Name: 分析小鼠沿着轴突生长的雪旺氏细胞发展 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: 学习利用小鼠胚胎颈上神经节外植体培养技术，观察雪旺氏细胞沿轴突迁移的自然发育过程。该方法结合胶原基质与神经生长因子处理，通过延时成像和终点分析定量测量迁移距离，为周围神经再生研究提供更接近生理环境的实验模型。

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我们感谢Urmas Arumae分享胶原蛋白实验方案，感谢Jutta Fey和Ursula Hinz提供的出色技术支持。此外，我们感谢Christian F. Ackermann、Ulrike Engel以及海德堡大学尼康影像中心，同时也感谢Joachim Kirsch在视频拍摄过程中给予的热心帮助。本工作部分由德国研究基金会（SFB 592）资助。

1. 胶原凝胶的制备
<ol>
 <li>制备一种储存培养基，其中包含 455 μl 10x MEM、112 μl 7.5% NaHCO3、50 μl 谷氨酰胺和 NaOH。NaOH 的浓度和用量取决于大鼠尾部胶原的制备情况（见 1.2），储存培养基的最终体积为 1,000 μl。</li>
 <li>根据 Ebendal（1）的方法制备大鼠尾部胶原。将胶原溶液在 4 °C 下保存。未观察到胶原溶液发生降解。每次制备新批次时，需评估储存培养基所需的 NaOH 浓度（见 1.1）。使用培养基的 pH 指示剂来滴定 NaOH 的用量和浓度。800 μl 酸性大鼠尾部胶原与 210 μl 储存培养基混合后应呈现红色。若 NaOH 浓度过低，由于培养基中的 pH 指示剂作用，胶原溶液将变为黄色。将胶原加入培养基中并混匀，避免产生气泡。以上操作均需在冰上进行。胶原溶液与储存培养基混合后，在 37 °C 下孵育，聚合反应在 2 小时内完成。实验开始前应先进行测试。1.3) 将 800 μl 胶原溶液与 210 μl 储存培养基混合（见 1.2）。取 100 μl 该混合液加入 8 孔培养板的孔中。将培养板置于细胞培养孵箱中，在 37 °C、5% CO2 及湿润条件下孵育。胶原凝胶的制备应在细胞培养操作台内无菌条件下完成。胶原凝胶在 2 小时内完成凝固。</li>
</ol>
2. 胚胎颈上神经节的解剖
<ol>
 <li>从子宫中收获妊娠时间点为 E16-18 的小鼠胚胎，并将其保存在 PBS 中，待后续使用。</li>
 <li>从羊膜中分离一个胚胎，于锁骨水平以下切断头部。使用“昆虫针”将头部固定在硅胶底培养皿上，使头部腹侧朝向操作者，以便观察下颌下区域。固定有助于更方便地进行解剖。</li>
 <li>去除左右两侧下颌下区域的皮肤及其下方的皮下结缔组织。</li>
 <li>将下颌下唾液腺从原位移除，以暴露舌骨、舌骨下肌群及胸锁乳突肌。</li>
 <li>小心去除这些肌肉，以充分暴露喉部和气管。随后移除气管和喉部，此时可在两侧椎前肌上观察到颈动脉。颈动脉节位于颈动脉分叉处，呈椭圆形。小心分离神经节并将其置于 PBS 中；若神经节粘附于解剖工具，应轻柔取下。建议使用镊子以及装有“昆虫针”的持针器进行颈上神经节的分离操作。</li>
 <li>将神经节置于 PBS 中，室温保存，直至收集足够数量。随后在层流罩内的解剖显微镜下，清除神经节上的血管和结缔组织。</li>
 <li>最后，借助安装在注射器上的针头，将分离出的神经节更方便地转移至明胶包被的胶原凝胶上。</li>
 <li>将神经节外植体置于细胞培养孵箱中，在 37 °C、5 % CO2 及湿润条件下，在明胶包被的胶原凝胶上进行培养。</li>
</ol>
3. 背根神经节外植体的处理
<ol>
 <li>孵育1-2小时后，向含有胶原的SCG外植体中加入100 μl含有B27添加剂、谷氨酰胺和抗生素的Neurobasal细胞培养基。此时，腔室载玻片的每个孔中含有200 μl液体（100 μl凝胶和100 μl培养基）。再加入200 μl培养基，但此次培养基中含有NGF（60 ng/ml），以促进轴突生长。因此，NGF的最终浓度为30 ng/ml。</li>
 <li>
 <ol class="lalpha">
 <li>为了研究脊索细胞迁移的起始，在第几天直接添加额外因子 体外 0（DIV0）。将因子溶解于含神经生长因子（NGF）的培养基中，使其浓度为所需浓度的两倍（2).</li>
 <li>为了分析对已开始沿轴突迁移的施万细胞（SCs）的影响，可在体外培养第3天（DIV3）至第4天（DIV4）期间（实验可能终止的时间点）加入额外因子。具体操作为：在DIV3时小心移除180 μl培养液，随后加入200 μl含有神经生长因子（NGF）及目标额外因子的新鲜培养基，其中NGF和额外因子的浓度均为原浓度的两倍。2).</li>
 </ol>
 </li>
</ol>
4. 时间序列成像
使用倒置显微镜进行分析。可使用不同的物镜，以确定视野范围和放大倍数。然而，一个重要因素是所用物镜的工作距离，因为 SCG 外植体的成像需透过玻片和胶原凝胶进行。1/10 至 30 分钟的记录帧率效果良好（2）。但该参数需根据具体科学问题进行调整。图像采集可使用普通的 CCD 相机。进行延时成像时，需在显微镜载物台上安装细胞培养孵育腔。成像过程中，将组织置于 37 °C、5% CO2 及湿润条件下孵育。在开始成像前一小时启动孵育系统，使显微镜部件（例如 物镜）以及腔室载玻片均达到设定温度，防止温度变化引起的漂移。利用显微镜软件和软件控制的电动载物台（多点位设置），定义特定的分析区域（同一外植体内部及不同外植体之间），以便同时分析施加于 SCG 外植体的不同实验条件。延时成像可使用野生型组织，也可使用转基因动物的组织，后者可通过 SC 标记（s100b:GFP）进行识别（3）。若需对荧光染料成像，显微镜系统中须配备荧光光源，并使用标准滤光片。
5. 神经嵴细胞迁移距离的定量分析
<ol>
 <li>在终点（例如 DIV4），用 4% 多聚甲醛在腔室载玻片中固定胶原凝胶，固定时间为 3–4 小时。随后用 PBS 洗涤胶原凝胶 5 次，每次 10 分钟。按照标准流程进行免疫细胞化学染色（2）。如果您初次制备 SCG，建议通过酪氨酸羟化酶（TH）免疫组织化学染色验证神经节的身份，TH 是儿茶酚胺能细胞的常用标志物。在免疫组织化学染色过程中（一抗孵育后），将含有胶原凝胶的组织块转移至 24 孔板中，因其容积更大，有利于充分洗涤凝胶。</li>
 <li>免疫组织化学染色完成后，小心地将胶原凝胶置于玻璃载片上。轻轻去除残留液体，使胶原凝胶自然干燥并二维收缩。此步骤有助于准确测量迁移距离（2）。随后对样品进行封片处理。</li>
 <li>最后，使用 Fiji（NIH）软件测量迁移距离。此过程无需特殊插件。为确保以 μm 为单位进行准确测量，请检查图像的元数据以及 Fiji 中“图像”→“设定比例尺”的参数设置。同时可使用 Fiji 进行细胞定量分析。</li>
</ol>

<ol><li>Ebendal, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEbendal%2C+T+%22Use+of+collagen+gels+to+bioassay+nerve+growth+factor+activity%22">Use of collagen gels to bioassay nerve growth factor activity</a>. Rush, R. A. IBRO Handh, John Wiley & Sons Ltd. (1989).</li>
<li>Heermann, S., SchmÃcker, J., Hinz, U., Rickmann, M., Unterbarnscheidt, T., Schwab, M. H., Krieglstein, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuregulin+1+type+III%2FErbB+signaling+is+crucial+for+Schwann+cell+colonization+of+sympathetic+axons%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Neuregulin 1 type III/ErbB signaling is crucial for Schwann cell colonization of sympathetic axons.</a> PloS One. 6 (12), e28692(2011).</li>
<li>Zuo, Y., Lubischer, J. L., Kang, H., Tian, L., Mikesh, M., Marks, A., Scofield, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+expressed+in+mouse+transgenic+lines+mark+subsets+of+glia%2C+neurons%2C+macrophages%2C+and+dendritic+cells+for+vital+examination%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience.+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination.</a> The Journal of Neuroscience. The Official Journal of the Society for Neuroscience. 24 (49), 10999-11009 (2004).</li>
<li>Levi-Montalcini, R., Booker, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EXCESSIVE+GROWTH+OF+THE+SYMPATHETIC+GANGLIA+EVOKED+BY+A+PROTEIN+ISOLATED+FROM+MOUSE+SALIVARY+GLANDS%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">EXCESSIVE GROWTH OF THE SYMPATHETIC GANGLIA EVOKED BY A PROTEIN ISOLATED FROM MOUSE SALIVARY GLANDS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 46 (3), 373-384 (1960).</li>
<li>Meintanis, S., Thomaidou, D., Jessen, K. R., Mirsky, R., Matsas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuron-glia+signal+beta-neuregulin+promotes+Schwann+cell+motility+via+the+MAPK+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">The neuron-glia signal beta-neuregulin promotes Schwann cell motility via the MAPK pathway.</a> Glia. 34 (1), 39-51 (2001).</li>
<li>Yamauchi, J., Miyamoto, Y., Chan, J. R., Tanoue, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ErbB2+directly+activates+the+exchange+factor+Dock7+to+promote+Schwann+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">ErbB2 directly activates the exchange factor Dock7 to promote Schwann cell migration.</a> The Journal of cell biology. 181 (2), 351-365 (2008).</li>
<li>Anton, E. S., Weskamp, G., Reichardt, L. F., Matthew, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+growth+factor+and+its+low-affinity+receptor+promote+Schwann+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nerve growth factor and its low-affinity receptor promote Schwann cell migration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (7), 2795-2799 (1994).</li>
<li>Mahanthappa, N. K., Anton, E. S., Matthew, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+growth+factor+2%2C+a+soluble+neuregulin%2C+directly+increases+Schwann+cell+motility+and+indirectly+promotes+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial growth factor 2, a soluble neuregulin, directly increases Schwann cell motility and indirectly promotes neurite outgrowth.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 16 (15), 4673-4683 (1996).</li>
<li>Yamauchi, J., Chan, J. R., Shooter, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophins+regulate+Schwann+cell+migration+by+activating+divergent+signaling+pathways+dependent+on+Rho+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Neurotrophins regulate Schwann cell migration by activating divergent signaling pathways dependent on Rho GTPases.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (23), 8774-8779 (2004).</li>
<li>Gumy, L. F., Bampton, E. T. W., Tolkovsky, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperglycaemia+inhibits+Schwann+cell+proliferation+and+migration+and+restricts+regeneration+of+axons+and+Schwann+cells+from+adult+murine+DRG%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Hyperglycaemia inhibits Schwann cell proliferation and migration and restricts regeneration of axons and Schwann cells from adult murine DRG.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 37 (2), 298-311 (2008).</li>
<li>Sakaue-Sawano, A., Kurokawa, H., Morimura, T., Hanyu, A., Hama, H., Osawa, H., Kashiwagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+spatiotemporal+dynamics+of+multicellular+cell-cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression.</a> Cell. 132 (3), 487-498 (2008).</li>
<li>Park, D., Don, A. S., Massamiri, T., Karwa, A., Warner, B., MacDonald, J., Hemenway, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+cell+death+using+an+Hsp90+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of cell death using an Hsp90 ligand.</a> Journal of the American Chemical Society. 133 (9), 2832-2835 (2011).</li>
<li>Shcherbo, D., Souslova, E. A., Goedhart, J., Chepurnykh, T. V., Gaintzeva, A., Shemiakina, I. I., Gadella, T. W. J., Lukyanov, S., Chudakov, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+and+reliable+FRET%2FFLIM+pair+of+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Practical and reliable FRET/FLIM pair of fluorescent proteins.</a> BMC Biotechnology. 9, 24(2009).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

周围神经系统发育是一个令人着迷的过程。当发育完成时，轴突全长均被施万细胞（SCs）包绕，在人类中这一长度通常可超过100 cm。为此，在发育过程中必须建立所需施万细胞的正确数量，同时这些细胞还需沿着延伸的轴突迁移至外周，以确保轴突被完全覆盖。这一规律不仅适用于有髓鞘轴突，同样适用于无髓鞘轴突。在这两种情况下，所有轴突均与施万细胞接触，并依赖其支持。为了研究施万细胞的发育过程，需要采用能够考虑轴突区室的实验方法，从而模拟真实生理环境 体内 比划痕实验在发育研究中具有更显著的优势5），Boyden 小室实验（6）或腔室实验所能实现的。在某些实验中，已经考虑了轴突区室的作用。例如，使用坐骨神经的节段作为施万细胞迁移的路径（7, 8)，或施万细胞与神经元共培养，沿神经元轴突观察到其迁移（9).
然而，SCG 外植体施万细胞迁移实验具有更多优势。该方法尤其引人关注，因为施万细胞（SCs）是沿着自身生理状态下...

<table><tbody><tr><td>10x MEM</td><td>Gibco</td><td>21430</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠 (7.5%)</td><td>Gibco</td><td>25080</td><td></td></tr><tr><td>谷氨酰胺</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Merck</td><td>109137</td><td></td></tr><tr><td>神经生长因子（NGF）</td><td>Roche</td><td>1058231</td><td>R&amp;amp;D#556-NG-100</td></tr><tr><td>Neurobasal 培养基</td><td>Gibco</td><td>21103</td><td></td></tr><tr><td>B27 添加剂</td><td>Gibco</td><td>17504</td><td></td></tr><tr><td>抗生素</td><td>Gibco</td><td>15640</td><td></td></tr><tr><td>d-PBS</td><td>Gibco</td><td>14040</td><td></td></tr><tr><td>昆虫针头</td><td>FST</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>注射器针头</td><td>Braun</td><td></td><td>BD # 300013</td></tr><tr><td>8孔细胞培养板</td><td>Lab tek</td><td>177402</td><td></td></tr></tbody></table>

分析沿生长轴突的小鼠许旺细胞发育

Analyzing Murine Schwann Cell Development Along Growing Axons

周围神经的发育是一个引人入胜的过程。神经元会延伸出轴突以支配特定靶标，而在人类中，这些靶标通常距离神经元胞体超过100厘米。发育过程中的神经元存活不仅依赖于靶标来源的生长因子，也依赖于施万细胞（SCs）的支持。为此，施万细胞从神经元胞体区域（或中枢神经系统与周围神经系统交界处）开始包裹轴突，一直延伸至突触或神经肌肉接头。施万细胞起源于神经嵴，并以前体形式沿着新生轴突迁移，直至整条轴突被施万细胞完全覆盖。这凸显了施万细胞迁移在周围神经系统发育中的重要性，也强调了深入研究这一过程的必要性。为了分析施万细胞的发育过程，需要建立一种实验体系，该体系除了包含施万细胞外，还应包括其生理性的迁移基质——轴突。然而，由于胎内发育的限制，在诸如小鼠（mus musculus）等胎盘类脊椎动物中，体内实时成像（in vivo time-lapse imaging）并不可行。为克服这一难题，我们采用了颈上神经节（SCG）组织块培养技术。在神经生长因子（NGF）处理后，SCG组织块可延伸出轴突，随后施万细胞前体从神经节沿轴突向周围迁移。该体系的优势在于，施万细胞来源于内源性细胞池，且它们沿着自身生理性的、同步生长的轴突进行迁移。这一模型尤为吸引人之处在于，可通过实时成像技术观察施万细胞沿轴突的发育过程，从而为进一步揭示施万细胞迁移机制提供可能。

在NGF（4）处理后，SCG组织块中的轴突生长得以促进（电影方案S1 图1方案）。该过程可通过任何倒置显微镜清晰观察，并可通过延时成像进行追踪（电影S2）。若研究人员初次进行小鼠胚胎SCG解剖，我们强烈建议通过简单的抗酪氨酸羟化酶（TH）免疫组织化学染色对技术进行验证。TH是儿茶酚胺能神经元（本例中为交感神经元）的常用标记物，也可标记轴突（图2B）。借此方法可在该系统中分析轴突长度（2）。
重要的是，在轴突生长被诱导后，可以观察到一群迁移细胞的移动（视频 S2 和 S3）。通过 S100 免疫染色阳性验证，这些迁移细胞为施万细胞（SC）（2）。此外，可利用一种转基因小鼠品系，其中绿色荧光蛋白（GFP）由人 S100b 启动子片段驱动（3），以直接分析标记的 SC 群体（2）（视频 S4 和 S5）。借助该转基因品系，这些实验还可结合共聚焦显微镜或光...

本文介绍了一种施万细胞（SC）迁移实验方法，其中施万细胞能够沿着延伸的轴突进行迁移和发育。

外周神经的发育是一个引人入胜的过程。神经元会延伸出轴突以支配特定靶标，这些靶标在人体中通常距离超过……

以下实验的目的是分析施万细胞在其天然生境——生长中的轴突沿线的发育过程。该目标通过以下步骤实现：首先将小鼠胚胎的颈上神经节（superior cervical ganglia，SCG）接种到胶原基质上，作为第二步，用神经生长因子（nerve growth factor，NGF）处理SCG，从而促进SCG神经元以放射状方式长出轴突。除了来自 X 外植体的轴突生长外，还可以观察到内源性施万细胞沿着延伸的轴突向周围迁移。施万细胞的发育可通过延时成像以及对固定组织的终点分析进行观察，后者可实现距离测量。与现有的方法（如划痕迁移实验）相比，该技术的主要优势在于包含了施万细胞的天然微环境。该方法的可视化演示至关重要，因为胶原蛋白支架的正确组装以及sgs的正确解剖是实验成功的关键。这些步骤并不特别难以掌握。他们首先需要练习。在超净台中操作时，应将所有溶液置于冰上以满足我们的实验条件。按照书面实验方案中的说明，配制储备培养基和大鼠尾胶原蛋白。将800 µL大鼠尾尾胶原与210 µL储备培养基混合。混合时避免产生气泡，溶液应保持红色。如果溶液变为黄色，则说明大鼠尾胶原溶液酸性过强，需重新配制，并使用更高浓度的氢氧化钠。将100 µL该溶液加入多孔载玻片的每孔中，确保每个孔的底部完全覆盖。将培养皿放入设定为37摄氏度、5%二氧化碳的加湿组织培养孵箱中孵育两小时。收获后，将E16至E18期胚胎置于含有PBS的培养皿中，从羊膜中解剖出来，并在锁骨水平处断头。随后将头颈部区域转移至硅胶底培养皿中，在体视显微镜下观察，使用昆虫针在下颌下区和锁骨区固定组织。现在使用镊子去除下颌下区域的皮肤和皮下组织。然后移除下颌下唾液腺，以暴露舌骨上肌、舌骨下肌和胸锁乳突肌。接下来，使用镊子小心地去除舌骨下肌和胸锁乳突肌，以暴露喉和气管。用镊子夹住气管，将气管和喉部提起并取出。一旦移除喉和气管，即可看到位于椎前肌两侧的颈总动脉。颈上神经节位于颈总动脉分叉处，呈椭圆形，可据此辨认。使用镊子和装有昆虫针的持针器摘除颈上神经节，并将其放入含有 PBS 的新培养皿中，然后解剖去除神经节上的任何血管或连接组织。借助注射器针头，从培养箱中取出凝胶化的胶原凝胶，并使用安装在注射器上的注射器针头将神经节转移至凝胶上。将组织外植体置于设定为 37 摄氏度、5% 二氧化碳及湿润条件的组织培养箱中孵育一至两小时。孵育一至两小时后，从组织培养孵育箱中取出颈上神经节外植体，向每个外植体中加入100微升含有B27添加剂、谷氨酰胺和抗生素的Neurobasal培养基。随后，再向孔中加入200微升含有60纳克/毫升NGF的Neurobasal培养基，以促进轴突生长。此时也可加入待测物质，以研究其对已开始迁移的雪旺细胞的影响，此时间点定义为体外培养第0天。在体外培养第3天，可通过移除180微升现有培养基，并替换为200微升含有目标物质及神经生长因子（NGF）的培养基（其终浓度为双倍浓度）来施加待测物质。时间推移成像采用倒置显微镜系统进行，该系统可同时支持细胞培养孵育与时间推移成像，以便比较不同待测物质的作用。在一项实验中，建议在实验终点采用多点位设置。用4% PFA将外植体在培养载玻片上固定3至4小时后，用PBS洗涤，随后进行免疫组织化学染色以验证X外植体。用含10%正常驴血清和2% Triton X-100的PBS溶液封闭组织2小时。随后在封闭液中加入一抗，4℃孵育过夜。次日一抗孵育结束后，将含有X外植体的凝胶经PBS洗涤后转移至24孔板中，加入荧光标记的二抗避光孵育2小时，再用PBS洗涤，最后加入DAPI溶液孵育10分钟。经过多次洗涤后，将含有X explant的胶原凝胶置于显微镜载玻片上，干燥载玻片，随后用封片剂封片。使用标准荧光显微镜获取图像，用于后续定量分析。若显微镜软件具备记录元数据的功能，则更为有利。可使用 Fiji 或 ImageJ 软件对获得的图像进行定量分析，这些软件可免费用于科学研究。本视频展示了体外培养四天内脊髓背根神经节 EXPLAN 的轴突生长过程。可在体外培养的第四天进行免疫组织化学染色，以清晰鉴定移植的神经节。作为交感神经节，可以观察到许旺细胞沿着轴突迁移，从颈上神经节向周围移动。本视频展示了与前述相同的迁移模式，但放大倍数更高。通过使用DPI对细胞核进行复染，可轻松测量迁移距离：在多个位置测量前沿许旺细胞的细胞核与外植的颈上神经节（SCG）边缘之间的距离，如示意图及体外培养四天的DPI标记、NGF处理样本图像所示，本影片展示了SCG外植体边缘处许旺细胞的迁移情况。明场与荧光成像的结合可实现对 S100 GFP 阳性施万细胞及其轴突的可视化观察。最后，本视频展示了离体 superior cervical ganglion 边缘施万细胞的迁移过程。此处仅显示荧光通道，以便更清晰地观察 S100 GFP 阳性施万细胞。按照此方案，可进一步进行其他定量分析，例如单细胞增殖的定量分析或单细胞凋亡的定量分析。当然，为进行终点分析，需开展适当的免疫组织化学实验，或使用特定的转基因动物，以在活体环境中展示相关效应。

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Research

科研

JoVE Journal

Neuroscience

神经科学

分析小鼠沿着轴突生长的雪旺氏细胞发展

本文旨在逐步描述常用的方法 体外...

利用雪旺细胞-星形胶质细胞相互作用分析 体外 检测方法

本文描述了一种利用培养的成年小鼠背根神经节神经元进行轴突再生遗传学研究的体外模型。该方法包括重新悬浮和再接种步骤，以允许经历遗传操作的神经元重新生长轴突。该策略对于利用基于RNA干扰的蛋白敲低技术进行轴突再生的缺失功能研究尤为有用。...

成年背根神经节神经元培养体系中的轴突再生遗传学研究

本视频展示了背根神经节外植体与施万细胞的共培养模型。在共培养条件下，抗坏血酸可促进施万细胞向髓鞘形成细胞分化。髓鞘形成施万细胞会多次包裹轴突，形成髓鞘，这对神经功能至关重要。...

背根神经节外植体与施万细胞共培养以实现神经元髓鞘化

本文介绍了一种优化的实验方案，用于对胎鼠进行基因分型、染色及样本制备，以实现对整个动物体内周围伤害性感受器轴突投射的成像，从而有效评估遗传工程小鼠发育过程中感觉轴突生长的表型特征。...

小鼠胚胎感觉轴突投射的全组织成像

结合生化检测的光学显微技术揭示了SNARE介导的胞吐作用在netrin依赖性轴突分支中的参与。该技术组合可用于鉴定调控轴突分支和细胞形态变化的分子机制。...

利用联合方法学定义质膜运输在轴突分支和神经元形态发生中的作用

本方案描述了从大鼠分离背根神经节（DRG）神经元，并在静态预拉伸细胞培养系统上培养DRG神经元以增强轴突排列，随后与施万细胞（SCs）共培养以促进髓鞘形成的实验方法。...

一种增强背根神经节神经元轴突排列与髓鞘形成的方法

本文描述了一种用于可视化转基因 Hb9::GFP...

利用光片荧光显微镜观察小鼠胚胎运动轴突导向及量化轴突分支

离体脑片实验可实现动眼神经生长的实时成像。通过将 E10.5 IslMN:GFP...

利用胚胎期表达GFP小鼠的离体动眼神经脑片培养进行动眼神经突起生长的延时成像

在背根神经节与施万细胞的共培养体系中，可以研究周围神经系统的髓鞘形成。该模型为观察和量化周围髓鞘化过程，以及研究感兴趣化合物对髓鞘影响提供了实验机会。...

大鼠背根神经节外植体与施万细胞共培养体系中周围神经轴突的体外髓鞘化

在大脑皮层发育过程中，神经元和胶质细胞起源于衬于脑室壁的室管膜区，并向脑表面迁移。许多基因参与了这一过程。本方案介绍了对迁移中的神经元和胶质前体细胞进行活细胞延时成像的技术。...

胚胎小鼠脑切片中迁移神经元和胶质前体细胞的延时成像

学习利用小鼠胚胎颈上神经节外植体培养技术，观察雪旺氏细胞沿轴突迁移的自然发育过程。该方法结合胶原基质与神经生长因子处理，通过延时成像和终点分析定量测量迁移距离，为周围神经再生研究提供更接近生理环境的实验模型。

分析沿生长轴突的小鼠许旺细胞发育

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