减薄颅骨皮层窗技术 体内 光学相干断层成像

本实验方案的总体目标是在小鼠模型中制备薄颅骨颅窗，以实现对大脑的活体光学相干断层扫描成像。首先对动物进行麻醉并做好手术准备，随后使用不同类型的牙科磨头对颅骨进行打磨减薄。

最后一步是通过薄颅骨颅窗在活体中获取大脑的OCT图像。最终，可以从所得的OCT图像中获得大脑的结构和功能信息。与现有的开颅术或盖玻片颅窗等方法相比，该技术的主要优势在于，薄颅骨颅窗侵入性更小，更有可能保持大脑的生物学完整性和活性。

该技术的应用前景涉及神经系统疾病的诊断，因为光学相干断层扫描（OCT）具有高空间和时间分辨率，并且与共聚焦显微镜和双光子显微镜相比，具有更优的组织穿透深度。通常，初次使用该方法的研究人员在制备均匀且薄的颅骨表面时会遇到困难，容易导致颅骨骨折或硬脑膜下出血。开始此操作前，需对一只6至8周龄的CD小鼠通过腹腔注射给予氯胺酮和赛拉嗪混合物进行麻醉。

然后将小鼠置于恒温垫或保温毯上，以确保手术准备期间体温维持在约37摄氏度的适宜水平；通过检测动物的反射持续监测麻醉深度，并在必要时追加麻醉剂。接着，用人工泪膏润滑双眼。使用电推剪去除头皮上的毛发。

然后用纱布垫或棉签清除残留的剪余毛发。之后，在头皮上涂抹一层薄薄的脱毛膏。两分钟后，使用生理盐水浸湿的棉签和酒精消毒片轻轻擦去脱毛膏及残留毛发。

现在使用碘伏棉签对头皮进行消毒，并用70%乙醇擦拭垫清洁。然后将动物固定在立体定位仪上以固定头骨。轻敲头骨以确认其稳定性。

在此操作中，从两眼之间的中点处开始做头皮切口。继续沿中线向两耳之间的中点延伸，用镊子牵起皮瓣。接下来，在解剖显微镜下确定需要减薄的区域。

使用镊子刮除颅骨以去除任何残留的筋膜。然后用无菌棉签擦干颅骨，再于前囟后方及外侧约一毫米处制作一个四乘四毫米的薄皮质窗。使用带有圆形碳化钨钻头的外科手钻，以轻柔的扫动方式磨薄颅骨。

切勿对颅骨施加直接压力。每钻孔20至30秒后暂停一次，使用无菌生理盐水和棉签清除骨屑，并避免颅骨过热。生理盐水还有助于将热量分散至整个颅骨。

当致密骨的外层被完全去除后，应可见中间的松质骨层。由于松质骨层中的血管更为明显，可能会出现轻微出血。此时应更换为绿色砂石钻头，并格外小心地继续钻孔。

由于疏松层较为脆弱，使用绿色石钻头可在确保颅窗均匀的同时去除更少的骨质。钻孔过程中应不时暂停，以清除骨屑并冷却颅骨。最后，当颅骨变得较为透明且脑部血管清晰可见时，开始用抛光钻头对颅骨进行抛光，并用镊子轻轻敲击颅骨以检查其厚度，当达到所需厚度时停止抛光。

当颅骨变得略有弹性时，此时减薄的颅骨窗口应完全平滑且具有反光性，可进行成像。由于脑组织属于高度散射性组织，为获得最佳的成像穿透深度，颅骨应减薄至至少55微米。手术完成后，通过视觉观察动物的呼吸频率和反射情况，以确认麻醉水平是否适当，必要时追加麻醉剂。随后将动物置于OCT相机下，并将减薄颅骨的颅窗部位对准光学光束。

现在可以观察到颅骨和大脑的横截面视图。数据采集可以开始。一旦确定了用于成像的目标区域，我们便将OCT光束扫描过一个宽度为4.0毫米的皮层成像窗口，并在入射功率为六毫瓦、焦点位于薄颅骨下方0.1毫米处的条件下，获得两毫米的成像深度。

每个横截面由2048次轴向扫描组成，图像采集速率为每幅图像0.14秒。该特定方法使我们能够识别OCT横截面图像中的特定结构。此图显示了在正常颅骨下的大脑皮层的旁矢状位OCT图像，此处显示了在薄颅骨下的旁矢状位OCT图像。

与正常颅骨相比，薄颅骨颅窗下脑部结构在视觉上更为明显。此外，还可获取冠状面的光学相干断层成像（OCT）横截面图像，以辅助识别中线结构。通过使用两组检流计振镜（galvo mirrors）进行XY扫描，其中第一组检流计振镜使光束在矢状方向扫描，第二组检流计振镜在冠状方向扫描，从而采集一系列二维横截面图像，获得脑部的三维容积扫描图像。

一旦掌握，该技术可在10分钟内完成，前提是操作得当。在实施该过程时，重要的是要均匀地磨薄颅骨，以确保在OCT成像期间有充分的信号穿透。观看本视频后，您应能充分理解如何为OCT成像制备薄颅骨皮层窗。