Name: 冻结人类胚胎干细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-10-12T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 学习人类胚胎干细胞HuES的冷冻保存技术，掌握使用冷冻保护剂和控速冷冻方法维持细胞活力与分化潜能的标准化流程。该方法可确保细胞长期储存后的功能完整性，适用于再生医学研究。

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<li>用 PBS 清洗处于健康指数扩增状态的细胞培养物，以去除可能抑制胰蛋白酶反应的残留培养基。&nbsp; </li>
<li>加入预热的 0.05% 胰蛋白酶-EDTA 溶液覆盖细胞，于室温孵育最多 5 分钟。在此期间可观察到细胞变圆，细胞集落从培养板表面脱离。&nbsp; </li>
<li>通过轻柔反复吹打，将细胞和细胞集落从培养板表面完全脱离。&nbsp; </li>
<li>将消化后的细胞转移至标准锥形管中，管内含有预热的人胚胎干细胞培养基，以中和残余的胰蛋白酶，随后进行离心。&nbsp; </li>
<li>将细胞重悬于生长培养基中，浓度约为每 1 mL 培养基中含 100 万个细胞。</li>
<li>细胞充分重悬后，加入等体积的冰冻保存液。</li>
<li>细胞悬液充分混匀后，分装至冻存管中，并在 24 小时内缓慢冷冻至 -80°C。&nbsp; </li>
<li>冻存细胞随后可转移至液氮气相中进行长期保存，或在 -80°C 下保存约六个月。</li>
</ol>
<p class="jove_content">注意：浓度为 106 个细胞/ml 的冻存分装样品足以复苏一剂 10 cm 培养皿中的细胞培养物。</p>

<ol>
	<li>Cowan, C. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+Embryonic+Stem+Cells+from+Human+Blastocysts.">Derivation of Embryonic Stem Cells from Human Blastocysts.</a> , 1650-1656 (2004).</li></ol>

<p class="jove_content">我们所描述的HuES细胞系冻存技术，对于高效保存和复苏HuES细胞系以及任何感兴趣的哺乳动物细胞均具有良好效果。在培养人胚胎干细胞（hES）系时，每次传代时冻存少量细胞是一个重要考虑因素，因为可能会出现核型异常，且异常细胞可能迅速占据主导。因此，除了在特定传代阶段建立大规模细胞库外，每次传代均保留冻存的细胞分装样本尤为理想。</p>

<table><tbody><tr><td>huES 培养基</td><td>培养基</td><td></td><td></td><td>共 651.5 mL，加入：500 mL KO-DMEM + 6.5 mL 青霉素-链霉素 + 6.5 mL L-谷氨酰胺 + 6.5 mL 非必需氨基酸 + 6.5 mL β-巯基乙醇 0.6 &amp;#8211;0.6 &amp;micro;L（14.3 M 储存液）+ 65 mL 血清替代物 + 65 mL 血浆代用品 + 0.65 mL bFGF2（终浓度约 10 ng/mL）</td></tr><tr><td>冻存培养基</td><td>培养基</td><td></td><td></td><td>80% FCS（胎牛血清）+ 20% DMSO（二甲基亚砜）。4 &amp;deg;C 保存。</td></tr></tbody></table>

冻存人类胚胎干细胞

Freezing Human ES Cells

在此，我们演示本实验室如何冻存HuES人类胚胎干细胞系。将处于健康指数扩增状态的细胞培养物用PBS洗涤，以去除可能抑制胰蛋白酶反应的残留培养基。随后加入预热的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液，覆盖细胞表面，在室温下孵育最多5分钟。在此期间可观察到细胞变圆，细胞集落从培养皿表面脱离。通过轻柔反复吹打，可将细胞和集落从培养皿表面完全脱离。胰蛋白酶消化后的细胞转移至标准锥形离心管中，管内含有预热的hES细胞培养基，以中和残余胰蛋白酶活性，随后离心。细胞沉淀用生长培养基重悬，浓度约为每毫升培养基含一百万个细胞，此浓度可确保一个冻存样本足以复苏一个10 cm培养皿上的细胞培养。细胞充分重悬后，加入等体积的冰冻保存液。细胞悬液充分混匀后，分装至冻存管中，并在24小时内缓慢降温至-80°C。冻存后的细胞可转移至液氮气相中长期保存，或在-80°C保存约六个月。

<p class="jove_content">本文展示了我们实验室如何冻存HuES人类胚胎干细胞系。</p>

在此，我们演示了本实验室冷冻保存HuES人类胚胎干细胞系的方法。将处于健康且呈指数扩增状态的细胞培养物用PBS洗涤，以去除...

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科研

JoVE Journal

Biology

生物学

冻结人类胚胎干细胞

本文展示了我们的实验室如何从冻存株开始培养HuES人类胚胎干细胞系。...

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学习人类胚胎干细胞HuES的冷冻保存技术，掌握使用冷冻保护剂和控速冷冻方法维持细胞活力与分化潜能的标准化流程。该方法可确保细胞长期储存后的功能完整性，适用于再生医学研究。

冻存人类胚胎干细胞

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