评估来自肌营养不良症小鼠模型的分离骨骼肌的等长和离心收缩力

本实验的总体目标是测量从小鼠分离的骨骼肌的力学特性。首先解剖动物的趾长伸肌（extensor digitorum longus，EDL）以及膈肌，制备膈肌条。将EDL肌肉和膈肌条置于盛有充氧林格液的培养皿中，用缝合线在肌肉两端系成环状结扎。

接下来，将EDL或膈肌条固定在器官浴槽中，其一端连接至力传感器或杠杆，另一端固定于电极之间，并根据抽搐力调整至其最佳长度。最后一步是采用多种机械刺激方案刺激肌肉，并测量其产生的力量。最终，通过计算力量输出、抗损伤能力、力-频率关系及其他特性，以评估肌肉的强度与完整性等性质，以及在适用情况下，评估某种处理或基因修饰的影响。

该技术可用于测试肌营养不良症的潜在疗法，因为大多数此类疗法旨在恢复肌肉力量并降低肌肉脆弱性。尽管我们并非首个采用该技术的团队，但我们常规性地将其用于研究多种不同的小鼠模型，以评估其肌肉功能，同时也用于表征和评价针对肌营养不良症的多种治疗方法。除凯瑟琳·莫伍德博士外，本次操作演示还将由我们生理评估核心团队的两位成员共同完成：刘敏博士（研究助理）和伊恩先生（研究专家）。

本实验所用小鼠通过注射氯胺酮和赛拉嗪进行麻醉，以确保其无痛觉和痛苦，同时通过血液循环保持肌肉充分供氧。通过脚趾夹捏确认动物已充分麻醉后，使用医用胶带固定其四肢，并去除后肢前侧下部的皮肤以暴露该区域的肌肉，定期施加PBS以保持肌肉湿润。在解剖显微镜下，于膝关节外侧做一小切口，以暴露趾长伸肌（extensor digitorum longus，简称EDL肌）的近端肌腱。

该区域有两条肌腱，均需切断，以便在内踝处移除外侧趾长伸肌（EDL）。切断胫骨前肌（TA）的肌腱，以暴露沿跖骨走行的EDL远端肌腱。将TA肌肉移开。

注意不要切割或触碰下方的趾长伸肌（EDL）。返回到EDL的远端肌腱，逐一剪断。接着，捏住肌腱，轻柔地将EDL从肢体其余部分拉离。

应使其从近端自由释放。取出EDL肌肉并置于盛有冷的充氧Ringer液的解剖皿中。通过肌腱将肌肉固定，长度约为其静息长度，即体内自然状态下的长度。

当肌肉在培养皿中过于松弛时长度太短，而当肌肉牵拉解剖针时又过长。将缝合线尽可能靠近肌腱处打结，但不要接触肌肉本身。利用缝合线将肌肉固定在大约静息长度的位置。

开始此操作时，对已实施安乐死的动物进行皮肤切口，以暴露腹腔和胸腔。

使用骨剪在膈肌附着处上方开始，于肋骨下方剪开体壁，打开腹腔。沿肋骨走向环绕整个肋笼进行剪切，并剪断脊柱。剪断穿过膈肌中央的血管，以便轻松移除膈肌。

取出小鼠的膈肌并置于盛有充氧林格液的解剖皿中。轻轻搅动膈肌以洗去血液。根据需要更换林格液。

接下来，沿外侧半侧膈肌中央部位的肌纤维走向，从中心腱至肋骨处切取一条窄条状膈肌组织。该窄条宽度应在2至4毫米之间。将缝线系于中心腱上，再分别系于两侧向外突出的肋骨末端，然后使用骨剪将这些缝线绑在一起，形成一个大环。

在膈肌条带两侧切取肋骨，每侧保留约一到两毫米的肋骨突出部分。通过体外肌肉测试系统对分离的骨骼肌进行收缩力生成评估，将肌肉安装在机械浴槽中，夹住缝线，并用缝线将肌肉一端固定在刚性支柱上，另一端连接至力传感器。一个良好的近似值是肌肉的静息长度。

如前所示，将浴槽中充满在22摄氏度下维持的充氧林格液。为延长肌肉稳定性，在进行功能测试前，肌肉应在该浴槽中静置5分钟，使肌肉温度达到22摄氏度，以建立超最大刺激条件。将肌肉放入浴槽后，使用单次0.5毫秒的刺激脉冲引发肌肉收缩，并监测其产生的张力输出。

逐渐增加电流，直至力达到最大但稳定的水平，随后在剩余实验中将电流提高至超过该水平的10%，以确定最佳长度。首先，确保肌肉既不松弛，也不过度拉紧。一个良好的近似值是此前显示的静息肌肉长度。通过等长收缩刺激，逐步调整肌肉长度，直至获得最大收缩力。

每次收缩之间让肌肉休息约10秒。当抽搐力达到最大时，即为肌肉的最适长度，使用游标卡尺记录肌肉长度。对于趾长伸肌（EDL），该长度为肌腱连接处之间的距离。

对于膈肌，其长度是指中心腱的肌腱连接处到肌肉在肋骨上的附着点之间的距离。为测定最大等长收缩张力，需将肌肉调节至最适长度，以超最大刺激强度、在融合频率下施加一系列持续500毫秒的刺激，每个脉冲持续0.5毫秒。EDL肌肉的平台期通常在120赫兹时达到，而膈肌肌肉则在100赫兹时达到。每块肌肉在相应频率下刺激三次，每次刺激之间休息五分钟，在完成五分钟后休息期后开始。

完成等长收缩后，开始进行离心收缩实验。首先以80赫兹对肌肉进行500毫秒的等长刺激，随后在最后200毫秒刺激期间将肌肉长度拉伸至其最优长度的10%。重复该刺激模式，每次之间休息5分钟。

对于所需数量的离心收缩，在拉伸前的时间段内测量每次收缩的力。在功能测试结束时，计算第一次与最后一次收缩之间的力下降值。缩短肌肉长度，并小心地将肌肉从换能器和固定柱上取下。

将肌肉放回含有林格液的解剖皿中。去除趾长伸肌（EDL 肌）上的缝线。对肌肉进行两次阻断处理，随后称重，再进行后续处理。

这对于计算膈肌的横截面积和比力至关重要。将膈肌浸泡在0.1% pros和橙色中，这是一种膜通透性染料，浸泡15至20分钟。这将提供一个解剖损伤的指标，需将膈肌从骨性附着处以及中心腱分离。这是为了在称重及后续处理前获得肌肉吸干后的准确重量所必需的步骤。

横截面积（CSA）的计算公式如下：其中 L 与 LO 的比值为肌纤维长度与肌肉长度之比，1.06 为肌肉密度。本图展示了 12 周龄野生型 C57 及肌营养不良症（MDXEDL）肌肉的等长收缩力预期值。由于 MDX 肌肉表现出代偿性肥大，其总强直收缩力可能高于同龄野生型对照组。更合适的机能输出指标是比力（specific force），即力量经横截面积标准化后的数值。

该值的计算基于肌肉的固有功能能力，其中在同时考虑绝对力量和横截面积时，营养不良性肌肉的无力表现更为明显。本研究观察到，从10至26周龄的MDX小鼠中分离的EDL肌肉所产生的比力（specific force）比同龄野生型小鼠低约20%至25%。对于膈肌而言，由于制备样本依赖于解剖操作而仅为肌肉的一部分，因此仅比力适用于比较。

蓝色线条代表的 C57 野生型肌肉与红色柱状图代表的 MDX 膈肌之间比力的比较反映了该组织中进行性的病理变化。等长收缩力随年龄增长而下降，到六个月龄时，MDX 小鼠膈肌产生的功能输出不超过同龄野生型对照组膈肌条的一半。本图展示了膈肌测试中离心收缩的一个示例。

随着每次后续的离心收缩，来自野生型 C57（蓝色所示）和 MDX 小鼠（红色所示）的膈肌条力量输出均会下降。然而，MDX 小鼠肌肉样本的力量损失更为显著，这可能是由于缺乏肌营养不良蛋白（dystrophin）及其相关蛋白所致。一旦掌握该技术，若正确操作，单块肌肉的实验约需一小时即可完成。

其他方法，如蛋白质印迹法或其他生物化学检测，可用于回答更多问题，例如治疗是否改变了蛋白质水平或恢复了肌肉完整性。观看本视频后，您应能够充分理解如何从小鼠中分离趾长伸肌和膈肌，以及如何在离心收缩前后测量和分析力量输出。