Name: 光纤植入慢性Optogenetic刺激脑组织 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-10-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: 了解光纤植入慢性光遗传学刺激技术，用于在清醒活动的小鼠中精确控制神经元活动并研究神经环路功能。该方法可最小化脑组织损伤，实现长期稳定的光刺激。

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我们要感谢Sparta et al., 2012首次描述了该技术，我们实验室已将其轻松地加以改进并应用于实际研究中。

*所有材料及其相应的生产商和/或供应商均列于方案下方。
1. 植入物的组装
<ol>
	<li>通过将100 mg固化剂加入1 g树脂中，配制热固化光纤环氧树脂混合物。</li>
	<li>使用楔形碳化钨刻划笔在光纤上刻划，测量并截取约35 mm长、带100 μm纤芯的125 μm光纤。将刻划笔垂直于光纤放置，并沿单一方向一次性完成刻划。完全切断光纤会损坏光纤纤芯。</li>
	<li>将带有127 μm孔径的LC陶瓷插芯插入夹具中，凸面朝下。</li>
	<li>将光纤插入插芯中。光纤应能顺畅滑入，并略微从插芯的凸端伸出（图1a）。</li>
	<li>在插芯的平面端滴加一滴热固化光纤环氧树脂，并用热风枪加热至环氧树脂变黑。加热过程中环氧树脂应填充整个插芯，并在约1分钟持续加热后完成固化。</li>
	<li>清除插芯侧面残留的环氧树脂，以免影响与耦合器的连接。</li>
	<li>使用LC光纤抛光盘（FOPD）在抛光垫上的氧化铝抛光纸上对插芯的凸端进行抛光（图1b）。以圆形轨迹进行抛光，依次使用四种不同粒径的抛光纸：5、3、1、0.3 μm。</li>
	<li>在平面端将光纤截至适当长度，使其能够准确指向目标区域。长度可通过立体定位图谱确定。</li>
	<li>通过下文所述的耦合器连接线将植入物连接至激光器，以测试其性能。将植入物的抛光端插入耦合器的套管中，并与对面的插芯直接接触。植入物应在光纤尖端处维持10 mW的光输出（在尖端测量）。劣质植入物在光纤尖端附近会出现焦点微弱的现象。</li>
	<li>将完成的植入物（图1c）存放于泡沫材料中，直至使用。</li>
</ol>
2. 光纤耦合器跳线的组装
<ol>
	<li>按上述方法配制热固性光纤环氧树脂混合物。</li>
	<li>使用楔形碳化钨刻划笔在220 μm光纤（芯径200 μm）上刻痕，测量并截取适当长度。光纤长度应允许小鼠在笼内自由活动，但不能长到让小鼠咬到光纤。</li>
	<li>将光纤插入一段略长于光纤长度的分路护套管中。护套管的内径应略大于光纤外径。</li>
	<li>剥离光纤一端约25 mm的涂覆层，并将其插入多模FC MM插芯组件的金属端（孔径230 μm），直至顶住。光纤应从插芯末端露出（图2a）。</li>
	<li>在金属端用氰基丙烯酸酯（超级胶水）固定连接处。套上连接器护套，并使用FC FOPD对插芯端面进行抛光。采用圆形旋转方式，按以下顺序在四种粒径的抛光纸上依次抛光：5、3、1、0.3 μm（图2b）。</li>
	<li>剥离光纤另一端的涂覆层，并将其插入LC陶瓷插芯（内径230 μm）中，使凸面朝远端。在平面端滴加一滴环氧树脂，加热至固化。</li>
	<li>按照上述方法，使用FC FOPD和氧化铝抛光片对插芯的凸面端进行抛光。</li>
	<li>将LC插芯套筒滑过插芯的凸面端，直至套筒中点位置。</li>
	<li>将热缩管套在分路护套管和套筒上，加热以固定并保护连接部位（图2c）。</li>
	<li>通过将耦合器连接至激光光源，并使用分光光度计测量耦合器输出端的光强来测试耦合器性能。激光输出与耦合器测量输出之间的光损耗不应超过30%。</li>
</ol>
3. 外科植入
*此为仅含操作提示的流程。器械已灭菌，但由于需频繁在器械与设备间操作，手套无需保持无菌。
<ol>
	<li>使用30号针头，通过腹腔注射 Ketamine/Xylazine 混合物（剂量分别为100 mg/kg和10 mg/kg）对小鼠进行麻醉。</li>
	<li>使用电推剪剃除小鼠头皮毛发，先用70%异丙醇擦拭头皮，再用Betasept擦拭巾（4%氯己定溶液）擦拭两分钟，重复一次。</li>
	<li>将小鼠固定于立体定位仪中，确保头部稳固且颅骨水平。在眼睛上涂抹眼用软膏，以防止干燥及术后疼痛。通过吸入挥发性异氟烷（1–3%，以氧气稀释，具体浓度根据小鼠生理状态调整，并通过尾夹反应持续监测）维持麻醉状态。</li>
	<li>沿头皮正中线做切口，暴露从眼眶至人字缝的颅骨区域，必要时拨开结缔组织。</li>
	<li>使用Serafin止血钳牵开皮肤，保持对颅骨的暴露（图3a）。</li>
	<li>用牙科探针在颅骨表面刻划出方格状纹路。用无菌生理盐水冲洗碎屑，并彻底干燥。</li>
	<li>用棉签将3%过氧化氢涂抹于暴露的颅骨表面，持续约2–3秒，以形成微孔。多次冲洗并彻底干燥。或者，也可按照Sparta et al.（2012）所述方法，将锚钉旋入颅骨。</li>
	<li>再次用牙科探针在颅骨表面刻划方格状纹路，并用生理盐水冲洗碎屑，彻底干燥。</li>
	<li>使用旋转工具，在目标脑区上方（根据前囟和人字缝校准的立体定位图谱确定）用无菌钻头（经高压灭菌）进行小范围环钻开颅（直径<1 mm）。操作时注意避免损伤硬脑膜或周围组织。清除碎屑并彻底干燥。</li>
	<li>将光纤插芯（植入物）插入探针固定器，并连接至立体定位臂。</li>
	<li>利用立体定位臂将植入物准确定位于目标脑区正上方（图3b）。若需将光纤插入脑组织，应以约2 mm/min的缓慢速度推进。插芯应稳固地置于残留的颅骨表面。</li>
	<li>配制牙科水泥混合物，其黏度应足够低，以便于在颅骨上均匀涂抹。混合物的有效操作时间约为2–4分钟。</li>
	<li>使用无菌牙签将一层薄而均匀的牙科水泥涂抹于颅骨表面及植入物下部。底层水泥应尽可能覆盖更大的颅骨面积。注意避免水泥接触小鼠皮肤，否则会增加缝合难度并引起动物不适。若水泥不慎接触皮肤，应待其部分干燥后，在完全固化前整层剥离。</li>
	<li>使其完全干燥。</li>
	<li>逐层均匀涂抹牙科水泥，在颅骨及植入物周围形成一个小隆起，每涂一层均需待其完全干燥（图3c）。保留插芯凸端约3–5 mm不涂水泥，以确保后续连接时接触面光滑、无阻碍。</li>
	<li>使用无菌一次性丝线缝合线（6-0）和C22针，将头皮缝合覆盖于水泥隆起及植入物周围。术后7天拆除缝线。可选：缝合后使用Vet Bond进行额外加固，但务必少量使用，过量可能导致动物抓挠引发严重皮肤损伤。</li>
	<li>术后立即皮下注射Ketoprofen（5 mg/kg）以减轻术后疼痛，24小时后重复给药一次。在缝合部位及植入物基部涂抹局部镇痛药（布比卡因）和抗生素（Neosporin）。</li>
	<li>术后将小鼠置于加热垫上的笼子中，以促进麻醉恢复。将小鼠转移至无菌的术后恢复笼中。恢复笼内不应放置垫料，以维持体温并防止窒息。待小鼠清醒后，可将其移回原笼或更换新笼。</li>
</ol>
光纤植入物与耦合器的正确组装可使光源与目标区域光纤末端之间的光子损失最小化。抛光良好的光纤应传输出均匀且同心的圆形光斑（图2d）。通过精细的植入和缝合操作，植入物不会引起小鼠明显的刺激反应，并可在长期研究中保持稳定（图3d，>1个月，未发表观察结果），且光纤性能或光传输量无明显下降。植入或缝合不当可能引起刺激，导致小鼠抓挠头皮，暴露牙科水泥，或因持续抓挠造成陶瓷套管从牙科水泥中脱落或断裂。组装系统的示意图见于图4。
<img alt="光纤制备过程；包括套管切割、抛光盘使用和环氧树脂固化。" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 1"> 
图 1. 可植入式光纤的组装。（a）将光纤插入套管中，使其略微突出于凸端，箭头所示。（b）使用光纤抛光装置（FOPD）在逐级更细的抛光纸上抛光套管的凸端。（c）完成的可植入式光纤。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50004/50004fig1large.jpg" target="_blank">点击此处查看大图</a>。
<img alt="带连接器护套、插芯抛光、LC套筒和同心光的光纤制备。" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
图 2. 用于将光纤旋转接头固定至植入物的光纤耦合器组装过程。(a) 光纤穿过插芯组件。(b) 将插芯端插入光纤功率检测器（FOPD），并使用粒度逐渐增细的抛光纸进行抛光。(c) 将插芯套筒套在插芯上，并用热缩管固定。(d) 完成的光纤耦合器应产生同心光，且光子损耗最小。
<img alt="用于活体脑成像研究的小鼠颅窗手术装置；显示逐步操作流程。" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
图3. 光纤植入物的外科植入。（a）暴露颅骨整个表面，并清除结缔组织。（b）使用立体定位臂将光纤植入物固定在预定位置。（c）使用牙科水泥将光纤植入物固定于颅骨上。（d）植入后 >1 个月，皮肤已围绕植入物愈合，无任何刺激迹象。
<img alt="用于神经刺激的啮齿类动物固态激光器与光纤植入式光遗传学装置示意图" src="/files/ftp_upload/50004/50004fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 4"> 
图 4. 功能系统的示意图

<ol><li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neuronal activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Arenkiel, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Light-Induced+Activation+of+Neural+Circuitry+in+Trangenic+Mice+Expressing+Channelrhodopsin-2%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In Vivo Light-Induced Activation of Neural Circuitry in Trangenic Mice Expressing Channelrhodopsin-2.</a> Neuron. 54, 205-218 (2007).</li>
<li>Gradinaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+approaches+for+diversifying+and+extending+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular approaches for diversifying and extending optogenetics.</a> Cell. 141, 165-16 (2010).</li>
<li>Luo, L., Callaway, E. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of neural circuits.</a> Neuron. 57, 634-660 (2008).</li>
<li>Arenkiel, B. R., Ehlers, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetic+and+imaging+technologies+for+circuit+based+neuroanatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular genetic and imaging technologies for circuit based neuroanatomy.</a> Nature. 461, 900-907 (2009).</li>
<li>Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+interrogation+of+neural+circuits%3A+technology+for+probing+mammalian+brain+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Optogenetic interrogation of neural circuits: technology for probing mammalian brain structures.</a> Nat. Protoc. 5, 439-456 (2010).</li>
<li>Adamantidis, A. R., Zhang, F., Aravanis, A. M., Deisseroth, K., de Lecea, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+substrates+of+awakening+probed+with+optogenetic+control+of+hypocretin+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neural substrates of awakening probed with optogenetic control of hypocretin neurons.</a> Nature. 450, 420-424 (2007).</li>
<li>Sparta, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+implantable+optical+fibers+for+long-term+optogenetic+manipulation+of+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Construction of implantable optical fibers for long-term optogenetic manipulation of neural circuits.</a> Nature Protocols. 7, 12-23 (2012).</li>
<li>Stuber, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitatory+transmission+from+the+amygdala+to+nucleus+accumbens+facilitates+reward+seeking%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Excitatory transmission from the amygdala to nucleus accumbens facilitates reward seeking.</a> Nature. 475, 377-380 (2011).</li>
<li>Liu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+stimulation+of+a+hippocampal+engram+activates+fear+memory+recall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Optogenetic stimulation of a hippocampal engram activates fear memory recall.</a> Nature. 484, 381-385 (2012).</li>
</ol>

光遗传学是一种强大的新技术，能够对特定神经元亚型实现前所未有的精确控制。该技术可用于以解剖学和时间上的高精度调控神经环路，同时避免了通过电极进行电刺激所导致的非细胞类型特异性及侵入性效应。植入光纤可实现对清醒且行为正常的实验小鼠在多个实验阶段进行稳定、长期的神经环路刺激，且对组织损伤极小。该系统最初由 Sparta et al.8 开创，并经我们根据研究目的进行了改进，相较于传统的植入式套管，该系统进一步将光纤固定于目标脑区，以确保在长期研究中各次实验间靶向位置的一致性。这些植入装置可被调整以刺激大脑的不同区域。
该方法中的各个步骤均需要精确操作并注重细节。每个光纤耦合连接处都必须经过抛光，以确保光损耗最小。抛光后，应使用显微镜检查光纤端面，确认光纤纤芯无任何损伤。如果光源与测量输出之间的光损耗超过30%，则应对各部件重新抛光以实现最大光子通量，或直接弃用并重新制作该部件。若插芯无法顺利插入套筒，则可能是套筒内部存在碎屑阻碍了插芯的插入。在将耦合光纤连接或拆卸至植入物时，施加的力必须严格平行于植入物的轴线方向。由于哺乳动物组织对光具有较强的...

<table><tbody><tr><td>LC卡套套筒</td><td>Precision Fiber Products (PFP)</td><td>SM-CS125S</td><td>1.25 mm内径</td></tr><tr><td>FC多模预组装连接器</td><td>PFP</td><td>MM-CON2004-2300</td><td>230 &amp;mu;m卡套</td></tr><tr><td>FC多模预组装连接器</td><td>PFP</td><td>MM-CON2004-2300</td><td>230 &amp;mu;m卡套</td></tr><tr><td>Miller FOPD-LC圆盘</td><td>PFP</td><td>M1-80754</td><td>适用于LC卡套</td></tr><tr><td>分叉管</td><td>PFP</td><td>FF9-250</td><td>外径900 &amp;mu;m，内径250 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>多模LC棒状卡套 1.25 mm</td><td>PFP</td><td>MM-FER2007C-1270</td><td>内孔直径127 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>多模LC棒状卡套 1.25 mm</td><td>PFP</td><td>MM-FER2007C-2300</td><td>内孔直径230 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>可热固化的环氧树脂、固化剂和树脂</td><td>PFP</td><td>ET-353ND-16OZ</td><td></td></tr><tr><td>FC/PC和SC/PC连接器抛光盘</td><td>ThorLabs</td><td>D50-FC</td><td>适用于FC卡套</td></tr><tr><td>数字式光功率和能量计</td><td>ThorLabs</td><td>PM100D</td><td>分光光度计</td></tr><tr><td>抛光垫</td><td>ThorLabs</td><td>NRS913</td><td>9&quot; x 13&quot; 50邵氏硬度</td></tr><tr><td>氧化铝研磨（抛光）片：0.3、1、3、5 &amp;mu;m粒径</td><td>ThorLabs</td><td>LFG03P, LFG1P, LFG3P, LFG5P</td><td></td></tr><tr><td>标准硬包层多模光纤</td><td>ThorLabs</td><td>BFL37-200</td><td>低OH含量，200 &amp;mu;m纤芯，数值孔径0.37</td></tr><tr><td>光纤剥线工具</td><td>ThorLabs</td><td>T10S13</td><td>包层/涂层：200 &amp;mu;m / 300 &amp;mu;m</td></tr><tr><td>SILICA/SILICA石英光纤</td><td>Polymicro Technologies</td><td>FVP100110125</td><td>高-OH，紫外增强，数值孔径0.22</td></tr><tr><td>1x1光纤旋转接头</td><td>doric lenses</td><td>FRJ_FC-FC</td><td></td></tr><tr><td>单模光纤跳线</td><td>doric lenses</td><td>MFP_200/230/900-0.37_2m_FC-FC</td><td></td></tr><tr><td>热缩管，1/8英寸</td><td>Allied Electronics</td><td>689-0267</td><td></td></tr><tr><td>热风枪</td><td>Allied Electronics</td><td>972-6966</td><td>250 W；750-800 &amp;deg;F</td></tr><tr><td>棉签式涂抹器</td><td>Puritan Medical Products Company</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>VetBond组织粘合剂</td><td>Fischer Scientific</td><td>19-027136</td><td></td></tr><tr><td>速凝义齿基托丙烯酸树脂</td><td>Yates Motloid</td><td>ColdPourPowder+Liq</td><td></td></tr><tr><td>BONN微型虹膜剪刀</td><td>Integra Miltex</td><td>18-1392</td><td>3-1/2&quot;(8.9cm)，直型，15 mm刀片</td></tr><tr><td>约翰·霍普金斯动脉瘤夹</td><td>Integra Miltex</td><td>7-290</td><td>1-1/2&quot;(3.8 cm)，弯型</td></tr><tr><td>MEGA-Torque电动实验室电机</td><td>Vector</td><td>EL-S</td><td></td></tr><tr><td>Panther球形钻头 #1</td><td>Clarkson Laboratory</td><td>77.1006</td><td></td></tr><tr><td>紫蓝色激光系统</td><td>CrystaLaser</td><td>CK473-050-O</td><td>波长：473 nm</td></tr><tr><td>激光电源</td><td>CrystaLaser</td><td>CL-2005</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #2椎板切除镊</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>探针</td><td>Fine Science Tools</td><td>10140-02</td><td></td></tr><tr><td>5&quot;直型止血钳</td><td>Excelta</td><td>35-PH</td><td></td></tr><tr><td>带配重底座的台钳</td><td>Altex Electronics</td><td>PAN381</td><td></td></tr></tbody></table>

用于脑组织慢性光遗传学刺激的光纤植入

Fiber-optic Implantation for Chronic Optogenetic Stimulation of Brain Tissue

阐明神经元连接模式一直是临床神经科学和基础神经科学面临的挑战。电生理学一直是分析突触连接模式的金标准，但成对的电生理记录既繁琐又在实验上存在局限性。光遗传学的发展引入了一种优雅的方法，可用于体外in vitro1和体内in vivo2,3刺激神经元和神经回路。通过利用特定细胞类型的启动子活性，驱动视蛋白在特定神经元群体中的表达，可实现对不同回路中基因定义的神经元亚型进行精确刺激4-6。已有充分描述的神经元刺激方法，如电刺激和/或药理学操控，通常缺乏细胞类型特异性，具有侵入性，并可能损伤周围组织。这些局限性可能改变正常的突触功能和/或回路活动。此外，由于操作本身的性质，现有方法通常仅适用于急性或终末实验。光遗传学提供了一种相对无创且可靶向特定基因型神经元的刺激能力。目前涉及体内in vivo光遗传学的大多数研究使用通过植入式套管引导的光纤6,7；然而，该方法的局限性包括反复插入光纤造成的脑组织损伤，以及光纤在套管内断裂的潜在风险。鉴于光遗传学领域的迅速发展，亟需一种更可靠的慢性刺激方法，以支持长期研究并最大限度减少附带组织损伤。本文以视频文章形式提供我们改进后的实验方案，作为对 Sparta et al.8中所述光纤植入物制备及其永久固定于麻醉小鼠颅骨的方法，以及连接植入物与光源的光纤耦合器组装方法的有效补充。该植入物通过光纤连接至固态激光器，利用小型、可拆卸的固定装置，实现对功能神经回路的高效慢性光刺激，并减少组织损伤9。光纤植入物的永久固定使得在清醒、自由活动的小鼠中开展稳定、长期的体内in vivo光遗传学研究成为可能，同时将组织损伤降至最低10。

光遗传学的发展如今提供了精确刺激特定基因定义的神经元和神经环路的手段，两者均可 体外 和 体内本文描述了用于长期光刺激脑组织的光纤装置的组装与植入方法。

阐明神经元连接模式一直是临床和基础神经科学领域的挑战。电生理学一直是……

以下实验的目的是在清醒且行为正常的小鼠中长期激活并研究神经回路。该方法改编自 Sparta 等人最初描述的概念。首先组装一根光纤连接线，将光学旋转接头与光纤植入物连接起来，即可实现这一目标。接下来，将光纤植入目标脑组织上方，以形成一条通道，使光能够直接传递到表达通道红蛋白的神经元。最后，将光源连接至光学旋转接头，从而建立从光源到脑组织的串联式光路。最终，可通过体内实验、电生理学和行为学研究来评估光诱导的表达通道红蛋白神经元的放电活动。与现有的导管套管等方法相比，该技术的主要优势在于能够最大限度地减少因反复插入和取出光纤所造成的脑组织损伤。尽管该方法可为神经环路功能提供深入见解，也可应用于其他系统，以更好地理解特定类型神经系统疾病背后的突触和环路依赖性机制。该方法的可视化演示至关重要。由于植入步骤较难掌握，每一个看似微小的操作都会极大地影响该方法的整体稳定性和可靠性。首先，将碳化钨刻划笔的楔形尖端垂直于光纤并单向划动一次，对一根直径为125微米、纤芯为100微米的光纤进行刻划，随后直接拉断，截取35毫米长度的光纤。接着，将一个直径为127微米、内孔呈向下凸面的LC陶瓷插芯插入台钳中，然后将截好的光纤插入插芯内。光纤应平滑地插入，并略微从野猪探头的凸端伸出。然后，在野猪探头的平端滴加一滴新配制的可热固化的光纤环氧树脂，接着用热风枪加热环氧树脂。加热时，环氧树脂应填充整个野猪探头，当其变为黑色时即完成固化。固化后，清除毛细管侧面的任何环氧树脂，然后使用LC光纤抛光盘在抛光垫上的氧化铝抛光片上以四种递减的粒度等级对毛细管的凸端进行圆形旋转抛光。随后，将光纤的平端切割至适合靶向目标区域的适当长度。为测试抛光后的光纤，将植入物的抛光端插入耦合器的套筒中。在感受到与相对的野生型小鼠直接接触之前，质量差的植入物会在光纤尖端附近产生一个较弱的焦点，而质量好的植入物则会传输出一个平滑且同心的光圈，无输出异常。最高功率达10毫瓦的光源用于储存制备完成的植入物，直至使用前均存放于泡沫中。开始此步骤时，需先测量并划刻一根直径为220微米、纤芯为200微米的光纤，以允许小鼠自由活动，同时防止小鼠咬断光纤。然后将光纤插入一段松套管中，该松套管的内径略大于光纤，长度略短于光纤。接下来，从光纤一端剥除约25毫米的外层，然后将其插入多模FC-MM尾纤组件的金属端。继续插入，直至光纤到达直径为230微米的孔底，此时光纤应从尾纤端露出。接下来，在金属端使用氰基丙烯酸酯固定连接处，并用连接器护套覆盖该连接处，再使用FC抛光盘对野端进行抛光，方法如前所示。剥除光纤另一端后，将其插入LC陶瓷野端，仅使凸面朝向远端。然后在平端滴加一滴环氧树脂，加热至固化，操作方法如前所示。完成如上所述对野牛凸端的抛光后，将一个LC野牛套管滑至野牛的凸端，直至野牛到达套管的中点位置。然后将热缩管套在连接管和套管上，并加热热缩管，使其收缩以固定并保护连接处。最后，将野牛连接至激光光源，并通过分光光度计测量耦合器处的光输出来测试其性能；在开始手术前，激光输出端与测量耦合器输出端之间的光损耗不应超过30%。用异丙醇对术区进行消毒，随后使用氯己定溶液消毒。接下来，将小鼠置于立体定位仪中并固定头部，确保颅骨处于水平位置。在动物的眼睛上涂抹眼用软膏，以防止干燥及术后疼痛。现在沿头皮正中线做切口，暴露从眼眶至人字缝的颅骨。使用Serafin钳夹住皮肤以向后牵开，保持对颅骨的通路。然后使用牙科探针在颅骨表面刻划出方格状图案。用无菌生理盐水冲洗掉产生的碎屑。彻底干燥后，用棉签将3%过氧化氢涂抹于暴露的颅骨上，持续约两到三秒，以形成微孔。然后用更多的无菌生理盐水多次冲洗颅骨，并彻底干燥。蚀刻、清洗并干燥颅骨上的棋盘格图案后，再次将光纤植入物插入探针夹持器中，然后将其连接至立体定位臂。使用针对 bregma 和 lambda 校准的立体定位图谱确定钻孔位置。随后使用旋转牙科钻在目标区域上方制造一个直径小于一毫米的小钻孔开颅，注意不要破坏硬脑膜或损伤任何组织。使用立体定位臂将植入物准确放置在目标区域正上方，植入物应稳固地贴附于周围的颅骨组织上。现在使用无菌的牙签，将新配制的牙科水泥均匀地涂抹一层于颅骨表面及植入物的下部。注意避免接触动物的皮肤，牙科水泥的底层应尽可能覆盖更大的颅骨表面积。该操作中最困难的部分是在涂抹牙科水泥时避免其接触到质量块的皮肤。为确保成功，应每次涂抹少量水泥，形成薄层，并等待每一层完全干燥后再添加下一层。均匀涂抹牙科水泥，在颅骨顶部及植入物周围形成一个小的隆起结构。保留野鼠牙齿凸端3至5毫米的区域不涂水泥，以确保连接平滑且无阻碍。然后将头皮缝合覆盖在牙科水泥的隆起处，并在缝合后可使用Vet Bond粘合剂进行额外固定。最后，在缝合的皮肤及植入物基部周围涂抹局部镇痛药和抗生素，然后将小鼠放入笼中进行术后恢复。光纤植入物与耦合器的正确组装可使光源与目标区域光纤末端之间的光子损耗最小化。经过抛光的光纤应均匀地传输光，形成一个同心圆，如图中所示。通过精细的植入和缝合操作，该植入物不会对小鼠造成可见的刺激反应，并可在长期研究中保持稳定，且光纤性能或光传输量无明显下降。在清醒小鼠中进行的功能性行为检测显示，通过植入运动皮层上方的光纤进行刺激可引发直接反应，这一点由本体内电生理视频数据证实：数据显示通过植入光纤可激活特定神经元，并在脑刺激过程中观察到动物相应的行为反应。完成本操作后，可进一步开展其他方法，例如对特定脑区进行光刺激，以回答更多科学问题，例如：与靶细胞相关的神经环路连接模式是什么？观看本视频后，您应能充分了解如何组装光纤植入物和耦合导线，以及如何将它们植入表达光遗传学载体的脑组织上方。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

光纤植入慢性Optogenetic刺激脑组织

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一种用于光栓法脑卒中建模的整合方法 在体 内 行为小鼠中神经元和星形胶质细胞活动的光探针记录

了解光纤植入慢性光遗传学刺激技术，用于在清醒活动的小鼠中精确控制神经元活动并研究神经环路功能。该方法可最小化脑组织损伤，实现长期稳定的光刺激。

用于脑组织慢性光遗传学刺激的光纤植入

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