等距和骨骼肌产生偏心力评估隔离肌营养不良症的小鼠模型

肌肉功能的测量有助于肌肉病理评价的潜在疗法，以及测定这种组织生理学机制。我们将展示准备的伸趾长肌和膈肌功能测试。协议将显示为等长收缩和离心收缩，以及营养不良肌肉之间的业绩差异的一种病理状态，和野生的肌肉。

该程序的总体目标是测量从小鼠中分离的骨骼肌的机械特性。这是通过首先解剖动物的趾长伸肌或 EDL 肌以及横膈肌来实现的。准备好隔膜条后，将 EDL 和隔膜条固定在装有含氧林格溶液的培养皿中，然后将缝合环系在肌肉的两端。

接下来，将 EDL 或隔膜条固定在器官浴中，位于一端连接到力传感器或杠杆的两个电极之间，并根据抽搐力调整到最佳长度。最后一步是使用一些机械协议刺激肌肉并测量力量的产生。最终，力产生、抵抗损伤力频率关系和其他特性的计算用于显示肌肉的力量和完整性以及其他特性，以及治疗或基因改造的效果（如果适用）。

该技术可用于测试肌营养不良症的潜在疗法，因为这些疗法中的大多数旨在恢复肌肉力量和降低肌肉脆性。虽然我们不是第一个使用这项技术的人，但我们经常使用它来研究许多不同的小鼠模型并评估它们的肌肉功能，以及表征和评估肌营养不良症的多种疗法。除了 Catherine Morewood 博士之外，我们还将使用我们的生理评估核心的两名成员，研究助理 Min Liu 博士和研究专家 Ian 先生来演示该程序。

该程序中使用的小鼠使用氯胺酮和甲苯噻嗪进行麻醉，以确保它们不会感到疼痛或痛苦，但肌肉仍可通过循环获得充足的氧合。通过捏脚趾确认动物已充分麻醉后，使用医用胶带固定其高肢，并去除下前肢的皮肤以露出该区域的肌肉，保持肌肉湿润定期使用 PBS。在解剖镜下，在膝盖外侧做一个小切口，以暴露趾长伸肌或 EDL 肌的近端肌腱。

该区域有两条肌腱，应切开两条肌腱以去除内侧踝部的 EDL。切开胫骨前肌或 TA 肌的肌腱，露出沿跖骨延伸的 EDL 远端肌腱。将 TA 肌肉抬起。

小心不要割伤或触摸下面的 EDL。返回到 EDL 的远端肌腱并剪掉每一个。接下来，抓住肌腱，轻轻地将 EDL 从肢体的其余部分拉开。

它应该从近端自由释放。取出 EDL 肌肉，放入装满冰镇含氧绞肉剂的解剖皿中。将肌肉穿过肌腱，大约是静止长度，这是体内发现的长度。

当肌肉在盘子中张开时，长度太短，如果肌肉拉扯解剖针，则长度太长。将缝合线系在肌腱上，尽可能靠近肌肉，但不要接触肌肉。使用缝合线将肌肉固定在大约静止长度处。

开始此过程。在被安乐死的动物的皮肤上做一个切口。露出腹腔和胸腔。

打开腹腔，用骨剪刀剪开肋骨正下方的体壁，从隔膜插入点上方开始。沿着肋骨线切开整个肋骨，切开脊柱。切开穿过隔膜中心的血管，以便可以轻松去除隔膜。

从鼠标上取下隔膜，放入装满含氧振铃的解剖皿中。轻轻搅动培养皿中的隔膜以洗去血液。根据需要刷新 ringer 解决方案。

接下来，沿着外侧半膈肌中央部分的纤维方向从中央肌腱到肋骨切下一小条膈肌。条带的宽度应在 2 到 4 毫米之间。将缝合线系在中央肌腱上，将缝合线系在每个横向突出的肋骨末端，然后用骨剪刀将它们绑在一起形成一个大环。

切开条带两侧的肋条，在隔膜的两侧留下大约 1 到 2 毫米的肋条悬垂。离体骨骼肌的剥离力产生评估由体外肌肉测试系统进行，将肌肉安装在机械师的浴槽中，抓住缝合线，并使用这些将肌肉连接到一端的刚性柱和另一端的力传感器上。一个很好的近似值是静息肌长度。

如前所述，浴中充满了保持在 22 摄氏度的含氧林格溶液。为了延长肌肉稳定性，测试肌肉应在功能测试前在此浴中休息 5 分钟，使肌肉温度等于 22 摄氏度，以建立超最大刺激条件。将肌肉放入浴中后，使用单个 0.5 毫秒的刺激脉冲来产生抽搐并监测力输出。

逐渐增加电流，直到力达到最大但稳定的水平，将电流增加到比该水平多 10%，以便其余实验建立最佳长度，首先，确保肌肉不松弛，但也不要示教。一个很好的近似值是如前所述的静息肌肉长度。使用等长抽搐刺激逐渐调整肌肉的长度，直到获得最大力量。

在每次收缩之间让肌肉休息约 10 秒。当抽搐力达到最大时使用游标卡尺创纪录的肌肉长度时，可以实现最佳肌肉长度。对于 EDL，它是肌腱交界处之间的长度。

对于横膈膜，它是中央肌腱肌腱交界处和肌肉插入肋骨之间的长度。为了确定最大等长泰坦尼克力，在超最大刺激和融合频率下，用一系列 0.5 毫秒的脉冲刺激肌肉，使其处于最佳肌肉长度，持续 500 毫秒。EDL 肌肉的平台期通常以 120 赫兹达到，而 100 赫兹的横膈肌以相应的频率刺激 3 次，休息 5 分钟后，每块肌肉的刺激发作之间休息 5 分钟。

进行等长收缩后，开始离心收缩程序。在最初的 500 毫秒内以 80 赫兹的波长等长刺激肌肉，然后在最后 10 毫秒的刺激中以 200% 的最佳肌肉长度伸展。重复刺激模式，中间休息 5 分钟。

对于所需的离心收缩次数，测量拉伸前一段时间内每次收缩的力。计算功能测试完成时第一次和最后一次收缩之间的力下降。缩短肌肉长度，轻轻地从换能器和柱上去除肌肉。

将肌肉放回带有铃声的解剖盘中。从 EDL 肌肉的肌肉上拆下缝合线。阻塞肌肉两次，然后在后续处理之前称重。

这对于计算横膈肌浸泡在 0.1%pros 和橙子（膜和渗透染料）中 15 到 20 分钟的横截面积和比力非常重要。这将提供夹层损伤的指数，从骨插入处以及中央肌腱解剖膈肌。这对于在称重和后续准备之前提供肌肉印迹的准确重量是必要的。

横截面积或 CSA 使用以下公式计算，其中 L 超过 LO 是纤维与肌肉长度的比值，1.06 是野生型 C 57 中等长力的肌肉密度预期值，肌肉萎缩症或 M-D-X-E-D-L 肌肉如图所示。由于 MDX 肌肉表现出代偿性肥大，因此与年龄匹配的野生型对照相比，MDX 肌肉中总力对泰坦尼克力可能更高。更合适的功能输出测量是比力，其中力是横截面积的归一化。

要计算该值，比力取决于肌肉的固有功能能力，当同时考虑绝对力和横截面积时，营养不良肌肉的弱点更加明显。在这项研究中观察到，MDX 小鼠的 EDL 肌肉产生的比力比 10 至 26 周龄的年龄匹配的野生型小鼠低约 20% 至 25%。对于横膈膜，只有比力与比较相关，因为准备工作是一块取决于解剖的肌肉。

蓝线表示的 C 57 野生型肌肉与红条表示的 MDX 膈肌之间的比力比较反映了该组织的进行性病变。等长力输出随着年龄的增长而减少，因此到 6 个月大时，来自 MDX 小鼠的膈肌产生的功能输出不超过来自年龄匹配的野生型对照的膈肌条带的一半。下图显示了横膈膜试验的离心收缩示例。

随着每次随后的偏心收缩力，来自野生型 C 57（蓝色）和 MDX 小鼠（红色）的隔膜条带中的收缩力输出都会减弱。然而，在 MDX 小鼠的肌肉样本中，力量的损失更为明显，这可能是由于一旦掌握了抗肌萎缩蛋白及其相关蛋白质的缺失。如果按照这种技术正确执行，这项技术可以在大约一小时内对单块肌肉进行。

其他方法，如蛋白质印迹或其他生化测量，可用于回答其他问题，如治疗是否改变了蛋白质水平或使肌肉完整性正常化。看完这个视频后，你应该对如何从鼠标中解剖 EDL 和横膈膜以及如何测量和分析离心收缩前后的力产生有一个很好的了解。