Name: 处理人减少乳房整形和乳房切除术的组织细胞培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-01-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: 了解从人乳腺手术废弃组织中分离上皮类器官并进行长期培养的方法。该技术通过酶解消化和细胞过滤实现上皮细胞与间质的分离，为研究正常乳腺上皮细胞生物学和致癌机制提供可靠的实验模型。

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MAL、JCG 和 MRS 得到美国国家衰老研究所（NIA）（资助号：R00AG033176 和 R01AG040081）以及美国能源部实验室主导研究与开发项目（合同号：DE-AC02-05CH11231）的支持。

1. 组织处理与消化
<ol>
	<li>从外科手术的废弃组织中获取人乳腺组织。缩乳手术可提供正常或良性细胞；纤维腺瘤和男性乳房发育组织可提供良性细胞；非肿瘤性乳房切除组织（肿瘤周围、对侧或皮下组织）可提供从正常、良性至可能含微小肿瘤的细胞。在获取废弃组织前，须确保已获得适当的机构审查委员会（IRB）批准。所有组织材料均应按照血液传播病原体的防控规定进行处理。</li>
	<li>将材料置于含有缓冲液或培养基的无菌容器中（例如 1:1 混合的DMEM培养基与Ham's F-12培养基，添加100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、5 μg/ml两性霉素B、50 U/ml多粘菌素B和10%胎牛血清，于4 °C运输至实验室。乳房缩小成形术组织可在4 °C保存或运输长达72小时，对后续细胞活力无明显影响。非缩小成形术的少量乳房组织可能需要更及时地处理。</li>
	<li>使用无菌手术刀、镊子和剪刀的组合，将脂肪组织、结缔组织和血管中的上皮区域与基质分离。用剪刀剪取组织碎片，并置于大型无菌玻璃培养皿中例如，150 mm）。用镊子夹住组织，手术刀刮除明显的脂肪组织，小心分离出呈白色条索状、嵌于较黄的间质基质中的上皮区域。为便于消化，使用相对的手术刀将上皮组织切成约3–4 mm的小块，放入50 ml离心管中。若处理的组织量较大，可能需要更换新的手术刀刀片。根据机构规定，将培养皿中的脂肪组织清除并妥善处理。
	<ol class="lalpha">
		<li>在富含纤维的组织中（例如，伴有严重纤维囊性病变的皮下乳房切除术），会有更多的实性白色非上皮组织。从这类纤维基质中分离上皮细胞可能较为困难。较大的纤维组织块可切割成面积约为1–3 mm²的小块，并分别进行消化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将解剖得到的上皮组织放入锥形离心管（50 ml 或 15 ml）中，组织体积不超过管容积的三分之一。用组织消化液（DME/F-12 或等效培养基，含 10 μg/ml 胰岛素、上述抗生素，以及终浓度为 10% FCS、200 U/ml 粗制胶原酶和 100 U/ml 透明质酸酶）加至接近满管体积，仅留少量气隙以利于旋转混合。</li>
	<li>将试管置于HulaMixer试管旋转仪上，于37 °C、8 rpm条件下360°旋转过夜。</li>
	<li>以 600 × g 离心 5 分钟。根据机构规定丢弃上清液中的脂肪和培养基。</li>
	<li>通过将少量沉淀物稀释于培养基中，检查消化是否完成。当显微镜下观察到细胞团块（类器官）具有表面光滑的导管状、腺泡状或导管-腺泡状结构，且无附着的间质组织时，表明消化已完成。图1A）。缩乳手术组织通常在过夜消化后仍会残留附着的基质，需要延长消化时间。
	<ol class="lalpha">
		<li>将未完全消化的沉淀物重悬于新鲜的组织消化液中，于37 °C旋转孵育4–12小时。重复步骤1.6和1.7。若消化仍不完全，再次向沉淀物中加入消化液，于37 °C旋转孵育过夜。为防止过夜消化过度，可降低酶的浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>消化完成后，于600 × g离心5分钟，吸除消化液，将沉淀物重悬于含抗生素的培养基中，每50 ml离心管加约15 ml，每15 ml离心管加5 ml。</li>
</ol>
2. 消化后材料的过滤与冷冻
<ol>
	<li>将重悬沉淀物的等分试样转移至置于无菌50 ml离心管上的无菌100 μm滤网中。让培养基流入离心管，然后用2–3 ml培养基在滤网上方重新冲洗类器官1–2次。重复此操作，直至所有重悬的沉淀物均被转移。如果滤网上类器官过多导致培养基无法顺利滤过，应为剩余材料更换新的滤网。小心地将滤网翻转至另一无菌离心管上方，并用更多培养基将类器官冲洗入管中。此即为100 μm类器官群体。</li>
	<li>取流入原始50 ml离心管中的材料，使用40 μm滤网重复步骤2.1的操作，以获得40 μm类器官群体，其中主要包含肺泡样结构。流入离心管中的滤过物构成滤液群体，其中含有单个细胞或小团的间充质细胞和上皮细胞，以及血管组织的小片段。</li>
	<li>在600 × g条件下离心5分钟，分别收集100 μm、40 μm及滤液群体的沉淀。</li>
	<li>吸除上清液，用CPM II培养基（DME/F-12或等效培养基，含44% FCS和6% DMSO）重悬各管沉淀物，每0.1 ml压紧沉淀物约使用1 ml CPM II。保持样品在4 °C环境中。</li>
	<li>通过将0.1 ml重悬物逐滴加入35 mm组织培养塑料培养皿中（操作同下文3.2），对两个类器官群体分别进行测试性接种。滤液群体可直接接种于含成纤维细胞培养基（DME/F-12或等效培养基，添加10 μg/ml胰岛素和10% FBS）的组织培养塑料表面。</li>
	<li>将剩余的重悬材料分装至Nunc型冷冻安瓿瓶中（每瓶1 ml或2 ml）。在-80 °C下过夜冷冻，随后立即转移至液氮中长期保存。自20世纪70年代末以来，我们储存的原始安瓿瓶未观察到明显的细胞活力下降。</li>
</ol>
3. 冻存类器官的接种与原代培养物的传代
<ol>
	<li>将含有类器官的冻存安瓿瓶在37 °C水浴中快速解冻。根据安瓿瓶中类器官数量的目测估计，将类器官接种至2至10个（通常约为6个）60 mm培养皿，或1至3个100 mm培养皿中。每个60 mm培养皿接种约20–40个类器官为最佳。</li>
	<li>解冻后的类器官使用1 ml移液器或巴斯德移液器逐滴小心地接种到培养皿表面，以实现类器官的均匀分布。类器官若放置过密，将因生长空间受限而导致传代或冻存时获得的细胞数量减少。操作时应避免刮伤培养皿表面（细胞通常难以在刮伤区域生长）。接种后静置1–2分钟，待类器官贴附，再缓慢加入生长培养基，以防类器官被冲起。例如 2-3 ml/60 mm 培养皿。在37 °C、湿润的CO₂培养箱中孵育。2 培养箱。这些是原代培养物。目前我们使用 M87A+oxytocin(X) 培养基以获得最理想的 HMEC 生长效果（图2).</li>
	<li>1天后，检查类器官是否已贴壁。添加额外培养基（例如 2-3 ml/60 mm 培养皿）。接种后24-48小时应可见类器官中的细胞迁移，48-72小时应可见有丝分裂形成的细胞增殖。图1B，C）。有时在24小时后附着效果较差，特别是当接种过度消化的类器官或来自年龄较大女性的类器官时，但大多数样本会在72小时内完成附着。血管组织的小碎片可能附着并产生成纤维细胞的外延生长（图1D).</li>
	<li>每周至少换液3次。根据接种密度的不同，细胞在M87A型培养基中培养5-8天可长至接近汇合。</li>
	<li>如果成纤维细胞生长显著，需要采用差异胰蛋白酶消化法（DT），该方法基于成纤维细胞比上皮细胞更快地从塑料表面脱落的特性来去除成纤维细胞。当上皮细胞集落变大时，吸除培养基，洗涤培养皿（例如，1-2 ml/60 mm 培养皿）加入 STE（生理盐水，0.05% 胰蛋白酶，0.02% EDTA），吸除液体，再加入新鲜的 0.5 ml STE，室温孵育约 1 分钟，并持续在显微镜下观察。当成纤维细胞开始脱落而上皮细胞仍贴壁时，轻轻但迅速地将培养皿侧面敲击硬物表面，使成纤维细胞脱落，随后立即吸除液体。用 PBS 洗涤一次，再次吸除。若培养物中成纤维细胞污染严重，可能需要额外进行一次 DT 处理。</li>
	<li>当出现较大的上皮细胞区域但尚未达到汇合时，对原代培养物进行传代。类器官接种密度和贴壁情况将影响所需时间。为了保留原代培养物并随时间推移产生多个继代培养物，我们采用部分胰酶消化法（Partial Trypsinizations, PT）。</li>
	<li>吸弃培养基，用1-2 ml STE洗涤60 mm培养皿，加入0.5 ml新鲜STE。室温下在显微镜下观察细胞脱落情况1-5分钟，轻敲培养皿以促进细胞脱落。当约50%的细胞脱落时，应终止消化。早期传代细胞通常脱落较快。对于后期传代细胞，可将培养皿置于37 °C以加速脱落，但需密切监测，因为所有细胞可能迅速脱落。</li>
	<li>向培养皿中加入2 ml含血清的培养基，用移液器反复吹打洗涤，然后转移至无菌15 ml离心管中。再用另外约1–2 ml培养基重复洗涤两次，将洗涤液一并加入该离心管中。为原代培养皿更换新鲜培养基，并放回培养箱继续培养。使用血细胞计数板对离心管中的细胞进行计数。原代细胞（primaries）通常可重复传代4至8次，期间原代培养皿中的细胞再生良好，且继代培养或冻存的二代细胞（secondaries；原代细胞经一次传代后即称为secondaries）具有相当的长期增殖能力。一旦原代培养物中类器官成分消失，继代培养的二代细胞其长期群体倍增潜能将逐渐下降。</li>
	<li>
	<ol class="lalpha">
		<li>继代培养至次级培养皿时，直接从试管中将细胞接种至培养皿中。接种量为1-2 x 105 在M87A+X等培养基中，每100 mm培养皿接种细胞，4–7天内可达到汇合。我们在第二代培养时向培养基中添加霍乱毒素以增强细胞增殖潜能；但在原代培养中不添加霍乱毒素，因其可导致类器官出现多层细胞生长。</li>
		<li>以600 × g离心5分钟收集细胞，重悬于CPMII中，终密度为106 细胞/ml。将重悬的细胞分装至Nunc型冻存安瓿瓶中，于-80 °C过夜冷冻，随后迅速转移至液氮中长期保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>建议将第一次传代培养（PT）的细胞冻存以备保存，使用第二次传代培养（PT）的细胞进行传代培养。后续的传代培养细胞可冻存，以供将来使用。</li>
</ol>

<ol><li>Prowse, K. R., Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+and+tissue-specific+regulation+of+mouse+telomerase+and+telomere+length%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Developmental and tissue-specific regulation of mouse telomerase and telomere length.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4818-4822 (1995).</li>
<li>Gil, J., Peters, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+INK4b-ARF-INK4a+tumour+suppressor+locus%3A+all+for+one+or+one+for+all%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of the INK4b-ARF-INK4a tumour suppressor locus: all for one or one for all.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 667-677 (2006).</li>
<li>Stampfer, M. R., Hallowes, R., Hackett, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Normal+Human+Mammary+Epithelial+Cells+in+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Growth of Normal Human Mammary Epithelial Cells in Culture.</a> In Vitro. 16, 415-425 (1980).</li>
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<li>Stampfer, M. R., Garbe, J., Nijjar, T., Wigington, D., Swisshelm, K., Yaswen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+p53+function+accelerates+acquisition+of+telomerase+activity+in+indefinite+lifespan+human+mammary+epithelial+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Loss of p53 function accelerates acquisition of telomerase activity in indefinite lifespan human mammary epithelial cell lines.</a> Oncogene. 22, 5238-5251 (2003).</li>
<li>Chin, K., Ortiz de Solorzano, C., Knowles, D., Jones, A., Chou, W., Rodriguez, E. G., Kuo, W. -L., Ljung, B. -M., Chew, K., Myambo, K., Miranda, M., Krig, S., Garbe, J., Stampfer, M., Yaswen, P., Gray, J. W., Lockett, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+analysis+of+genome+instability+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Gene%22%5BJournal%5D)">In situ analysis of genome instability in breast cancer.</a> Nat Gene. 36, 984-988 (2004).</li>
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<li>Garbe, J. C., Holst, C. R., Bassett, E., Tlsty, T., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+p53+function+in+cultured+human+mammary+epithelial+cells+turns+the+telomere-length+dependent+senescence+barrier+from+agonescence+into+crisis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Inactivation of p53 function in cultured human mammary epithelial cells turns the telomere-length dependent senescence barrier from agonescence into crisis.</a> Cell Cycle. 6, 1927-1936 (2007).</li>
<li>Novak, P., Jensen, T. J., Garbe, J. C., Stampfer, M. R., Futscher, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Step-wise+DNA+methylation+changes+are+linked+to+escape+from+defined+proliferation+barriers+and+mammary+epithelial+cell+immortalization%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Step-wise DNA methylation changes are linked to escape from defined proliferation barriers and mammary epithelial cell immortalization.</a> Cancer Res. 69, 5251-5258 (2009).</li>
<li>Vrba, L., Garbe, J. C., Stampfer, M. R., Futscher, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+regulation+of+normal+human+mammary+cell+type+specific+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genom+Res%22%5BJournal%5D)">Epigenetic regulation of normal human mammary cell type specific miRNAs.</a> Genom Res. 21, 2026-2037 (2011).</li>
<li>LaBarge, M. A., Nelson, C. M., Villadsen, R., Fridriksdottir, A., Ruth, J. R., Stampfer, M. R., Petersen, O. W., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mammary+progenitor+cell+fate+decisions+are+products+of+interactions+with+combinatorial+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Human mammary progenitor cell fate decisions are products of interactions with combinatorial microenvironments.</a> Integr. Biol. 1, 70-79 (2009).</li>
<li>Garbe, J. C., Pepin, F., Pelissier, F., Sputova, K., Fridriksdottir, A. J., Guo, D. E., Villadsen, R., Park, M., Petersen, O. W., Barowsky, A., Stampfer, M. R., Labarge, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+multipotent+progenitors+with+a+basal+differentiation+bias+during+aging+of+human+mammary+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Accumulation of multipotent progenitors with a basal differentiation bias during aging of human mammary epithelia.</a> Cancer Res. 72, 3687-3701 (2012).</li>
<li>Hammond, S. L., Ham, R. G., Stampfer, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum-free+growth+of+human+mammary+epithelial+cells%3A+rapid+clonal+growth+in+defined+medium+and+extended+serial+passage+with+pituitary+extract%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Serum-free growth of human mammary epithelial cells: rapid clonal growth in defined medium and extended serial passage with pituitary extract.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 5435-5439 (1984).</li>
</ol>

无利益冲突声明。

本文介绍的人类乳腺组织处理方法能够从人类乳腺中多种细胞类型的异质混合物中分离出纯净的乳腺上皮细胞。通过固定孔径的过滤可实现乳腺不同组分的分离。例如，导管型和导管-腺泡型与腺泡型）从消化后的基质中分离出来。可获得与上皮细胞匹配的同基因型乳腺成纤维细胞。消化后冷冻保存的组织材料在超过30年的时间里仍保持良好的活力。该方法对除极纤维化的乳腺组织外的所有组织均能成功应用，且操作简便。其他乳腺组织处理方法虽有报道，但所获得的上皮细胞组分在活力、纯度或分离效果方面均不及本法。将处理后的类器官置于低应激诱导培养基（如M87A）中培养，可实现人乳腺上皮细胞（HMEC）的长期生长，并表达多种谱系标志物。在塑料培养皿上培养的HMEC仍保留形成具有正常结构的三维结构的能力 在体-样的谱系关系。这些HMEC培养物适用于对正常HMEC行为及其可能促进或抑制衰老和转化的因素进行广泛的实验研究，包括高通量分析。

<table><tbody><tr><td>15 cm 玻璃培养皿</td><td>VWR</td><td>89000-308</td><td></td></tr><tr><td>6.5&quot; 剪刀</td><td>VWR</td><td>82027-594</td><td></td></tr><tr><td>8&quot; 镊子</td><td>VWR</td><td>82027-436</td><td></td></tr><tr><td>一次性手术刀</td><td>Miltex</td><td>4-411</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶</td><td>SIGMA</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>透明质酸酶</td><td>SIGMA</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>胰岛素</td><td>SIGMA</td><td>I5500</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>SIGMA</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>制霉菌素</td><td>Life Technologies</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>硫酸多粘菌素B</td><td>Life Technologies</td><td>21850-029</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Life Technologies</td><td>26140-087</td><td></td></tr><tr><td>0.05% 胰蛋白酶，100 ml</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11039-021</td><td></td></tr><tr><td>HulaMixer</td><td>Life Technologies</td><td>159-20D</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m 细胞筛</td><td>BD Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m 细胞筛</td><td>BD Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 离心管</td><td>Greiner bio-one</td><td>188-261</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 离心管</td><td>Greiner bio-one</td><td>227-261</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 组织培养皿</td><td>Greiner bio-one</td><td>664-160</td><td></td></tr><tr><td>6 cm 组织培养皿</td><td>Greiner bio-one</td><td>628-160</td><td></td></tr><tr><td>冻存管</td><td>Nalgene</td><td>5000-1020</td><td></td></tr><tr><td>血细胞计数板</td><td>Hauser Scientific</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>离心机</td><td>Eppendorf 型号</td><td>5702</td><td></td></tr></tbody></table>

人乳房缩小成形术和乳房切除术组织的细胞培养处理

Processing of Human Reduction Mammoplasty and Mastectomy Tissues for Cell Culture

通过实验研究正常人乳腺上皮细胞（HMEC）的行为及其正常细胞如何获得异常特性的过程，可得以促进 体外 能够更精确地模拟的培养系统 体内 生物学。利用人类来源的材料研究细胞分化、衰老、衰老相关过程及永生化具有显著优势，因为人类细胞与常用啮齿类动物细胞在这些特性的分子层面存在诸多显著差异1-2乳腺细胞是一个便捷的模型系统，因为缩乳手术和乳房切除手术较为常见，可获得大量正常及异常组织。
乳腺由多种不同类型的细胞复杂混合而成，例如，上皮细胞、脂肪细胞、间充质细胞和内皮细胞。其中，上皮细胞负责乳腺特化的泌乳功能，同时也是绝大多数人类乳腺癌的起源。我们已建立方法，可将乳腺手术废弃组织处理为纯化的上皮组分以及间充质细胞3。处理后的材料可长期冷冻保存，也可直接用于原代培养。手术废弃组织被运送至实验室后，通过手工解剖富集含上皮细胞的组织。随后使用胶原酶和透明质酸酶消化解剖所得组织，从而在基底膜处将间质成分从上皮结构中剥离。所得的上皮树状小片段（类器官）可通过固定孔径的滤膜依次过滤，与消化后的间质成分分离。根据滤膜孔径的不同，可获得包含较大导管/腺泡片段、较小腺泡簇或间充质细胞的不同组分。我们发现，将类器官而非解离的单个细胞作为起始材料进行培养时，细胞生长效果更佳。采用低应激诱导培养基进行类器官培养，可支持正常人乳腺上皮细胞（HMEC）的长期生长，并表达多种谱系类型的标志物（肌上皮细胞、腔面细胞、前体细胞）4-5。从单一个体组织中即可获得足够数量的细胞，从而允许使用标准化的细胞批次进行广泛的实验分析，也可用于高通量检测手段的研究。
培养的HMEC已被广泛应用于多种研究中，以探讨调控正常生长、分化、衰老和细胞衰老过程的机制，以及这些正常过程在永生化和恶性转化过程中如何发生改变4-15,16。可在存在细胞外基质成分、其他细胞类型和/或三维培养条件下观察其生长效应，并与在塑料培养皿上的生长情况进行比较5,15。从正常细胞开始培养的HMEC为研究可能促进或抑制人类衰老及癌变的因素提供了一个实验上易于操作的体系。

组织经适当消化形成类器官并接种培养后的代表性图像见图1。消化不完全的组织可见外部仍附着未消化的物质，且在原代培养中可能伴随成纤维细胞的生长，需通过DT处理去除。消化过度的组织表面边界较不光滑，在原代培养中贴壁时间可能延长。上皮细胞出芽通常在48–72小时内开始（图1B,C）。血管组织的小片段（图1D）可能成为间充质细胞出芽的来源。上皮细胞出芽群体在形态上具有异质性，包含表达肌上皮、前体细胞及腔面细胞谱系标志物的增殖性细胞混合群体（图1E, 3C-E）。使用低应激培养基（如添加霍乱毒素和催产素的M87A培养基）培养正常静止前期HMEC，其长期生长能力优于以往的培养基配方（图2）。M87A类培养基亦可支持腔面细胞和前体细胞传代至第4–8代（图3C-E, 4）；此后，大多数细胞仅表达肌上皮谱系标志物。在塑料培养皿上培养的HMEC仍具备在微图案化三维微孔中形成正确的三维自组织结构的能力，其中腔面细胞位于内部，肌上皮细胞位于外层（图4A,B），并在Matrigel中接种时形成有序结构（图4C,D）。
<img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig1.jpg" alt="细胞形态学分析；显微镜图像 A-D，免疫荧光染色 E（K14、K19、DAPI 染色）。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
 图1. HMEC 类器官与原代培养。 （A）经消化和过滤后显示导管-腺泡结构的类器官。（B, C）接种至原代培养2天后显示导管和腺泡结构的类器官；注意细胞开始向外生长（白色箭头）。（D）来自与B、C相同培养物的小血管附着，并伴有成纤维细胞的初始外延生长。（E）原代类器官培养4天后的上皮细胞外延生长。通过K14（红色）和K19（绿色）抗体染色鉴定细胞谱系；细胞核用DAPI（蓝色）染色。可见管腔细胞（K14⁻/K19⁺，绿色）、肌上皮细胞（K14⁺/K19⁻，红色）以及前体细胞（K14⁺/K19⁺，黄色）。由于抗体渗透不完全，在类器官核心区域可观察到未染色细胞。
<img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig2.jpg" alt="细胞生长分析图表；群体倍增数 vs. 传代后天数；不同培养基比较；研究数据。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图 2"> 
 图 2. 不同培养基配方中 HMEC 培养物的生长情况。 来自同一个体（标本 184）的类器官在原代培养中使用了不同的培养基配方进行起始培养。使用我们最新的配方 M87A+oxytocin(X)4 可获得最佳的长期生长效果。该培养基还能支持多种 HMEC 系谱的生长（见图 1E）。早期的培养基配方 MM3 支持的生长效果较弱，而无血清培养基 MCDB170（商业 MEGM）17 会迅速诱导细胞周期依赖性激酶抑制因子 p16INK4A 的表达，并导致异常细胞被选择性扩增7,11,13。
<img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3.jpg" alt="Flow cytometry scatter plots for cell type identification using EpCAM, CD49f, CD227, CD10 markers." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
 图3. 未培养类器官与培养的HMEC在4代时谱系多样性的比较th 传代 (A, B) 对未经培养、经酶解离的类器官进行流式细胞术分析，(A) 检测EpCAM和CD49f/alpha 6整合素的表达，(B) 检测CD227/Muc1和CD10/CALLA的表达。(C, D) 对4th 静止期前 HMEC 中 (C) EpCAM 和 CD49f/α6 整合素，以及 (D) CD227/Muc1 和 CD10/CALLA 的表达。可识别的细胞群标记为 LEP（表达腔面细胞标志物 EpCAM 或 CD227）、MEP（表达肌上皮细胞标志物 CD49f 或 CD10）或 PROG（富集于 CD49f+/EpCAM+ 群体）。需注意，与未培养的类器官相比，HMEC 在适应培养过程中 EpCAM 和 CD49f 的调控发生变化。(E) 未经分选的 HMEC 及经 FACS 富集的 LEP 和 MEP 在 4th 经免疫荧光染色以检测角蛋白K14（MEP标志物）和K19（LEP标志物），用于验证谱系鉴定。DAPI染色的细胞核呈蓝色。
<img src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4.jpg" alt="Flow cytometry, cell growth, and immunofluorescence: CD10/CD227, LEP/MEP markers, time-lapse, microscopy." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50011/50011fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
 图4. 培养的HMEC能够形成有序结构 体内-样谱系关系，当置于适当的微环境时。 （A）稳态前 4th 经FACS使用CD227和CD10标记物将HMEC传代细胞富集为管腔型LEP和肌上皮型MEP谱系，这些谱系通过K14和K19的表达得以验证（未显示）。(B) 当在微图案化微孔中混合培养时，这些细胞能够自组织形成双层结构，其中MEP位于外层，LEP位于内层［改编自Chanson 等.5]. 添加至微孔后0小时、24小时和48小时，使用共聚焦显微镜对荧光标记的LEP（绿色）和MEP（红色）进行成像（上图）。对照组HMEC随机标记红色或绿色荧光（下图）。（C）FACS富集的祖细胞（cKit+）在三维（Matrigel）培养中接种并培养18天后的明场图像。形成的结构可表现出腺泡形态发生。（D）从Matrigel中提取的结构经染色检测K14和K19；细胞核用DAPI复染。免疫荧光分析显示结构有序，具有正确的管腔和基底极性。

本文描述了一种处理人类乳腺手术废弃组织的方法。经过处理的组织以类器官形式存在，可无限期冷冻保存，也可用于长期培养。该方法可用于对正常人类上皮细胞生物学特性以及外源性干扰因素的影响进行实验研究。

正常人乳腺上皮细胞（HMEC）行为的实验研究，以及正常细胞如何获得异常特性的机制，可通过以下方法得以促进……

本方案旨在分离乳腺上皮部分，去除相关的乳腺间质细胞。首先对废弃的手术组织进行精细解剖，利用酶消化法富集上皮结构。随后将基底膜外的上皮类器官与间质成分分离。然后将消化后的类器官通过固定孔径的细胞滤网过滤，以获得富集的组分。将类器官接种用于立即培养，或冻存以备后续使用。最终，上皮类器官可用于建立正常人乳腺上皮细胞的长期培养体系。我于20世纪70年代末首次开发了该方法，旨在推动人类上皮细胞生物学及癌变研究领域的发展。当时可获得大量来自正常人体组织的外科废弃材料。所需的是，一种能够处理这种大量异质性材料的方法，使其适用于纯上皮细胞培养，以及支持长期生长的培养基。该方法的可视化演示非常有帮助，特别是有助于了解如何进行粗略解剖。正确消化后的类器官应呈现何种形态？类器官的过滤及接种培养。该技术的优势在于能够获得纯净的上皮细胞组分，同时使间质和上皮细胞保持完整。我们发现，类器官培养可获得最佳的初始生长效果，并最大化可获取的细胞数量。来自劳伦斯伯克利国家实验室的两位科学家 James Garvey 和 Mark LeBarge 将利用手术废弃材料演示这一操作流程。在无菌容器中获取人乳腺组织，容器内含有缓冲液或添加抗生素的完全培养基，并将容器置于4摄氏度环境中。将组织切成小块，置于大型无菌玻璃培养皿中。分离上皮区域与脂肪组织、结缔组织及血管构成的间质基质。轻轻剥离嵌在较黄的基质中的白色上皮条索。用镊子夹住组织，用手术刀刮除明显的脂肪组织。然后用两把相对的手术刀将上皮组织切成约四毫米大小的片段，以利于消化。将解剖得到的上皮组织转移至50或15毫升的锥形离心管中。在纤维组织较多的样本中，会有更多的白色固体非上皮成分。如果难以从此类纤维基质中分离出上皮细胞。可将组织切成1至3毫米见方的小块，并分别进行消化。用含有粗制胶原酶和高浓度透明质酸酶的消化液填充离心管，留出少量空气间隙，以便在旋转过程中混匀。消化完成后，在37摄氏度下于360度旋转仪上以8 RPM的转速孵育过夜。将样品在600 G条件下离心5分钟以沉淀细胞。根据机构关于人体组织处理的指南，弃去上清液中的脂肪和培养基。为监测组织消化情况，取少量沉淀物悬浮于培养基中，稀释后进行显微镜检查，完全消化的类器官将显示出附着的间质组织。重复进行酶消化，直至组织完全消化为纯净的类器官。如果需要第二次过夜消化，可能需要降低酶的浓度，以防止过度消化。消化适当的类器官将呈现出光滑的导管腺泡或导管腺泡结构，且无附着的间质组织。消化完成后，将最终沉淀物重悬于含抗生素的培养基中。将消化后的样品通过一个无菌的100微米细胞筛，收集到无菌的50毫升离心管中。待培养基完全流入管中后，用3毫升培养基洗涤类器官。重复操作，直到所有重悬的沉淀物全部转移。然后小心地将滤膜翻转至一个无菌管上，用更多培养基将类器官冲洗入管中。此为100微米类器官群体。现在将流入原始50毫升离心管中的液体通过40微米滤网，以分离肺泡结构与含有单细胞、间充质和上皮细胞小团块以及小段血管组织的滤液。将100微米、40微米滤网截留物及滤液分别在600 ×g 条件下离心5分钟。每份样品用1毫升ccpm重悬。每0.1毫升浓缩的腭组织使用两种冷冻保存液。置于4°C保存。小心加入0.1毫升的两种类器官悬液。将液体逐滴均匀地滴加到一个或两个35毫米的培养皿中。在让类器官贴壁数分钟后，避免刮伤培养皿表面。添加生长培养基时应缓慢进行，以防止类器官脱落。然后将原代培养物置于37摄氏度的湿润CO2培养箱中孵育。同时，取0.1毫升滤液池直接接种于含成纤维细胞培养基的组织培养塑料器皿中。将原代培养物在37摄氏度的湿润CO2培养箱中孵育。培养 24 至 48 小时后，检查类器官是否有细胞迁移现象，2 至 3 天后监测有丝分裂形成的细胞克隆生长情况。细胞接近汇合时，每 2 至 3 天更换一次培养基。血管组织的小片段可能附着并产生成纤维细胞克隆生长。在成纤维细胞大量生长的情况下，进行差异性胰蛋白酶消化，以去除大块上皮细胞区域中的成纤维细胞。用STE缓冲液洗涤细胞一次。然后加入新鲜的 0.5 毫升 STE，同时在显微镜下持续观察，并将培养皿轻轻但迅速地敲击硬物表面，直至液体刚好覆盖培养皿底部。观察成纤维细胞是否脱落，而上皮细胞仍保持贴壁状态。当上皮细胞克隆区域接近汇合时，进行原代培养传代。为了维持原代培养并产生多个继代培养物，使用部分胰蛋白酶消化法。用STE缓冲液洗涤细胞一次，然后加入新鲜STE缓冲液至刚好覆盖培养皿。观察并确保约50%的细胞已脱落。然后加入含有生长培养基的2毫升血清并收集细胞。经过两次洗涤后，将细胞转移至无菌的15毫升离心管中。合并收集的细胞进行培养，从原代培养皿中可获得良好的细胞再生，传代或冻存的继代细胞可保持相当的长期生长能力，该部分化培养可重复4至8次。建议将第一次部分胰蛋白酶消化所得的细胞冻存备用，并使用第二次胰蛋白酶消化获得的细胞进行传代培养。当组织被充分消化并过滤后，可见具有光滑边缘且无间质附着的类器官，呈现出导管和腺泡结构。若消化不足，则会有残留物质附着；若消化过度，则边缘粗糙，且类器官贴壁后的贴附效率会降低，并可能导致更多成纤维细胞污染。上皮细胞向外生长在48至72小时开始，在48小时时出现。至72小时时尚未出现活跃的细胞分裂，有丝分裂尚不明显。此后有丝分裂应变得更为明显。四天后，血管的小片段可成为间充质细胞生长的来源。此处上皮细胞生长表现出形态上的异质性群体，使用角蛋白14和角蛋白19抗体染色后，可见绿色的K19阳性管腔细胞系、红色的K14阳性肌上皮细胞系，以及黄色的K14阳性K19阳性祖细胞。HMEC可在不同培养基配方中进行培养。添加了霍乱毒素和催产素的低应激培养基（如M 87 A）可支持正常静止前HMEC的优异长期生长，以及多种HMEC谱系的生长。单细胞分析结果展示了未培养类器官以及在M 87 A培养基中培养至第四代的HMEC的谱系多样性。在此，腔面细胞和肌上皮细胞群体分别通过腔面标志物EPCA和CD 2 27，以及肌上皮标志物CD 49 F和CD 10的表达进行鉴定。第四代人乳腺上皮细胞（HMEC）。通过前一轮富集获得的具有腔细胞和肌上皮细胞标志物特征的细胞，其谱系通过针对角蛋白K14和K19的免疫荧光分析得以确认。在塑料培养皿中培养至第四代的HMEC，能够在适当的条件下形成具有类似体内腔细胞与肌上皮细胞谱系关系的有序结构。CD227和CD10可用于富集这两种谱系细胞。HMCs 能够在微图案化的 3D 微孔中保持形成正确 3D 细胞结构的能力，其中腔面细胞位于肌上皮细胞内侧。经富集的前体细胞在 Matrigel 中培养时也能形成稳定的 3D 结构，模拟导管状和腺泡状结构。Matrigel 中的 3D 结构也表现出正确的 3D 自组织特性。观看本视频后，您应能充分理解如何将乳腺上皮部分与相关的乳腺间质分离并进行纯化。掌握该技术后，整个操作可在两到三天内完成。组织处理技术总体上较为直接。务必记住在适当的时机终止消化反应。

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