连续光漂白划定单雪旺细胞在神经肌肉接头处
2013年1月11日
可视化的单个细胞密集的组织，如终端雪旺氏细胞（SC）的神经肌肉接头（NMJs），是具有挑战性的。 "连续光漂白"可以划定单一的终端南海，例如在的三角sterni肌肉外植体，方便神经肌肉准备，连续的漂白可以结合时间推移成像事后 immunostainings。
以下实验的总体目标是使用共聚焦显微镜在神经肌肉接头处描绘单个 schwan 细胞。该方案使用在末端和轴突施旺细胞中表达 GFP 的转基因小鼠。第一步是解剖出神经肌肉解释。
接下来，在给定的神经肌肉接头处对除一个 schwan 细胞外的所有 schwan 细胞进行连续漂白，揭示单细胞形态。最后，创建一个低功耗地图。组织被固定并用于免疫组织化学，以可视化与剩余未漂白的 schwan 细胞相关的任何所需标记物。
结果显示了单细胞形态，如果需要，还可以根据共聚焦成像在固定组织中进行延时显微镜或免疫组织化学共定位分析。尽管这种方法可以深入了解神经肌肉接头处单个天鹅细胞的形态和区域。它也可以应用于其他系统，例如细胞系、活脑切片，甚至是斑马鱼等其他物种。
一般来说，刚接触这种方法的人会很挣扎，因为需要一些经验来识别足够浅表的神经肌肉接头，而不是在不值得努力的结构上浪费时间。在开始手术之前，给林格溶液充氧并冷却至少 15 分钟。将装有冰的 15 厘米组织培养皿置于显微镜下。用金属板盖住它。
将装满 ringer 溶液的 10 厘米组织培养皿放在金属板上。将氧化石放入溶液中。下一步是选择天鹅细胞和轴突用不同颜色标记的小鼠。
小鼠安乐死后，用乙醇喷洒 为防止皮毛污染，用大剪刀在胸骨上做一个中线切口，两个切口平行于胸腔下缘。去除皮肤，打开腹部，用靠近胸骨肌肉插入处的切口解剖胸肌。用镊子抓住剑突软骨，并在剑突软骨下方切开横膈膜。
沿着肋插入物解剖隔膜。偶尔用林格溶液润湿组织，以防止通过剑突突使用镊子固定胸腔干燥。开始从脊柱上切下肋骨，尽可能靠近其插入点。
左右切口应在心脏上方朝向柄艉眼。尽量避免切割主要血管，尤其是锁骨下静脉。为了获得更好的能见度。
轻轻提起制剂，同时用镊子抓住剑突。现在在柄艉眼下方做一个横向切口，去除胸部，并将 X 解释转移到 10 厘米的培养皿中，加入准备好的林格溶液。将培养皿放在金属板上，在显微镜下将装满冰的培养皿放在显微镜下。
使用小弹簧剪刀去除胸腺、胸膜、横膈膜和胸肌的残留物。使用小弹簧剪刀，切掉所有未插入胸骨的肋骨。切开肋骨之间的组织。
这使得 X exlook 可以放入 3.5 厘米的 SIL 防护涂层培养皿中。现在使用 8 到 10 个缩短的 minuchin pin，固定 X 解释，避开此处指出的三角形船尾眼肌。两个销钉应穿过胸骨的软骨部分，两个销钉应穿过肋骨之间较软的软骨部分。
避免在三角肌下方或附近刺穿肋骨。继续固定，直到肋骨稍微张开。将肌肉固定到略微拉伸的位置。
将 3.5 厘米的门槛防护罩涂层培养皿转移到配备 Argonne 激光器和水浸物镜的共聚焦显微镜中。对于延时显微镜，将 3.5 厘米的门槛防护罩涂层培养皿插入加热环。安装超级融合系统并安装温度探头。
确保没有任何东西接触解释、盘子的边缘或雪茄涂层。对于延时显微镜，加热 X 解释，但对于 schwan 细胞漂白，室温更好。现在使用 Forex 空气物镜，观察三角形艉眼肌的神经支配模式，找到三角形艉眼端板带。
切换到 20 x 浸锥物镜，开始寻找 nplate 带区域内的浅表区域。覆盖肋骨和靠近肋间神经是很好的候选区域。切换到 100 x 或 60 x 浸锥物镜以检查单个和 mjs。
理想情况下，找到一个被几个 schwan 细胞覆盖的 NMJ，该细胞位于非常浅的地方，该方案成功的关键是找到它们的浅表和平坦的神经肌肉接头。由于神经肌肉接头正在创新圆柱形肌肉纤维，因此它往往缠绕在纤维周围，并且手通常没有完美的成像角度。仅选择浅表、平坦和表面的神经肌肉接头 现在使用 100 x 1.0 数值孔径物镜。
使用 2.5 缩放，获取 NMJ 的共聚焦图像。这些设置提供了大约 0.1 微米的像素大小，从而确保根据奈奎斯特准则进行适当的空间采样。现在，通过使用最大功率将 488 纳米激光束停在细胞核中央 5 秒钟来光漂白 schwan 细胞。
接下来，重新关注细胞并判断漂白结果。如有必要，再次重复漂白步骤，直到 GFP 水平降低到接近背景水平，然后获取另一张图像。确保漂白区域位于两个细胞之间的任何重叠之外至关重要。
如果存在重叠，则第二个单元格中的漂白将很明显。如果作得当，这种方法会产生清晰显示的最终细胞，通常具有相当令人惊讶的形态，这是人们在开始手术之前无法猜到的。重复漂白过程，直到除一个 schwan 细胞外的所有 schwan 细胞都漂白。
最后一个未漂白的 schwan 池适用于共聚焦延时显微镜。完成延时成像后，通过以 100 倍无缩放拍摄图像来制作这些 njs 的地图，然后使用 20 倍物镜拍摄区域图像，并使用 4 倍物镜重复该过程。需要此地图来根据固定肌肉的免疫化学找到 njs。
成像和漂白后，解开解释并将其转移到含有至少 15 毫升 4% PFA 的 50 毫升试管中。然后将试管放在冰上一小时，将组织冷却一小时后，用 0.1 摩尔甘氨酸的 PBS 溶液冲洗至少 10 分钟。然后将固定的解释转移到装满 0.01 摩尔 PBS 的 5 厘米护丝涂层组织培养皿中，并准备进一步解剖解释。
首先，切出一个梯形，一侧平行于胸骨，另一侧穿过骨骼到软骨的过渡。这包含其表面的三角肌。接下来，用水平或经胸骨切口去除下肋骨，以便可以自由进入三角肌的髂端。
现在将皮下注射针作为针插入梯形的上部。接下来，去除三角肌。首先，用镊子轻轻握住肌肉的匣子角。
其次，使用注射器和针头（如微型手术刀）平行于胸壁平面切割。一旦肌肉的 coddle 部分被释放，通过胸壁在肌肉下方插入另一根针以固定制剂。在切割结缔组织插入物时，轻轻拉出镊子，从胸部剥去肌肉。
最后，使用镊子去除脂肪和血管残留物。小心不要撕裂神经。三角肌现在已准备好进行免疫组化。
使用在 PLP 启动子下表达 GFP 的小鼠制备了三角形严眼外表，用于 schwan 细胞的离体可视化。通过将 P-L-P-G-F-P 穿过大腿 1 只 OFP 3 只小鼠，可以同时可视化轴突。使用所描述的方案，通过漂白相邻的两个末端和第一个轴突 schwan 细胞活体，以惊人的高度细节揭示了单末端 schwan 细胞的形态。
使用事先创建的地图追踪成像的神经肌肉接头，并在实时共聚焦显微镜下在固定组织中以高分辨率扫描，固定三角形艉解释并染色。此处显示的是用 bungalow toin 标记的乙酰胆碱受体与 Alexa 6 47 偶联（红色），以及用抗突触素抗体标记的突触囊泡（白色）。观看此视频后，您应该对如何可视化单细胞的形态有很好的了解，这些细胞最初都由相同的荧光蛋白标记，并且堆积太密集而无法单独分离。
我们的例子显示了神经肌肉接头，但还有许多其他潜在的应用。
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概述
本研究聚焦于使用共聚焦显微镜来可视化神经肌肉接点处的单个施旺细胞。该方法涉及顺序光漂白以在神经肌肉外植体制备中揭示单个细胞的形态。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 细胞生物学
- 成像技术
背景
- 施旺细胞在神经再生和功能中起着关键作用。
- 在密集组织中可视化这些细胞在技术上具有挑战性。
- 共聚焦显微镜提供高分辨率成像能力。
- 顺序光漂白是一种用于分离单个细胞进行研究的技术。
研究目的
- 描述神经肌肉接点处的单个施旺细胞。
- 利用表达绿色荧光蛋白的转基因小鼠进行可视化。
- 将成像技术与免疫染色相结合进行详细分析。
使用的方法
- 从转基因小鼠中解剖神经肌肉外植体。
- 在神经肌肉接点处对施旺细胞进行顺序漂白。
- 创建组织的低倍率地图。
- 免疫组织化学用于可视化与未漂白施旺细胞相关的特定标记。
主要结果
- 成功分离和可视化单个施旺细胞的形态。
- 创建了神经肌肉接点的详细地图。
- 增强了对施旺细胞分布和功能的理解。
- 在研究神经损伤和修复机制方面的潜在应用。
结论
- 该方法有效地允许研究单个施旺细胞。
- 将成像技术与免疫染色相结合提供了宝贵的见解。
- 这种方法可以应用于神经科学研究中的其他密集组织。
常见问题
Executive Industry Relevance
Resolving individual Schwann cells at the neuromuscular junction addresses a key challenge in neuroscience target validation where dense cellular packing obscures mechanistic insights. Sequential photo-bleaching enables precise morphological and spatial analysis of glial cells, supporting de-risking of targets involved in nerve repair and synaptic function. This approach enhances predictive confidence in early discovery by providing quantitative, reproducible readouts from disease-relevant systems without requiring genetic multiplexing or invasive procedures.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating single Schwann cell morphology and territory at the neuromuscular junction.
- Operational Value: Provides a non-invasive, live-cell compatible method to validate target engagement in glial populations without destroying cellular integrity.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by clarifying Schwann cell-axon interactions critical for neurotransmission and regeneration pathways.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, quantifiable imaging outputs suitable for high-content screening of compounds affecting glial structure or function.
- Reproducibility: Enables consistent baseline measurements through sequential bleaching and confocal mapping, reducing variability in longitudinal studies.
- Scalability: Compatible with diverse models including cell lines, brain slices, and zebrafish, supporting cross-species target validation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Facilitates study of Schwann cell dynamics in neuromuscular pathology, aligning with translational biomarker development for neuropathies.
- Preclinical Continuity: Bridges live imaging and fixed-tissue immunohistochemistry, enabling correlated analysis from functional to structural endpoints.
- Risk-Adjusted Advancement: Supports go/no-go decisions by visualizing cellular responses to injury or therapeutic intervention in intact neuromuscular junctions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, particularly for neuroscience programs focused on glial modulation and synaptic integrity.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by revealing individual Schwann cell morphology and spatial organization at the synapse.
- Screening: Enables assay readiness through reproducible, quantitative confocal imaging of bleached and unbleached cellular states.
- Analytics: Generates spatial and morphological readouts that allow comparison of glial responses across experimental conditions.
- Translational Research: Connects live imaging to immunohistochemistry, supporting biomarker correlation and mechanistic validation in fixed tissue.
- Enterprise Reuse: Represents a versatile, transferable capability applicable across cell types, species, and anatomical sites beyond the neuromuscular junction.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in glial cell function at the neuromuscular junction.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility through sequential bleaching and mapping workflows.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling reusable imaging pipelines that reduce reliance on complex genetic models.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of targets involved in nerve repair, synaptic maintenance, and glial-neuronal signaling.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, live-cell imaging, and photobleaching techniques.
- Dependent on access to laser scanning confocal systems with appropriate objectives and environmental controls.
- Necessitates standardization of bleaching parameters and imaging protocols across laboratories for reproducible results.
- Involves adaptation considerations when applying the method to thicker tissues or alternative model systems.
- Limited by the need for superficial, flat neuromuscular junctions to achieve optimal imaging quality, as noted in procedural constraints.
