分析沿生长轴突的小鼠许旺细胞发育

以下实验的目的是分析施万细胞在其天然生境——生长中的轴突沿线的发育过程。该目标通过以下步骤实现：首先将小鼠胚胎的颈上神经节（superior cervical ganglia，SCG）接种到胶原基质上，作为第二步，用神经生长因子（nerve growth factor，NGF）处理SCG，从而促进SCG神经元以放射状方式长出轴突。

除了来自 X 外植体的轴突生长外，还可以观察到内源性施万细胞沿着延伸的轴突向周围迁移。施万细胞的发育可通过延时成像以及对固定组织的终点分析进行观察，后者可实现距离测量。与现有的方法（如划痕迁移实验）相比，该技术的主要优势在于包含了施万细胞的天然微环境。

该方法的可视化演示至关重要，因为胶原蛋白支架的正确组装以及sgs的正确解剖是实验成功的关键。这些步骤并不特别难以掌握。

他们首先需要练习。在超净台中操作时，应将所有溶液置于冰上以满足我们的实验条件。按照书面实验方案中的说明，配制储备培养基和大鼠尾胶原蛋白。

将800 µL大鼠尾尾胶原与210 µL储备培养基混合。混合时避免产生气泡，溶液应保持红色。如果溶液变为黄色，则说明大鼠尾胶原溶液酸性过强，需重新配制，并使用更高浓度的氢氧化钠。将100 µL该溶液加入多孔载玻片的每孔中，确保每个孔的底部完全覆盖。

将培养皿放入设定为37摄氏度、5%二氧化碳的加湿组织培养孵箱中孵育两小时。收获后，将E16至E18期胚胎置于含有PBS的培养皿中，从羊膜中解剖出来，并在锁骨水平处断头。随后将头颈部区域转移至硅胶底培养皿中，在体视显微镜下观察，使用昆虫针在下颌下区和锁骨区固定组织。

现在使用镊子去除下颌下区域的皮肤和皮下组织。然后移除下颌下唾液腺，以暴露舌骨上肌、舌骨下肌和胸锁乳突肌。接下来，使用镊子小心地去除舌骨下肌和胸锁乳突肌，以暴露喉和气管。

用镊子夹住气管，将气管和喉部提起并取出。一旦移除喉和气管，即可看到位于椎前肌两侧的颈总动脉。颈上神经节位于颈总动脉分叉处，呈椭圆形，可据此辨认。

使用镊子和装有昆虫针的持针器摘除颈上神经节，并将其放入含有 PBS 的新培养皿中，然后解剖去除神经节上的任何血管或连接组织。借助注射器针头，从培养箱中取出凝胶化的胶原凝胶，并使用安装在注射器上的注射器针头将神经节转移至凝胶上。将组织外植体置于设定为 37 摄氏度、5% 二氧化碳及湿润条件的组织培养箱中孵育一至两小时。

孵育一至两小时后，从组织培养孵育箱中取出颈上神经节外植体，向每个外植体中加入100微升含有B27添加剂、谷氨酰胺和抗生素的Neurobasal培养基。随后，再向孔中加入200微升含有60纳克/毫升NGF的Neurobasal培养基，以促进轴突生长。

此时也可加入待测物质，以研究其对已开始迁移的雪旺细胞的影响，此时间点定义为体外培养第0天。在体外培养第3天，可通过移除180微升现有培养基，并替换为200微升含有目标物质及神经生长因子（NGF）的培养基（其终浓度为双倍浓度）来施加待测物质。时间推移成像采用倒置显微镜系统进行，该系统可同时支持细胞培养孵育与时间推移成像，以便比较不同待测物质的作用。在一项实验中，建议在实验终点采用多点位设置。

用4% PFA将外植体在培养载玻片上固定3至4小时后，用PBS洗涤，随后进行免疫组织化学染色以验证X外植体。用含10%正常驴血清和2% Triton X-100的PBS溶液封闭组织2小时。随后在封闭液中加入一抗，4℃孵育过夜。次日一抗孵育结束后，将含有X外植体的凝胶经PBS洗涤后转移至24孔板中，加入荧光标记的二抗避光孵育2小时，再用PBS洗涤，最后加入DAPI溶液孵育10分钟。

经过多次洗涤后，将含有X explant的胶原凝胶置于显微镜载玻片上，干燥载玻片，随后用封片剂封片。使用标准荧光显微镜获取图像，用于后续定量分析。若显微镜软件具备记录元数据的功能，则更为有利。

可使用 Fiji 或 ImageJ 软件对获得的图像进行定量分析，这些软件可免费用于科学研究。本视频展示了体外培养四天内脊髓背根神经节 EXPLAN 的轴突生长过程。可在体外培养的第四天进行免疫组织化学染色，以清晰鉴定移植的神经节。

作为交感神经节，可以观察到许旺细胞沿着轴突迁移，从颈上神经节向周围移动。本视频展示了与前述相同的迁移模式，但放大倍数更高。通过使用DPI对细胞核进行复染，可轻松测量迁移距离：在多个位置测量前沿许旺细胞的细胞核与外植的颈上神经节（SCG）边缘之间的距离，如示意图及体外培养四天的DPI标记、NGF处理样本图像所示，本影片展示了SCG外植体边缘处许旺细胞的迁移情况。

明场与荧光成像的结合可实现对 S100 GFP 阳性施万细胞及其轴突的可视化观察。最后，本视频展示了离体 superior cervical ganglion 边缘施万细胞的迁移过程。此处仅显示荧光通道，以便更清晰地观察 S100 GFP 阳性施万细胞。

按照此方案，可进一步进行其他定量分析，例如单细胞增殖的定量分析或单细胞凋亡的定量分析。当然，为进行终点分析，需开展适当的免疫组织化学实验，或使用特定的转基因动物，以在活体环境中展示相关效应。