全山RNA荧光杂交果蝇胚胎
2013年1月30日
在这里，我们描述了一个全型日光灯果蝇。
该程序描述了一种优化的 fish 方法，用于评估 RNA 在整个果蝇胚胎中的表达和定位特征。这是通过首先合成标记的 RNA 探针来实现的，该探针与感兴趣的 Mr NA 或非包被 RNA 互补，通过适当选择的 DNA 模板的体外转录来实现。同时，苍蝇群笼用于收获、固定和渗透所需发育阶段的胚胎。
经过几个固定后步骤后，胚胎与标记的反义 RNA 探针杂交。最后，在对样品进行充分洗涤后，通过使用特异性抗体和荧光染料偶联检测试剂进行免疫标记来检测杂交探针，从而提供靶标 RNA 分布的灵敏读数。最终，结果产生高分辨率的荧光信号，通过标准荧光显微镜分析这些信号，以记录果蝇胚胎发生过程中靶 RNA 的空间和时间表达特征。
与现有方法（如 Northern 印迹或 R-T-P-C-R）相比，该技术的主要优点是可以评估完整组织标本中的 RNA 表达。虽然该方法旨在分析早期果蝇胚胎中的 RNA 表达特性，但它也可用于分析从幼虫或成蝇解剖的组织在发育后期的胚胎。我们程序的一个重要方面是增加样本数量，我们可以通过在 PCR 位置进行捕鱼来实现，这大大提高了该方法的通量。
演示此程序的实验室成员包括本科生研究阻力、研究生和博士后研究员。从喂养良好的种群笼开始。用苹果汁酵母板替换板，将果蝇在 25 摄氏度下放置一个小时。
然后更换苹果汁酵母板以收获早期胚胎。将笼子在 25 摄氏度下孵育，等待胚胎达到所需的发育阶段，同时在化学罩中等待，混合化学品，在玻璃吸入瓶中生成 37% 的甲醛。将溶液煮沸，直到 PFA 粉末完全溶解。
然后将其冷却至室温并过滤到新的闪烁瓶中。接下来，准备双相固定溶液。将 PBS 与 37% 甲醛混合在闪烁瓶中，然后在准备好时加入庚烷。
在室温下从苹果汁盘中收获胚胎，自来水，然后用细画笔进行精细清扫。将重悬的胚胎转移到篮子中，用温水冲洗。现在将篮子浸泡在新鲜的 3% 漂白剂溶液中，将胚胎涂布 90 秒。
然后用温水去除漂白剂，直到漂白剂的气味消失。要收集胚胎，请拆卸收集篮，轻轻地将胚胎转移到双相固定溶液中。使用画笔，胚胎将在 PBS 和庚烷层之间的界面处积累。
现在密封闪烁瓶，将它们固定在涡旋混合器上，并以最低设置摇晃 20 分钟。摇动后，使用牧场移液器丢弃大部分下 PBS 和上 Heane 相。然后将剩余的混合物吸出移液器中，小心地退出下期，而不会丢失胚胎。
将胚胎存入含有 500 微升庚烷和 500 微升甲醇的双相溶液的 1.5 毫升试管中。用力摇晃试管 30 到 45 秒，使髌骨膜破裂。一旦破裂，胚胎就会沉入甲醇中。
丢弃上层和未裂解的胚胎，加入 1 毫升甲醇。现在短暂摇晃试管 5 秒钟，然后用甲醇洗涤胚胎 3 次。洗涤后，胚胎可以在零下 20 摄氏度下储存几个月。
首先向每个胚胎中加入 500 μL PK，并在室温下孵育样品 10 分钟，不要摇晃。要非常小心，以免用蛋白质 a k 过度消化样品，或通过草率的作来损坏样品。在 PK 孵育期间，用移液管喷射每两分钟混合一次胚胎。
10 分钟后，将胚胎放在冰上一小时。一小时后，在室温下去除 PK 溶液。用甘氨酸在 PBT 中洗涤胚胎两次，每次 2 分钟。
现在，将样品放入 1 毫升 3.7% 甲醛的 PBT 溶液中，摇动 20 分钟。在 PBT 中用五次漂洗洗去甲醛。然后用 1 毫升等体积的 PBT 和 HI 溶液冲洗胚胎，并用 0.5 至 1 毫升的纯溶液替换混合物。
此时，胚胎可以在零下 20 摄氏度下储存数天到数周。在 96 孔板中，每孔分装 10 至 15 μL 沉淀的胚胎。使用宽口径尖端以避免损坏胚胎。
现在，通过煮沸每个样品 100 μL Hype 溶液来制备预杂交溶液。将 Pre-Hype 溶液在冰上冷却 5 分钟，然后向包含胚胎样品的每个板孔中加入 100 微升。检索通过 NanoDrop 分光光度计定量的制备的 RNA 探针。
此外，为了验证探针的质量，请在农用凝胶上运行 1 到 2 微升探针。现在对于每个样品，在 100 微升 HI 溶液中稀释约 100 ng 探针。在无 RNA 的条件下工作至关重要。
处理探头时。将溶液加热至 80 摄氏度 3 分钟。然后在冰上冷却至少五分钟。
它可以保持冷却几个小时。取回板并通过抽吸从胚胎中取出 Pre-Hype 溶液。然后向每个中加入 100 微升带有 RNA 探针的 hype 溶液。
第二天在 56 摄氏度下将探针杂交 12 至 16 小时。一系列五种溶液在 56 摄氏度处预热。第一个是纯炒作解决方案，最后一个是纯 PBT。
其他三种是将 HI 稀释到 PBT 中。加热后，用纯 hype 溶液快速冲洗样品一次。接下来，进行 3 次 15 分钟的洗涤，从稀释度最低的 hype 溶液开始，然后是每个连续稀释的溶液。
最后，在纯 PBT 中洗涤样品 4 次，每次 5 分钟。然后将样品加热至室温。现在继续进行抗体应用以检测探针以改善样品混合。
在这些步骤中，可以将板放置在一个小盒子中，该盒子可以使用所描述的方案连接到突变混合器，在胚胎发生的不同阶段分析经典的配对规则基因 runt。鱼类分析揭示了胚胎第四阶段胚胎中期的初始广泛表达是如何细化为分段条纹图案的。在后期阶段，使用各种 diggen 和标记的反义 RNA 探针与 0 到 4 小时大的果蝇胚胎杂交进行捕鱼。
通过与生物素化抗原和 HRP 和神经酰胺中的抗体 strep avid 连续孵育来检测杂交探针。样品被封片并通过荧光显微镜分析。在这些第 4 到第七阶段的胚胎中观察到了广泛的鱼类结果在尝试此程序时，重要的是在各个步骤中采取预防措施，例如通过在无 RNA 的条件下工作和使用无 RNA 的供应来保护 RNA 探针和降解。
一旦掌握了这个基本知识，就可以在方法中添加额外的步骤来进行多标记体验，以便在同一样品中可视化不同的 RNA 或特定蛋白质标记物。观看此视频后，您将对如何在 C 2 杂交中进行荧光，以便在果蝇胚胎发生 Happy Fishing 期间记录您最喜欢的 RNA 的表达或亚细胞定位动力学有一个很好的了解。
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概述
本文介绍了一种全胚胎荧光原位杂交（FISH）的协议，用于分析果蝇胚胎发育过程中RNA的表达和定位。该方法能够详细地显示胚胎中的RNA分布，有助于我们理解发育过程。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 发育生物学
- 基因表达
背景
- 荧光原位杂交（FISH）是一种用于研究RNA的强大技术。
- 果蝇是发育生物学的模式生物。
- 理解RNA定位对于洞察胚胎发育过程中的基因调控至关重要。
- 该协议提高了RNA检测的灵敏度和分辨率。
研究目的
- 开发适用于果蝇胚胎的优化FISH方法。
- 评估特定RNA在发育过程中的表达和定位。
- 为该领域的研究人员提供详细的方法学。
使用的方法
- 通过体外转录合成标记的RNA探针。
- 收集、固定和使果蝇胚胎渗透化。
- 用标记的反义RNA探针使胚胎杂交。
- 使用免疫标记和荧光显微镜检测杂交的探针。
主要结果
- 成功地在全胚胎中显示RNA分布。
- 高分辨率的荧光信号指示了RNA定位。
- 对目标RNA的空间和时间表达模式的洞察。
- 该方法已在发育研究中得到验证。
结论
- 优化的FISH协议对于研究果蝇胚胎中的RNA是有效的。
- 该技术可以增强我们对发育过程中基因表达的理解。
- 未来的应用可能包括探索其他模式生物中的RNA动力学。
常见问题
Executive Industry Relevance
Whole-mount RNA FISH enables direct visualization of target RNA expression and subcellular localization in intact tissue, providing mechanistic insights into gene function during development. This approach supports target validation by confirming spatial and temporal expression patterns critical for hypothesis-driven discovery. The method enhances predictive confidence in early-stage target selection by linking RNA localization to phenotypic outcomes in a genetically tractable model.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by revealing where and when target RNAs are expressed in developing embryos.
- Operational Value: Uses sequence-specific antisense RNA probes to enable broad applicability across targets without prior structural knowledge.
- Predictive Value: Supports biological de-risking by validating target expression in disease-relevant developmental contexts.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, spatially resolved RNA distribution data suitable for assay standardization.
- Operational Value: Employs tyramide signal amplification to enhance sensitivity and reproducibility of detection.
- Scalability: Utilizes 96-well PCR plate format for high-throughput processing of staged embryos.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects embryonic RNA expression patterns to later developmental stages and tissue-specific functions.
- Mechanistic De-risking: Clarifies subcellular localization of RNAs to inform functional target validation.
- Predictive Confidence: Enables correlation of RNA dynamics with phenotypic observations during embryogenesis.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical assessment by providing spatially resolved RNA expression data that informs target selection and mechanistic understanding.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through direct visualization of RNA expression in intact embryos.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts via fluorescence microscopy for comparative condition analysis.
- Analytics: Produces high-resolution fluorescent signals enabling spatial and temporal quantification of target RNA.
- Translational Research: Links embryonic expression patterns to larval and adult tissue contexts for continuity in target validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable FISH workflow applicable across multiple RNA targets and developmental timepoints.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic de-risking through direct visualization of RNA localization in native tissue context.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized fixation, hybridization, and detection steps in a multiwell format.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by confirming target expression in biologically relevant systems.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated spatiotemporal expression profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, embryology, and fluorescence microscopy.
- Needs infrastructure for in vitro transcription, embryo handling, and signal amplification detection.
- Demands RNase-free conditions and specialized reagents for probe synthesis and hybridization.
- Involves optimization considerations for probe concentration, hybridization time, and washing stringency across target RNAs.
- Includes practical limitations related to embryo permeability and accessibility of certain subcellular compartments.
