用于脑组织慢性光遗传学刺激的光纤植入

以下实验的目的是在清醒且行为正常的小鼠中长期激活并研究神经回路。该方法改编自 Sparta 等人最初描述的概念。首先组装一根光纤连接线，将光学旋转接头与光纤植入物连接起来，即可实现这一目标。

接下来，将光纤植入目标脑组织上方，以形成一条通道，使光能够直接传递到表达通道红蛋白的神经元。最后，将光源连接至光学旋转接头，从而建立从光源到脑组织的串联式光路。最终，可通过体内实验、电生理学和行为学研究来评估光诱导的表达通道红蛋白神经元的放电活动。

与现有的导管套管等方法相比，该技术的主要优势在于能够最大限度地减少因反复插入和取出光纤所造成的脑组织损伤。尽管该方法可为神经环路功能提供深入见解，也可应用于其他系统，以更好地理解特定类型神经系统疾病背后的突触和环路依赖性机制。该方法的可视化演示至关重要。

由于植入步骤较难掌握，每一个看似微小的操作都会极大地影响该方法的整体稳定性和可靠性。首先，将碳化钨刻划笔的楔形尖端垂直于光纤并单向划动一次，对一根直径为125微米、纤芯为100微米的光纤进行刻划，随后直接拉断，截取35毫米长度的光纤。接着，将一个直径为127微米、内孔呈向下凸面的LC陶瓷插芯插入台钳中，然后将截好的光纤插入插芯内。

光纤应平滑地插入，并略微从野猪探头的凸端伸出。然后，在野猪探头的平端滴加一滴新配制的可热固化的光纤环氧树脂，接着用热风枪加热环氧树脂。加热时，环氧树脂应填充整个野猪探头，当其变为黑色时即完成固化。

固化后，清除毛细管侧面的任何环氧树脂，然后使用LC光纤抛光盘在抛光垫上的氧化铝抛光片上以四种递减的粒度等级对毛细管的凸端进行圆形旋转抛光。随后，将光纤的平端切割至适合靶向目标区域的适当长度。为测试抛光后的光纤，将植入物的抛光端插入耦合器的套筒中。

在感受到与相对的野生型小鼠直接接触之前，质量差的植入物会在光纤尖端附近产生一个较弱的焦点，而质量好的植入物则会传输出一个平滑且同心的光圈，无输出异常。最高功率达10毫瓦的光源用于储存制备完成的植入物，直至使用前均存放于泡沫中。开始此步骤时，需先测量并划刻一根直径为220微米、纤芯为200微米的光纤，以允许小鼠自由活动，同时防止小鼠咬断光纤。

然后将光纤插入一段松套管中，该松套管的内径略大于光纤，长度略短于光纤。接下来，从光纤一端剥除约25毫米的外层，然后将其插入多模FC-MM尾纤组件的金属端。继续插入，直至光纤到达直径为230微米的孔底，此时光纤应从尾纤端露出。

接下来，在金属端使用氰基丙烯酸酯固定连接处，并用连接器护套覆盖该连接处，再使用FC抛光盘对野端进行抛光，方法如前所示。剥除光纤另一端后，将其插入LC陶瓷野端，仅使凸面朝向远端。然后在平端滴加一滴环氧树脂，加热至固化，操作方法如前所示。

完成如上所述对野牛凸端的抛光后，将一个LC野牛套管滑至野牛的凸端，直至野牛到达套管的中点位置。然后将热缩管套在连接管和套管上，并加热热缩管，使其收缩以固定并保护连接处。最后，将野牛连接至激光光源，并通过分光光度计测量耦合器处的光输出来测试其性能；在开始手术前，激光输出端与测量耦合器输出端之间的光损耗不应超过30%。

用异丙醇对术区进行消毒，随后使用氯己定溶液消毒。接下来，将小鼠置于立体定位仪中并固定头部，确保颅骨处于水平位置。在动物的眼睛上涂抹眼用软膏，以防止干燥及术后疼痛。

现在沿头皮正中线做切口，暴露从眼眶至人字缝的颅骨。使用Serafin钳夹住皮肤以向后牵开，保持对颅骨的通路。然后使用牙科探针在颅骨表面刻划出方格状图案。

用无菌生理盐水冲洗掉产生的碎屑。彻底干燥后，用棉签将3%过氧化氢涂抹于暴露的颅骨上，持续约两到三秒，以形成微孔。然后用更多的无菌生理盐水多次冲洗颅骨，并彻底干燥。

蚀刻、清洗并干燥颅骨上的棋盘格图案后，再次将光纤植入物插入探针夹持器中，然后将其连接至立体定位臂。使用针对 bregma 和 lambda 校准的立体定位图谱确定钻孔位置。随后使用旋转牙科钻在目标区域上方制造一个直径小于一毫米的小钻孔开颅，注意不要破坏硬脑膜或损伤任何组织。

使用立体定位臂将植入物准确放置在目标区域正上方，植入物应稳固地贴附于周围的颅骨组织上。现在使用无菌的牙签，将新配制的牙科水泥均匀地涂抹一层于颅骨表面及植入物的下部。注意避免接触动物的皮肤，牙科水泥的底层应尽可能覆盖更大的颅骨表面积。

该操作中最困难的部分是在涂抹牙科水泥时避免其接触到质量块的皮肤。为确保成功，应每次涂抹少量水泥，形成薄层，并等待每一层完全干燥后再添加下一层。均匀涂抹牙科水泥，在颅骨顶部及植入物周围形成一个小的隆起结构。

保留野鼠牙齿凸端3至5毫米的区域不涂水泥，以确保连接平滑且无阻碍。然后将头皮缝合覆盖在牙科水泥的隆起处，并在缝合后可使用Vet Bond粘合剂进行额外固定。最后，在缝合的皮肤及植入物基部周围涂抹局部镇痛药和抗生素，然后将小鼠放入笼中进行术后恢复。

光纤植入物与耦合器的正确组装可使光源与目标区域光纤末端之间的光子损耗最小化。经过抛光的光纤应均匀地传输光，形成一个同心圆，如图中所示。通过精细的植入和缝合操作，该植入物不会对小鼠造成可见的刺激反应，并可在长期研究中保持稳定，且光纤性能或光传输量无明显下降。在清醒小鼠中进行的功能性行为检测显示，通过植入运动皮层上方的光纤进行刺激可引发直接反应，这一点由本体内电生理视频数据证实：数据显示通过植入光纤可激活特定神经元，并在脑刺激过程中观察到动物相应的行为反应。完成本操作后，可进一步开展其他方法，例如对特定脑区进行光刺激，以回答更多科学问题，例如：与靶细胞相关的神经环路连接模式是什么？

观看本视频后，您应能充分了解如何组装光纤植入物和耦合导线，以及如何将它们植入表达光遗传学载体的脑组织上方。