人乳房缩小成形术和乳房切除术组织的细胞培养处理

本方案旨在分离乳腺上皮部分，去除相关的乳腺间质细胞。首先对废弃的手术组织进行精细解剖，利用酶消化法富集上皮结构。随后将基底膜外的上皮类器官与间质成分分离。

然后将消化后的类器官通过固定孔径的细胞滤网过滤，以获得富集的组分。将类器官接种用于立即培养，或冻存以备后续使用。最终，上皮类器官可用于建立正常人乳腺上皮细胞的长期培养体系。

我于20世纪70年代末首次开发了该方法，旨在推动人类上皮细胞生物学及癌变研究领域的发展。当时可获得大量来自正常人体组织的外科废弃材料。所需的是，一种能够处理这种大量异质性材料的方法，使其适用于纯上皮细胞培养，以及支持长期生长的培养基。

该方法的可视化演示非常有帮助，特别是有助于了解如何进行粗略解剖。正确消化后的类器官应呈现何种形态？类器官的过滤及接种培养。

该技术的优势在于能够获得纯净的上皮细胞组分，同时使间质和上皮细胞保持完整。我们发现，类器官培养可获得最佳的初始生长效果，并最大化可获取的细胞数量。来自劳伦斯伯克利国家实验室的两位科学家 James Garvey 和 Mark LeBarge 将利用手术废弃材料演示这一操作流程。

在无菌容器中获取人乳腺组织，容器内含有缓冲液或添加抗生素的完全培养基，并将容器置于4摄氏度环境中。将组织切成小块，置于大型无菌玻璃培养皿中。分离上皮区域与脂肪组织、结缔组织及血管构成的间质基质。

轻轻剥离嵌在较黄的基质中的白色上皮条索。用镊子夹住组织，用手术刀刮除明显的脂肪组织。然后用两把相对的手术刀将上皮组织切成约四毫米大小的片段，以利于消化。

将解剖得到的上皮组织转移至50或15毫升的锥形离心管中。在纤维组织较多的样本中，会有更多的白色固体非上皮成分。如果难以从此类纤维基质中分离出上皮细胞。

可将组织切成1至3毫米见方的小块，并分别进行消化。用含有粗制胶原酶和高浓度透明质酸酶的消化液填充离心管，留出少量空气间隙，以便在旋转过程中混匀。消化完成后，在37摄氏度下于360度旋转仪上以8 RPM的转速孵育过夜。

将样品在600 G条件下离心5分钟以沉淀细胞。根据机构关于人体组织处理的指南，弃去上清液中的脂肪和培养基。为监测组织消化情况，取少量沉淀物悬浮于培养基中，稀释后进行显微镜检查，完全消化的类器官将显示出附着的间质组织。

重复进行酶消化，直至组织完全消化为纯净的类器官。如果需要第二次过夜消化，可能需要降低酶的浓度，以防止过度消化。消化适当的类器官将呈现出光滑的导管腺泡或导管腺泡结构，且无附着的间质组织。

消化完成后，将最终沉淀物重悬于含抗生素的培养基中。将消化后的样品通过一个无菌的100微米细胞筛，收集到无菌的50毫升离心管中。待培养基完全流入管中后，用3毫升培养基洗涤类器官。

重复操作，直到所有重悬的沉淀物全部转移。然后小心地将滤膜翻转至一个无菌管上，用更多培养基将类器官冲洗入管中。此为100微米类器官群体。

现在将流入原始50毫升离心管中的液体通过40微米滤网，以分离肺泡结构与含有单细胞、间充质和上皮细胞小团块以及小段血管组织的滤液。将100微米、40微米滤网截留物及滤液分别在600 ×g 条件下离心5分钟。每份样品用1毫升ccpm重悬。

每0.1毫升浓缩的腭组织使用两种冷冻保存液。置于4°C保存。小心加入0.1毫升的两种类器官悬液。

将液体逐滴均匀地滴加到一个或两个35毫米的培养皿中。在让类器官贴壁数分钟后，避免刮伤培养皿表面。添加生长培养基时应缓慢进行，以防止类器官脱落。

然后将原代培养物置于37摄氏度的湿润CO2培养箱中孵育。同时，取0.1毫升滤液池直接接种于含成纤维细胞培养基的组织培养塑料器皿中。将原代培养物在37摄氏度的湿润CO2培养箱中孵育。

培养 24 至 48 小时后，检查类器官是否有细胞迁移现象，2 至 3 天后监测有丝分裂形成的细胞克隆生长情况。细胞接近汇合时，每 2 至 3 天更换一次培养基。血管组织的小片段可能附着并产生成纤维细胞克隆生长。

在成纤维细胞大量生长的情况下，进行差异性胰蛋白酶消化，以去除大块上皮细胞区域中的成纤维细胞。用STE缓冲液洗涤细胞一次。

然后加入新鲜的 0.5 毫升 STE，同时在显微镜下持续观察，并将培养皿轻轻但迅速地敲击硬物表面，直至液体刚好覆盖培养皿底部。观察成纤维细胞是否脱落，而上皮细胞仍保持贴壁状态。当上皮细胞克隆区域接近汇合时，进行原代培养传代。

为了维持原代培养并产生多个继代培养物，使用部分胰蛋白酶消化法。用STE缓冲液洗涤细胞一次，然后加入新鲜STE缓冲液至刚好覆盖培养皿。观察并确保约50%的细胞已脱落。

然后加入含有生长培养基的2毫升血清并收集细胞。经过两次洗涤后，将细胞转移至无菌的15毫升离心管中。合并收集的细胞进行培养，从原代培养皿中可获得良好的细胞再生，传代或冻存的继代细胞可保持相当的长期生长能力，该部分化培养可重复4至8次。

建议将第一次部分胰蛋白酶消化所得的细胞冻存备用，并使用第二次胰蛋白酶消化获得的细胞进行传代培养。当组织被充分消化并过滤后，可见具有光滑边缘且无间质附着的类器官，呈现出导管和腺泡结构。若消化不足，则会有残留物质附着；若消化过度，则边缘粗糙，且类器官贴壁后的贴附效率会降低，并可能导致更多成纤维细胞污染。

上皮细胞向外生长在48至72小时开始，在48小时时出现。至72小时时尚未出现活跃的细胞分裂，有丝分裂尚不明显。此后有丝分裂应变得更为明显。

四天后，血管的小片段可成为间充质细胞生长的来源。此处上皮细胞生长表现出形态上的异质性群体，使用角蛋白14和角蛋白19抗体染色后，可见绿色的K19阳性管腔细胞系、红色的K14阳性肌上皮细胞系，以及黄色的K14阳性K19阳性祖细胞。HMEC可在不同培养基配方中进行培养。

添加了霍乱毒素和催产素的低应激培养基（如M 87 A）可支持正常静止前HMEC的优异长期生长，以及多种HMEC谱系的生长。单细胞分析结果展示了未培养类器官以及在M 87 A培养基中培养至第四代的HMEC的谱系多样性。在此，腔面细胞和肌上皮细胞群体分别通过腔面标志物EPCA和CD 2 27，以及肌上皮标志物CD 49 F和CD 10的表达进行鉴定。

第四代人乳腺上皮细胞（HMEC）。通过前一轮富集获得的具有腔细胞和肌上皮细胞标志物特征的细胞，其谱系通过针对角蛋白K14和K19的免疫荧光分析得以确认。在塑料培养皿中培养至第四代的HMEC，能够在适当的条件下形成具有类似体内腔细胞与肌上皮细胞谱系关系的有序结构。CD227和CD10可用于富集这两种谱系细胞。

HMCs 能够在微图案化的 3D 微孔中保持形成正确 3D 细胞结构的能力，其中腔面细胞位于肌上皮细胞内侧。经富集的前体细胞在 Matrigel 中培养时也能形成稳定的 3D 结构，模拟导管状和腺泡状结构。Matrigel 中的 3D 结构也表现出正确的 3D 自组织特性。

观看本视频后，您应能充分理解如何将乳腺上皮部分与相关的乳腺间质分离并进行纯化。掌握该技术后，整个操作可在两到三天内完成。组织处理技术总体上较为直接。

务必记住在适当的时机终止消化反应。