Name: 多巴酚丁胺诱导的心脏压力测试和监控通过在小鼠心脏导管插入术 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 45 s
Description: 了解多巴酚丁胺诱导的心脏压力测试方法，通过心脏导管插入术监测小鼠动脉压和心室压变化。该技术可揭示高脂饮食诱导肥胖小鼠的亚临床心脏疾病，为心血管疾病研究提供可靠的实验方案。

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我们感谢圣保罗大学里贝朗普雷图医学院的 Helio Salgado 博士、Renata Lataro 和 Mauro de Oliveira，以及马斯特里赫特大学心血管研究所的 Ben Janssen 博士，在实验建立过程中提供的大力支持。
本工作由 FONDECYT 资助项目 N° 11090114 支持，授予 S.D.C.。

本方案已获得德尔萨尔瓦多大学临床阿莱曼医学院伦理委员会批准。
一、配制多巴酚丁胺输注液
<ol>
 <li>将10 mg多巴酚丁胺溶解于20 ml无菌蒸馏水中，配制成浓度为500 μg/ml的多巴酚丁胺储备液。分装后于-20 °C保存。该溶液至少可使用3个月。</li>
 <li>在室温下解冻一份多巴酚丁胺储备液。</li>
 <li>用无菌0.9% NaCl稀释多巴酚丁胺储备液，配制成工作液，其浓度按以下公式计算：多巴酚丁胺（μg/ml）= 体重 × 0.2。</li>
 <li>用多巴酚丁胺工作液填充一支1 ml、29G×1/2"的注射器。</li>
 <li>将注射器针头插入一段20 cm长的PE-10导管中。</li>
 <li>根据制造商说明，将注射器安装至输液泵中。</li>
 <li>设置梯度输注程序，采用逐步递增方式，每步增加10 μl/min，共6个步骤。</li>
</ol>
II. 压力传感器的准备
<ol>
 <li>为尽量减少信号漂移，将压力传感器浸入37 °C的无菌水中至少15分钟。浸入深度不得超过0.5 cm，以防止静水压力影响压力传感器。</li>
 <li>在25 mmHg和100 mmHg下对压力传感器进行电子校准。将电信号输入（伏特）转换为压力信号（mmHg）。</li>
 <li>设置采样速率为2 k/s，并使用截止频率为100 Hz的低通滤波器。将压力信号校准至零mmHg。</li>
 <li>从导管尖端回退15 mm处做标记。通过超声心动图估算从插入点到心脏的距离，并检测导管是否进入左心室。</li>
</ol>
III. 小鼠插管前准备
<ol>
 <li>称取30至32周龄的C57BL/6雄性小鼠体重。</li>
 <li>按60 μg/kg剂量腹腔注射氯胺酮，同时按4 μg/kg剂量注射赛拉嗪1。
 注意：也可使用其他麻醉剂，例如：350 - 450 μg/kg的戊巴比妥钠（avertin）、50 μg/kg的戊巴比妥（pentobarbital）或1.5 - 2%的异氟烷（isoflurane）2-3。</li>
 <li>使用电动剃须刀剃除小鼠颈部毛发。</li>
 <li>将麻醉后的小鼠仰卧置于预热的恒温加热板上，并用纸胶带固定其四肢。</li>
 <li>进行足趾夹捏测试，以确认小鼠已完全镇静。</li>
 <li>轻柔插入直肠探头以监测体温，建议使用凡士林润滑的探头。</li>
 <li>若体温偏离37 °C ± 0.5 °C范围，应通过调节加热板进行校正。</li>
 <li>将小鼠鼻部靠近氧气供应口。</li>
 <li>将小鼠颈部区域置于体视显微镜下。</li>
</ol>
IV. 数据采集
<ol>
 <li>在 LabChartPro 7 软件中，选择一个通道用于压力记录，另一个通道用于心率（HR）记录。对于后者，选择“周期性测量”选项，并将测量方式设置为速率。</li>
 <li>将压力通道的量程范围设置为：0 至 150 mmHg。</li>
 <li>将心率通道的量程范围设置为：200 至 600 bpm。</li>
 <li>按下开始键以启动记录。</li>
 <li>插入注释以标明所执行的操作，例如：麻醉给药、多巴酚丁胺输注开始、多巴酚丁胺浓度、呼吸变化等。</li>
</ol>
V. 心导管术4,5
<ol>
 <li>在右侧靠近下颌处做一个小切口。用剪刀分离皮肤与肌肉之间的结缔组织。</li>
 <li>在气管右侧进行纵向解剖（1.5 - 2 cm）。使用弯头镊子分离结缔组织、脂肪和肌肉，以暴露靠近气管的右颈总动脉。</li>
 <li>将扩张器置于动物右侧，以充分暴露颈总动脉。心脏产生的搏动性压力有助于识别动脉。颈静脉呈深红色，位于右侧。</li>
 <li>用弯头镊子将动脉与周围组织分离。迷走神经呈白色细线状，沿动脉走行。</li>
 <li>剪取一段20 cm长的6/0丝线，并将其对折成“双股”。</li>
 <li>将“双股”线从左向右穿过动脉下方。剪断丝线，形成两个独立的线端。</li>
 <li>在动脉下方再穿入第三根丝线（10 cm）。</li>
 <li>将靠近头部位置的丝线打一个紧结，远端的丝线则打一个松结。</li>
 <li>中间丝线打一个松结，并用胶布将其中一端固定在加热垫上。</li>
 <li>通过滴加无菌0.9% NaCl保持颈总动脉湿润。用棉签吸去多余液体。</li>
 <li>用止血钳夹住下方的丝线并轻轻拉紧。</li>
 <li>通过夹住腹部皮肤并拉紧上方丝线，固定止血钳的位置，以阻断血流。确认动脉周围的结缔组织已完全清除。此时动脉应充盈血液但无搏动。避免丝线对动脉产生扭转力。</li>
 <li>使用Vannas显微剪在动脉远端靠近底部处做一横向小切口，会有血液滴出。</li>
 <li>将导管插入颈总动脉。确保整个压力传感器完全进入。检查是否无血液渗漏。</li>
 <li>轻柔调整中间丝线的结，以固定导管位置。切勿过度压迫，因压力传感器极为脆弱。</li>
 <li>松开夹在动物腹部的止血钳。</li>
 <li>用手握住导管并轻推中间丝线，防止血液流失。注意：动脉应始终充盈血液。</li>
 <li>开始记录压力信号。</li>
 <li>当导管位于动脉内时，动脉压信号在60-70至100-120 mmHg之间波动。压力信号的形态如图1.A所示。注意：若需记录动脉压，可在信号稳定至少5分钟后进行。心率（HR）值通过分析30秒记录信号的压力波形获得。根据研究目的，也可采用心电图（ECG）方法直接测量HR。</li>
 <li>轻柔推进导管，直至压力信号形态发生改变（图1.B）。当导管进入左心室后，压力信号在0至100-120 mmHg之间波动。若导管推进困难，可用两指轻捏动物胸部辅助。</li>
 <li>持续监测呼吸频率、体温、麻醉深度及压力信号。所有参数均应保持稳定。</li>
</ol>
VI. 多巴酚丁胺输注
<ol>
 <li>进行颈静脉插管时，务必剥离静脉周围的脂肪组织，以防止静脉穿孔。静脉结扎的手术步骤与颈动脉所示操作类似。</li>
 <li>将PE-10导管插入静脉，通过回抽注射器活塞确认血液流动未受阻。</li>
 <li>多巴酚丁胺输注从10 μl/min开始，至60 μl/min结束。每一步输注速率均维持2 min6。</li>
 <li>最后一次多巴酚丁胺给药后，使用过量麻醉剂处死动物。</li>
</ol>
七、数据分析
<ol>
 <li>进行数据分析时，选择您感兴趣的已记录数据段。务必考虑压力信号稳定的时段。</li>
 <li>在血压模块中选择“设置”图标，并指明所选的压力信号类型。</li>
 <li>LabChartPro 7 软件将自动显示心率（HR）、收缩压（Pmax）、舒张压（Pmin）、舒张末期压力（EDP）、最大正向压力变化率（dP/dtmax）和最大负向压力变化率（dP/dtmin）的平均值、最大值和最小值。此外，心脏参数也可在压力曲线上显示。</li>
</ol>

<ol><li>Hart, C. Y., Burnett, J. C., Redfield, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+avertin+versus+xylazine-ketamine+anesthesia+on+cardiac+function+in+normal+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of avertin versus xylazine-ketamine anesthesia on cardiac function in normal mice.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 281, H1938-H1945 (2001).</li>
<li>Janssen, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+anesthetics+on+systemic+hemodynamics+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of anesthetics on systemic hemodynamics in mice.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 287, H1618-H1624 (2004).</li>
<li>Lorenz, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+evaluating+cardiovascular%2C+renal%2C+and+pulmonary+function+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Regul.+Integr.+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">A practical guide to evaluating cardiovascular, renal, and pulmonary function in mice.</a> Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 282, R1565-R1582 (2002).</li>
<li>Lorenz, J. N., Robbins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intraventricular+pressure+and+cardiac+performance+in+the+intact+closed-chest+anesthetized+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Measurement of intraventricular pressure and cardiac performance in the intact closed-chest anesthetized mouse.</a> Am. J. Physiol. 272, H1137-H1146 (1997).</li>
<li>Nemoto, S., DeFreitas, G., Carabello, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+catheterization+technique+in+a+closed-chest+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Contemp.+Top.+Lab+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cardiac catheterization technique in a closed-chest murine model.</a> Contemp. Top. Lab Anim. Sci. 42, 34-38 (2003).</li>
<li>Daniels, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+cardiac+functional+reserve+in+type+2+diabetic+db%2Fdb+mice+is+associated+with+metabolic%2C+but+not+structural%2C+remodelling%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol.+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Impaired cardiac functional reserve in type 2 diabetic db/db mice is associated with metabolic, but not structural, remodelling.</a> Acta Physiol. (Oxf). 200, 11-22 (2010).</li>
<li>De Celle, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+structural+and+functional+consequences+of+cardiac+ischaemia-reperfusion+injury+in+vivo+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Long-term structural and functional consequences of cardiac ischaemia-reperfusion injury in vivo in mice.</a> Exp. Physiol. 89, 605-615 (2004).</li>
<li>Huntgeburth, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor+beta+oppositely+regulates+the+hypertrophic+and+contractile+response+to+beta-adrenergic+stimulation+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor beta oppositely regulates the hypertrophic and contractile response to beta-adrenergic stimulation in the heart.</a> PLoS One. 6, e26628(2011).</li>
<li>Reddy, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+function+in+young+and+old+Little+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gerontol.+A.+Biol.+Sci.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cardiac function in young and old Little mice.</a> J. Gerontol. A. Biol. Sci. Med. Sci. 62, 1319-1325 (2007).</li>
<li>Christoffersen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+lipid+accumulation+associated+with+diastolic+dysfunction+in+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Cardiac lipid accumulation associated with diastolic dysfunction in obese mice.</a> Endocrinology. 144, 3483-3490 (2003).</li>
</ol>

未声明任何利益冲突。

由多巴酚丁胺诱导并经心导管术监测的心脏负荷试验较为繁琐。然而，遵循此处所述方案并经过短期培训后，可在约一小时的单次实验中评估六项血流动力学参数。
本方案中的关键步骤是血管插管。关于颈动脉插管，所作切口应足够深，以穿透动脉的三层组织，并足够大，以便导管顺利通过。关于颈静脉插管，虽然出血风险较低，但静脉阻塞的可能性较高。因此，实验的可重复性在很大程度上取决于切口策略的标准化程度。
为尽量减少麻醉的抑制作用，应预防并纠正低温和缺氧，必要时进行相应处理。应保持呼吸节律规律，因为深大或不规则的呼吸会影响左心室压（LVP）的记录。
所使用的多巴酚丁胺剂量应根据以下因素进行调整：i）给药途径（静脉内：0.5 至 40 ng/g/min7,8；腹腔内：1 至 1.5 μg/g/min9,10）；ii）心功能障碍的严重程度；以及 iii）心脏改变的病因。
最后但同样重要的是，三条实用建议：i...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>PE-50/10</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0752</td><td></td></tr><tr><td>6/0 HR17 丝线</td><td>Tagum</td><td>SN0713K</td><td></td></tr><tr><td>赛拉嗪 20 mg/ml</td><td>Laboratorio Centrovet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯胺酮 100 mg/ml</td><td>Drag Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.9% 氯化钠</td><td>Lab Sanderson S.A.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盐酸多巴酚丁胺</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0676</td><td></td></tr><tr><td>U-100 胰岛素注射器 29G x &amp;frac12;&quot;</td><td>Terumo Medical Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>显微解剖镊 11.5 cm 型号 7</td><td>Lawton Medizintechnik</td><td>09-0959</td><td></td></tr><tr><td>Graefe 镊 Cvd 0.7 mm 7 cm</td><td>Lawton Medizintechnik</td><td>62-0263</td><td></td></tr><tr><td>Dieffenbach 蛙嘴钳 38 mm 直型</td><td>Lawton Medizintechnik</td><td>60-010</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 剪刀 8 cm 直型 FH</td><td>Lawton Medizintechnik</td><td>63-1400</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>SPR-671 MiKro-Tip 压力导管</td><td>Millar instruments</td><td>840-6719</td><td></td></tr><tr><td>PCU-2000 压力控制单元</td><td>Millar instruments</td><td>880-0129</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 4/30</td><td>ADinstruments Pty Ltd.</td><td>ML866</td><td></td></tr><tr><td>LabChartPro 7</td><td>ADinstruments Pty Ltd.</td><td>MLU260/7</td><td></td></tr><tr><td>Legato200 输注泵</td><td>KdScientific</td><td>KD-KDS210P</td><td></td></tr><tr><td>TCAT-2LV 温度控制器及等温加热板</td><td>PhysiTemp instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>医用氧气供应</td><td>Indura</td><td></td><td></td></tr><tr><td>直肠探头</td><td>ADinstruments Pty Ltd.</td><td>MLT1404</td><td></td></tr><tr><td>三目显微镜，轴向照明</td><td>LW Scientific</td><td>Z2B-TRI-ETNE, ILP-1502-LTS1, ILP-1502-DGGF</td><td></td></tr></tbody></table>

多巴酚丁胺诱导并经心导管术监测的小鼠心脏应激试验

Cardiac Stress Test Induced by Dobutamine and Monitored by Cardiac Catheterization in Mice

多巴酚丁胺是一种β-肾上腺素能激动剂，对心脏中表达的受体（β1）的亲和力高于对动脉中表达的受体（β2）的亲和力。当全身给药时，它会增加心脏的耗氧需求。因此，多巴酚丁胺可揭示潜在有梗死风险的异常心律或缺血区域。
心脏应激试验期间的心脏功能监测可通过超声心动图或心导管术进行。后者是一种侵入性技术，但比前者更准确且信息量更大。
通过多巴酚丁胺诱导并经心导管术监测的心脏应激试验，如本文所述，可在单次实验中测量以下血流动力学参数：心率（HR）、收缩压、舒张压、舒张末期压、最大压力上升速率（dP/dtmax）和最大压力下降速率（dP/dtmin），这些参数可在基线条件下以及递增剂量的多巴酚丁胺作用下进行测定。
与预期一致，在正常小鼠中，我们观察到心率（HR）、左心室压力最大上升速率（dP/dtmax）和左心室压力最大下降速率（dP/dtmin）随多巴酚丁胺剂量增加而升高。此外，在最高测试剂量（12 ng/g/min）下，高脂饮食诱导的肥胖小鼠出现了心脏失代偿现象。

动脉压信号由收缩压和舒张压定义。当压力传感器位于左心室内部时，其压力（LVP）波形表现为舒张压下降至零，并在心室收缩前出现左心房收缩波（图1）。在基线条件下，使用氯胺酮-赛拉嗪麻醉的正常小鼠心率为280 ± 24，Pmax为107 ± 8，Pmin为5 ± 1，EDP为14 ± 2，dP/dtmax为6081 ± 365，dP/dtmin为5230 ± 526。
如图2所示，在正常小鼠中，左心室压（LVP）和心率（HR）随着多巴酚丁胺输注而逐渐升高，并在停止输注后恢复正常。如预期所示，所评估的所有血流动力学参数均以多巴酚丁胺剂量依赖性方式增加（图3）。因此，多巴酚丁胺的变时性效应（HR升高）和正性肌力效应（LVP和dP/dtmax升高）得以显现。
与正常小鼠相比，在高脂饮食诱导的肥胖小鼠中，当心脏应激被诱导时，心率（H...

我们描述了在正常小鼠中通过多巴酚丁胺诱导并由心脏导管插入术监测的心脏应激试验的操作方案。同时，我们展示了该方法在高脂饮食诱导的肥胖小鼠中揭示隐匿性心脏疾病的应用。

多巴酚丁胺是一种β-肾上腺素能受体激动剂，对心脏中表达的β1受体的亲和力高于对其他组织中表达的受体的亲和力……

通过多巴酚丁胺诱导并由心脏导管术监测的小鼠心脏应激试验。在本视频中，我们将逐步介绍在正常小鼠中进行的多巴酚丁胺诱导、心脏导管术监测的心脏应激试验操作流程。我们还将展示该方法在高脂饮食诱导的肥胖小鼠中用于揭示隐匿性心脏疾病的应用。将麻醉后的小鼠置于温度可控的加热板上。通过塑料管提供氧气，并使用直肠探针监测体温，以进行心脏导管插入术。在闭胸操作中，采用颈动脉作为入路，因导管尖端的压力传感器足够纤细，可进入动脉以测量动脉压。导管插入约10毫米。动脉压力波形如下所示。为测量心室压力，导管应沿ER直线路径前进，并穿过主动脉瓣进入心室腔。当压力传感器进入心室腔以给予多巴酚丁胺时，压力波形发生变化。将一根塑料管插入颈静脉。药物由程序化泵输注，以逐步递增的方式注入溶液。心脏负荷试验基于多巴酚丁胺对心脏的正性肌力和正性变时作用，用于评估心脏功能。双域刺激是一种强有力的工具，可用于揭示心脏中看似正常但实际存在临床疾病的状况，这些病变在常规条件下难以被发现。现在，我们将向您展示如何设置 S 仪器，如何进行心脏导管插入和多巴酚丁胺输注，以及如何收集和分析数据。所展示的所有动物实验方案均已获得 fta 伦理委员会批准。准备多巴酚丁胺输注液：稀释多巴酚丁胺储备液的等分试样。每毫升含500微克的0.9%氯化钠溶液。工作液的浓度通过以下公式计算：多巴酚丁胺微克/毫升 = 体重 × 0.2。用1毫升29号半英寸针头注射器吸取溶液，并将一根20厘米长的P 10管插入注射器针头中。根据制造商说明调整输液泵中的注射器。以逐步递增的方式设置梯度输注，在本例中共分为六步，每步增加 10 µL/min。准备压力传感器。将压力传感器浸入37摄氏度的水中至少15分钟，以尽量减少信号漂移。浸没导管时深度不得超过0.5厘米，以防止静水压力对压力传感器产生电子干扰。在25和100毫米处对压力传感器进行校准。汞压力传感器的电信号输入被转换为以毫米汞柱为单位的压力信号。将采样率设置为每秒2000次，并使用截止频率为100赫兹的低通滤波器。将压力信号调零至0毫米汞柱。从导管尖端起始处标记 15 毫米位置。在插入导管时，建议明确导管距离左心室的接近程度。进行小鼠导管术前准备时，应根据体重以每克体重 60 微克的剂量给予氯胺酮，以及每克体重 4 微克的赛拉嗪进行麻醉。然后使用电动剃须刀剃除其颈部毛发。将麻醉后的小鼠仰卧置于预热的等温加热板上，用纸胶带固定其四肢。建议使用凡士林润滑探头。轻柔插入直肠探头以监测体温。通过脚趾夹捏测试确认小鼠是否完全镇静。若体温偏离37摄氏度±0.5摄氏度，需通过加热板进行调节。将小鼠的鼻部靠近氧气供应源。将氧气流量调节至每平方英寸三磅。将小鼠颈部区域置于体视显微镜下。心脏导管插入术。用剪刀在右侧下颌附近做一个小切口。分离皮肤和肌肉结缔组织。沿气管右侧进行纵向解剖。使用弯头镊子分离结缔组织、脂肪

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