入噪声（例如将图像依次导入Photoshop中的连续“图层”，然后将顶层通道在通道选项卡顶部的下拉菜单中设置为“difference”）。可通过在相减前对各通道使用“despeckle”功能，并裁剪掉明显不属于漂白细胞来源的背景区域来避免此问题。为优化对比度，可能需要在“levels”窗口中调节两个通道的亮度。将所得漂白细胞图像叠加至原始突触图像上，采用独特色调伪彩着色，并设为透明，以在原始图像中标注该漂白细胞的占据区域（对所有已漂白及最后一个未漂白细胞执行此操作后，即可得到如图2F所示图像）。</li>
 <li>可选：在除一个SC外其余SC均完成漂白后，开始共聚焦时间序列显微成像。以固定时间间隔（例如每5至10分钟）采集图像。尽可能使用最低激光功率。同一实验过程中最多可同时成像3个NMJ。</li>
 <li>通过在100x物镜下无放大拍摄图像，再使用20x和4x物镜拍摄该区域图像，制作时间序列NMJ的位置图（图2G–I）。该“位置图”用于在固定肌肉组织完成免疫组织化学染色后重新定位NMJ。</li>
 <li>图像处理时，将各单独图像转换为最大强度投影，并保存为tiff格式。将所有z轴投影后的时间点合并为图像序列，并在xy方向上对齐，例如使用Fiji中的“stackreg”插件10（Fiji是基于开源软件ImageJ［美国国立卫生研究院］开发的软件包）。</li>
</ol>
3. 固定与免疫组织化学（图3）
时间：过夜。
<ol>
 <li>将外植体小心取出固定针后转移至含有至少15 ml 4% PFA的50 ml反应管中。将包含胸骨三角肌的前胸壁在冰上后固定1小时。用含0.1 M甘氨酸的PBS冲洗固定组织至少10分钟（以淬灭残留固定剂，从而降低背景信号）。样品可在此阶段保存，并于后续进行处理。</li>
 <li>将固定的外植体转移至一个盛有 0.01 M PBS 的 10 cm Sylgard 包被的组织培养皿中。剪取一个梯形区域，其中一侧与胸骨平行，另一侧穿过骨-软骨交界区——该区域表面包含三角肌。用水平切法去除下部肋骨即 经胸骨切口，以便充分暴露三角肌尾侧末端（图3A-D).</li>
 <li>将皮下注射针头作为销钉插入斜方肌上部（图3E）。使用连接1 ml注射器的皮下注射针和镊子，轻轻夹住该肌肉尾侧一角，用针头作为微型手术刀去除表面的三角肌。确保切口与胸壁平面平行。当肌肉尾部被分离后，通过胸壁在肌肉下方插入另一根皮下注射针作为固定针，以固定标本，并可用镊子对肌肉施加轻柔牵拉力（图3F）。在切断结缔组织附着处时，用镊子将肌肉从胸壁“剥离”。用弹簧剪刀剪断最后一处尾端附着。用镊子清除脂肪和血管残余。注意避免撕裂神经。 注意： 对活体组织和固定组织的操作应使用不同的工具和器皿。</li>
 <li>开始免疫组织化学实验（采用标准方案），将组织样本转移至封闭液中，在室温下于摇床上孵育1小时。使用96孔板进行染色时，最小染色体积为200 μl。</li>
 <li>将一抗用封闭液按比例稀释后加入，每孔200 μl，4 °C摇床孵育过夜。</li>
 <li>用 0.01 M PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。</li>
 <li>在封闭液中稀释适当的二抗，室温孵育1-2小时。</li>
 <li>用0.01 M PBS洗涤3次，每次10分钟。</li>
 <li>用抗荧光淬灭剂封片例如 Vectashield）并加盖盖玻片。</li>
 <li>将载玻片置于磁性金属板上，将磁铁置于样本上方，于4 °C下压平数小时或过夜。用指甲油封片。</li>
</ol>

<ol><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li>
<li>Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolipid+promoter+activity+distinguishes+two+populations+of+NG2-positive+cells+throughout+neonatal+cortical+development%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development.</a> J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).</li>
<li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li>
<li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li>
<li>Thompson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+with+photoswitchable+GFP+in+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells.</a> Society for Neuroscience. Program 241, (2008).</li>
<li>Williams, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+development+of+outer+retinal+synapses+in+the+absence+of+glial+contact%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact.</a> J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).</li>
<li>Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+imaging+of+motor+axon+dynamics+in+murine+triangularis+sterni+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants.</a> Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).</li>
<li>McArdle, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+the+triangularis+sterni+muscle+of+the+mouse+for+investigations+of+synaptic+phenomena%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena.</a> J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).</li>
<li>Marinkovi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+deficits+and+degeneration+can+evolve+independently+in+mouse+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).</li>
<li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).</li>
<li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li>
<li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+expressed+in+mouse+transgenic+lines+mark+subsets+of+glia%2C+neurons%2C+macrophages%2C+and+dendritic+cells+for+vital+examination%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination.</a> J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

此处介绍的SC漂白方法简单、快速且用途广泛：（i）该方法仅需一个转基因即可通过共聚焦显微镜揭示单个SC的形态与动态，这在整合该技术与其他方法时具有显著优势 例如 使用需要额外等位基因的疾病模型。（ii）该方法快速，从解剖到固定可在半天内完成。（iii）应用范围广泛，可与其他方法结合使用，如细胞消融、细胞器成像、电生理学或免疫组织化学。此外，本文所述的小鼠神经肌肉接头施万细胞（SCs）研究方法可推广至其他细胞、组织或物种——参考文献6中展示了相关技术在斑马鱼中的一个应用实例。除GFP外，其他荧光蛋白也可用于漂白和延时显微成像，例如YFP或CFP。尽管我们尚未在施万细胞中使用这些荧光蛋白，但轴突的漂白实验表明，较不稳定的荧光蛋白（例如 在此条件下，使用CFP可能具有优势。然而，需根据预期结果在高效漂白与稳定成像之间找到平衡。例如 单张图像与未漂白细胞的延时成像对比。
该技术存在若干局限性。其一，由于使用了离体（因而轴突被切断）的肌肉，限制了成像时间。在以往的研究中我们发现——根据所研究问题的不同——胸骨三角肌离体标本最多可维持使用3...

<table><tbody><tr><td>70%（体积/体积）乙醇溶液 </td><td>Roth</td><td>T913.1</td><td>在喷雾瓶中</td></tr><tr><td>异氟烷</td><td>Forene, Abbott</td><td></td><td>任何其他经批准的麻醉剂均可用于致死性麻醉</td></tr><tr><td>转基因小鼠&lt;em&gt;Plp&lt;/em&gt;-GFP </td><td></td><td></td><td>从引用来源获取</td></tr><tr><td>配备冷光源照明的解剖显微镜 </td><td>Olympus SZ51</td><td></td><td>配备 Schott KL 1500 LCD</td></tr><tr><td>镊子 #2</td><td>精细科学工具</td><td>11233-20</td><td></td></tr><tr><td>镊子 #5</td><td>精细科学工具</td><td>11295-00</td><td></td></tr><tr><td>大号医用剪刀</td><td>精细科学工具</td><td>14108-09</td><td></td></tr><tr><td>小角度弹簧剪</td><td>精细科学工具</td><td>15033-09</td><td></td></tr><tr><td>inline加热器</td><td>Warner Instruments</td><td>SF-28</td><td></td></tr><tr><td>3.5 厘米培养皿用加热环 </td><td>Warner Instruments</td><td>64-0110 DH-35</td><td></td></tr><tr><td>双通道温度控制系统</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>灌流泵系统 </td><td></td><td></td><td>定制构建</td></tr><tr><td>15 cm 组织培养皿 </td><td>Sarstedt</td><td>83.1803.003</td><td>装满冰并用金属板覆盖</td></tr><tr><td>10 cm 组织培养皿 </td><td>Sarstedt</td><td>83.1802.003</td><td>用充氧的任氏液</td></tr><tr><td>3.5-cm 组织培养皿 </td><td>Sarstedt</td><td>83.1800.003</td><td>填充了Sylgard聚合物</td></tr><tr><td>Sylgard 聚合物</td><td>道康宁</td><td>Sylgard 184 硅胶弹性体试剂盒</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜 </td><td>奥林巴斯</td><td>FV1000</td><td>使用氩离子激光器</td></tr><tr><td>50 ml 反应管</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254 PP</td><td></td></tr><tr><td>PBS 中的 4% PFA</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>cannula 0.5 mm x 25 mm</td><td>Neolab</td><td>E-1510</td><td></td></tr><tr><td>1 ml 注射器</td><td>Neolab</td><td>E-1496</td><td></td></tr><tr><td>突触素抗体</td><td>Invitrogen</td><td>18-0130</td><td>兔</td></tr><tr><td>二抗</td><td>Invitrogen</td><td>A-11012</td><td>Alexa 594</td></tr><tr><td>24孔板</td><td>Sarstedt</td><td>83.1836</td><td></td></tr><tr><td>0.01 M PBS</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>PBS 中的 0.1 M 甘氨酸</td><td>Roth</td><td>3790.1</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Neolab</td><td>E-4132</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Neolab</td><td>E-4121</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector labs</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>微型固定针 &amp;#215;10</td><td>精细科学工具</td><td>26002-20</td><td>缩短为 &amp;小于 4 mm</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-与Alexa 594偶联的竹桃霉素</td><td>Invitrogen（Molecular Probes）</td><td>B-13423</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;封闭液&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>0.01 M PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2% Triton-X100</td><td>Roth</td><td>3051.3</td><td></td></tr><tr><td>10% 正常山羊血清</td><td>Abcam</td><td>ab7481</td><td></td></tr><tr><td> 1% 牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A7030</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;em&gt;任氏液&lt;br/&gt; &lt;/em&gt;用95% O₂饱和&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; /5% CO₂&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td> 125 mM NaCl </td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>2.5 mM KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>1.25 mM NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S8282</td><td></td></tr><tr><td>26 mM NaHCO₃&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>2 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>21114</td><td></td></tr><tr><td>1 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>63020</td><td></td></tr><tr><td>20 mM 葡萄糖</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content&quot;&gt;&lt;strong&gt;表1.&lt;/strong&gt; 特异性试剂与仪器设备。&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

通过连续光漂白法界定神经肌肉接头处单个施万细胞

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

连续光漂白为在神经肌肉接头（NMJ）处标记单个施万细胞（SC）提供了一种非侵入性方法。神经肌肉接头是哺乳动物神经系统中最大的突触，长期以来作为研究突触结构与功能的指导性模型。在小鼠的神经肌肉接头中，运动轴突终末与肌纤维形成类似椒盐卷饼状的接触区域。运动轴突及其终末被施万细胞所包绕。在过去几十年中，已培育出多种转基因小鼠用于可视化运动神经元和施万细胞，例如分别用于标记运动神经元和施万细胞的Thy1-XFP1小鼠和Plp-GFP小鼠2。
在运动轴突上，形成髓鞘的施万细胞沿轴突呈非重叠的节段性排列，各节段之间由兰氏结分隔，以实现动作电位的跳跃式传导。相比之下，位于突触处的终末施万细胞则是一类特化的胶质细胞，能够监测并促进神经递质传递，清除细胞碎片，并引导再生轴突的生长。神经肌肉接头（NMJs）通常由多达六个非髓鞘化的终末施万细胞紧密覆盖——然而，由于这些细胞彼此之间膜结构直接接触，无法通过光学显微镜单独分辨3。
目前存在多种方法可用于单独观察终末端的施万细胞（SCs），但这些方法均存在缺陷。例如，染料填充法需要使用充满染料的微电极穿刺单个细胞，但在填充第二个细胞前必须破坏已标记的细胞，因此无法与后续的时间推移成像相兼容3。通过组合表达荧光蛋白，已实现施万细胞的多光谱“Brainbow”标记4。然而，该技术需联合使用多个转基因，并受限于所用启动子的表达模式。未来，在施万细胞中表达“光可切换”蛋白可能是另一种替代方案5。本文介绍了一种连续光漂白方法，即通过对单个细胞进行光漂白，并通过图像相减获得其轮廓图像。我们认为，该方法因其简便性和通用性，将成为神经科学研究技术工具中一项持久的补充，尤其适用于活体（in vivo）研究，并可推广至其他细胞类型、解剖部位或物种6。
在以下实验方案中，我们详细描述了在胸骨三角肌肌片标本的终末施万细胞（SCs）中应用连续漂白及随后的共聚焦时间序列显微镜成像的方法。这种薄而表浅、易于分离的神经-肌肉制备物7,8已被证明在神经肌肉接头（NMJ）的发育、生理学及病理学研究中具有重要价值9。最后，我们说明了胸骨三角肌在固定后如何制备，以进行关联性的高分辨率共聚焦成像、免疫组织化学或超微结构分析。

用于成像的胸骨三角肌组织外植体示例见图1G。该外植体特别适用于在体外（ex vivo）对神经肌肉接头（NMJs）进行成像，因为胸骨三角肌仅由少数几层肌纤维构成。这使得可以从转基因小鼠品系（标记施万细胞（SCs）的Plp-GFP2和/或标记轴突的Thy1-XFP1）获取的外植体中获得高分辨率图像。高质量成像的关键因素包括：（i）在制备外植体过程中避免接触胸骨三角肌，以防肌纤维损伤；（ii）选择表浅且平坦的突触，以减少与深度相关的像差；（iii）避免样品过热（> 37 °C），并保持样品充分供氧；（iv）成像过程中可考虑暂停灌流，以减少漂移或振动；（v）小心放置灌流管和温度探针，避免接触样品，同时保持培养皿底部干燥，以防止漂移；（vi）在充分漂白与避免非靶向施万细胞的“附带”信号丢失之间取得平衡，以最大化对比度。若外植体受损或状态不佳，常可观察到肌肉抽搐和轴突断裂现象。制备不稳定会导致共聚焦图像堆栈的投影模糊。然而，一旦上述顺序性光漂白技术成功实施，即可清晰揭示单个终末施万细胞的形态细节（图2F...

在致密组织中观察单个细胞（例如神经肌肉接头（NMJs）处的终末施万细胞（SCs））具有挑战性。“连续光漂白”技术可用于清晰界定单个终末施万细胞，例如在胸骨三角肌离体组织中，这是一种便捷的神经-肌肉制备模型，可在其中将连续漂白与延时成像以及事后免疫染色相结合。

连续光漂白为在神经肌肉接头（NMJ）处标记单个施万细胞（SCs）提供了一种非侵入性方法。NMJ 是哺乳动物神经系统中最大的突触。

以下实验的总体目标是利用共聚焦显微镜描绘神经肌肉接头处的单个施万细胞。本方案使用在终末和轴突施万细胞中表达GFP的转基因小鼠。第一步是解剖出神经肌肉标本。随后对特定神经肌肉接头处除一个施万细胞外的所有细胞进行连续漂白，以揭示单个细胞的形态。最后，生成低倍率图像图谱。组织经固定后用于免疫组织化学染色，以显示任何所需标记物与剩余未漂白施万细胞之间的空间关系。结果显示单个细胞的形态，以及根据共聚焦成像对固定组织进行的所需时间序列显微或免疫组织化学共定位分析。尽管该方法可提供关于神经肌肉接头处单个施万细胞形态及其分布区域的信息，也可应用于其他系统，如细胞系、活体脑片，甚至其他物种如斑马鱼。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为需要一定经验才能识别出足够表浅的神经肌肉接头，避免在不值得花费精力的结构上浪费时间。在开始手术前，需将任氏液至少氧合和冷却15分钟。将一个15厘米的组织培养皿置于冰上，并放置在显微镜下，用金属板覆盖。将盛有林格溶液的10厘米组织培养皿置于金属板上。将充氧石放入溶液中。下一步是选择一只天鹅细胞和轴突以不同颜色标记的小鼠。小鼠安乐死后，用乙醇喷洒其体表以防止毛发污染。使用大剪刀在胸骨处沿中线做一纵行切口，并在肋弓下缘两侧做两个平行切口。去除皮肤，打开腹腔，并在靠近胸骨肌肉附着处进行切割，分离胸肌。用镊子夹住剑突软骨，在剑突软骨下方剪开膈肌。沿膈肌的肋骨附着处解剖分离膈肌。使用镊子夹住剑突固定胸廓，必要时用任氏液润湿组织以防止干燥。从肋骨尽可能靠近其附着处开始，将肋骨从脊柱上切断。左右切口应在心脏上方会聚于胸骨柄处。应尽量避免损伤主要血管，尤其是锁骨下静脉。以获得更好的视野。用镊子夹住剑突，轻轻提起标本。在胸骨柄下方稍作横向剪切，以去除胸部组织，并将X explan转移至盛有预冷林格液的10厘米培养皿中。将培养皿置于显微镜下的金属板及盛有冰的容器上。使用小型弹簧剪，去除胸腺、胸膜、膈肌和胸肌的残留组织。使用小型弹簧剪，分离所有不附着于胸骨的肋骨。剪开肋骨之间的组织。这使得X外植体能够放入一个3.5厘米的SIL防护涂层培养皿中。现在使用8到10个缩短的Minuchin针，将X外植体固定，注意避开此处指出的三角形胸眼肌。两根针应穿过胸骨的软骨部分，另外两根针应穿过肋骨之间较柔软的软骨区域。避免刺穿三角肌下方或附近的肋骨。持续固定直至肋骨略微张开，将肌肉固定于轻度拉伸的位置。将3.5厘米涂有 sill guard 的培养皿转移至配备氩激光器和水浸物镜的共聚焦显微镜上。进行时间推移显微成像时，将3.5厘米涂有 sill guard 的培养皿插入加热环中，并安装灌流系统和温度探头。确保没有任何物体接触标本、培养皿边缘或雪茄涂层。对于延时显微成像，需加热X标本，但进行施万细胞漂白时，室温条件更佳。现在使用Forex空气物镜观察三角胸眼肌的神经支配模式，并找到三角胸眼肌的终板带。切换至 20 倍浸水锥形物镜，开始在 nplate 带区域中寻找浅层部位。肋骨上方及靠近肋间神经的区域是理想的候选区域。切换至 100 倍或 60 倍浸水锥形物镜，以观察单个 mjs 及其结构。理想情况下，应定位一个由多个施万细胞覆盖且位置非常表浅的神经肌肉接头。该实验方案成功的关键在于找到表浅且平坦的神经肌肉接头。由于神经肌肉接头位于圆柱形肌纤维表面，常被纤维包裹，通常难以获得理想的成像角度。因此，仅选择那些位置表浅、平坦并位于表面的神经肌肉接头。现在使用100倍、数值孔径为1.0的物镜。使用2.5倍放大倍数获取神经肌肉接头（NMJ）的共聚焦图像。这些设置可实现约0.1微米的像素尺寸，符合奈奎斯特采样标准，确保适当的空间采样。接下来，将488纳米激光束以最大功率照射施万细胞核中心位置5秒钟，进行光漂白。接下来，重新对焦细胞并评估漂白效果。如有必要，重复漂白步骤，直至GFP水平降低至接近背景水平，然后采集另一幅图像。必须确保漂白区域不位于两个细胞的重叠范围内。如果存在重叠，则第二个细胞的漂白现象将很明显。操作得当的情况下，该方法能够清晰地显示出最终的细胞，其形态往往十分独特，是在开始实验前难以预料的。重复漂白过程，直至除一个雪旺细胞外其余均被漂白。最后一个未漂白的施万细胞适用于共聚焦延时显微镜观察。完成延时成像后，需制作这些神经肌肉接头（njs）的定位图：先以100倍物镜（无缩放）拍摄一张图像，然后使用20倍物镜拍摄该区域的图像，并重复此过程使用4倍物镜进行拍摄。该定位图用于在固定肌肉组织经免疫组织化学染色后重新找到神经肌肉接头（njs）。成像和漂白后，取下外植体并将其转移至含有至少15毫升4%PFA的50毫升离心管中。随后将组织在冰上放置1小时；在冰上固定1小时后，用0.1摩尔甘氨酸PBS溶液冲洗至少10分钟。然后将固定的外植体转移至盛有0.01摩尔PBS的5厘米丝质网格包被的组织培养皿中，并准备进一步解剖外植体。首先，剪出一个梯形区域，其中一侧与胸骨平行，另一侧穿过骨与软骨的交界处，该区域表面包含斜方肌。接着，通过水平或横断胸骨的切口去除下部肋骨，以便能够自由接触到斜方肌的尾端。现在将皮下注射针头作为销钉插入斜方肌的上部。接着，去除三角肌。首先，用镊子轻轻夹住该肌肉的肌腱角。其次，使用注射器针头作为微型手术刀，沿胸壁平面进行平行切割。一旦肌肉的包裹部分被松解，通过胸壁在肌肉下方插入另一根针头以固定标本。在切断结缔组织附着处的同时，用镊子轻轻牵拉，将肌肉从胸壁上剥离下来。最后，使用镊子去除脂肪和血管残余物，注意不要撕裂神经。三角肌现在已准备好进行免疫组织化学染色。通过使用在PLP启动子驱动下表达GFP的小鼠制备了三角区胸段神经的标本，用于体外可视化施万细胞。通过将P-L-P-G-F-P小鼠与表达OFP3的转基因小鼠杂交，可同时实现轴突的可视化。根据所述方案，通过选择性漂白邻近的两个终末及首个轴突段施万细胞，活体状态下单个终末施万细胞的形态得以以前所未有的高分辨率呈现。利用预先创建的地图回溯成像的神经肌肉接头，并在活体共聚焦显微镜观察后，对固定的组织进行高分辨率扫描，三角肌胸肋部被固定并染色。图中显示的是乙酰胆碱受体，用与Alexa 647偶联的α-银环蛇毒素（bungeo toin）标记为红色，以及用抗突触素抗体标记的突触小泡，显示为白色。观看本视频后，您应能充分理解如何对最初均由同一种荧光蛋白标记且密度过高而无法单独分辨的单个细胞进行形态学可视化。我们的示例展示了神经肌肉接头，但还有许多其他潜在的应用。

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