Name: 一个 em在体内 /em分析测试血管通透性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: 学习使用伊文思蓝染料结合白蛋白在小鼠体内检测血管通透性的方法。该实验通过静脉注射和光谱分析评估内皮细胞完整性，为研究血管疾病机制提供可靠的定量工具。

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本工作获得了美国国立卫生研究院资助项目 R01CA142928 的支持。

1. 小鼠尾侧静脉内注射伊文思蓝
	<ol>
	 <li>配制0.5%的伊文思蓝PBS无菌溶液。如有必要，通过滤膜除菌以去除未溶解的颗粒物质。</li>
 <li>用注射器吸取200 μl伊文思蓝溶液，避免吸入可能进入注射器的气泡。</li>
 <li>将8至12周龄的小鼠放入固定装置中，使动物无法自由活动，但可操作其尾部。</li>
 <li>将小鼠固定装置侧放，使侧尾静脉清晰可见并朝上。</li>
 <li>用非惯用手的拇指和食指夹住小鼠尾巴。</li>
 <li>以10–15度角将针头（细针头，27–30号）斜面向上刺入侧尾静脉，并朝头部方向推进。保持针头和注射器与尾巴平行。</li>
 <li>不要施加回拉压力以确认位置是否正确，以免导致静脉塌陷。</li>
 <li>缓慢向小鼠尾静脉注射200 μl伊文思蓝溶液。</li>
 <li>观察推注活塞时的顺畅程度，这是判断针头是否正确进入静脉的依据。</li>
 <li>将小鼠放回笼中，并观察30分钟。</li>
</ol>
2. 器官采集及器官中伊文思蓝的提取
	<ol>
	 <li>通过颈椎脱位处死小鼠。出于Miles实验的目的，推荐使用颈椎脱位法，因其可最大限度减少对血管通透性的显著干扰。应尽可能同时处死所有小鼠。每次操作应使用6只或更少的小鼠，因为死亡后不久血管通透性会增加。</li>
 <li>将小鼠仰卧放置，并用针固定其四肢于白色板上。</li>
 <li>切开腹腔和胸腔，暴露胸腔和腹腔器官。</li>
 <li>拍摄具有代表性的照片以显示伊文思蓝外渗的差异。应将所有小鼠置于同一视野内，以确保各小鼠的光照条件一致。</li>
 <li>采集目标器官并放入1.5 ml离心管中。</li>
 <li>称量一个空管，并将天平归零。</li>
 <li>转移组织样本并称重。对所有组织样本重复此步骤。可将组织风干以消除不同器官间水分含量的差异。</li>
 <li>向每份组织样本管中加入500 μl甲酰胺。</li>
 <li>将所有离心管置于55 °C水浴或加热块中，孵育24–48小时，以从组织中提取伊文思蓝。</li>
</ol>
3. 间质组织中伊文思蓝外渗的定量
	<ol>
	 <li>离心甲酰胺/伊文思蓝混合液，以沉淀任何残留的组织碎片。</li>
 <li>在610 nm处测定吸光度。以500 μl甲酰胺作为空白对照。</li>
 <li>计算每毫克组织外渗的伊文思蓝含量（ng）。</li>
 <li>将所有数据绘制成图表。</li>
 <li>进行统计学分析以确定显著性差异。</li>
</ol>

<ol><li>Beck, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+NO+synthase%3A+role+in+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Inducible NO synthase: role in cellular signaling.</a> J. Exp. Biol. 202, 645-653 (1999).</li>
<li>Bertglia, S., Giusti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+nitric+oxide+in+capillary+perfusion+and+oxygen+delivery+regulation+during+systemic+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Heart+Circ.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of nitric oxide in capillary perfusion and oxygen delivery regulation during systemic hypoxia.</a> Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 288, H525-H531 (2005).</li>
<li>Miles, A. A., Miles, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+reactions+to+histamine%2C+histamine-liberator+and+leutaxine+in+the+skin+of+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol.+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Vascular reactions to histamine, histamine-liberator and leutaxine in the skin of guinea pigs.</a> J. Physiol. (London). 118, 228-257 (1952).</li>
<li>Weis, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+permeability+in+cardiovascular+disease+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Hematol%22%5BJournal%5D)">Vascular permeability in cardiovascular disease and cancer.</a> Curr. Opin. Hematol. 15, 243-249 (2008).</li>
<li>Kumar, P., Shen, Q., Pivetii, C. D., Lee, E. S., We, M. H., Yuan, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+endothelial+hyperpermeability%3A+implications+in+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev.+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of endothelial hyperpermeability: implications in inflammation.</a> Expert Rev. Mol. Med. 30, 11-19 (2009).</li>
<li>Viazzi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+permeability%2C+blood+pressure%2C+and+organ+damage+in+primary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertens.+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular permeability, blood pressure, and organ damage in primary hypertension.</a> Hypertens. Res. 31, 873-879 (2008).</li>
<li>Scheppke,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+vascular+permeability+suppression+by+topical+application+of+a+novel+VEGFR2%2FSrc+kinase+inhibitor+in+mice+and+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Retinal vascular permeability suppression by topical application of a novel VEGFR2/Src kinase inhibitor in mice and rabbits.</a> J. Clin. Invest. 118, 2337-2346 (2008).</li>
<li>Blanchet, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+CD34+Leads+To+Exacerbated+Autoimmune+Arthritis+through+Increased+Vascular+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Loss of CD34 Leads To Exacerbated Autoimmune Arthritis through Increased Vascular Permeability.</a> J. Immunol. 184, 1292-1299 (2010).</li>
<li>Dvorak, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mast+cell-derived+mediators+of+enhanced+microvascular+permeability%2C+vascular+permeability+factor%2Fvascular+endothelial+growth+factor%2C+histamine%2C+and+serotonin%2C+cause+leakage+of+macromolecules+through+a+new+endothelial+cell+permeability+organelle%2C+the+vesiculo-vacuolar+organelle%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Immunol.+Allergy%22%5BJournal%5D)">Mast cell-derived mediators of enhanced microvascular permeability, vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor, histamine, and serotonin, cause leakage of macromolecules through a new endothelial cell permeability organelle, the vesiculo-vacuolar organelle.</a> Chem. Immunol. Allergy. 85, 185-204 (2005).</li>
<li>Le Guelte, A., Gavard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelial+cell-cell+junctions+in+endothelial+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of endothelial cell-cell junctions in endothelial permeability.</a> Methods Mol. Biol. 763, 265-279 (2011).</li>
<li>Martins-Green, M., Petreaca, M., Yao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+assay+system+for+in+vitro+detection+of+permeability+in+human+%22endothelium%22%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">An assay system for in vitro detection of permeability in human "endothelium".</a> Methods Enzymol. 443, 137-153 (2008).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突或竞争性经济利益。

血管通透性是反映血管状态的关键指标。研究表明，多种全身性疾病（包括糖尿病、高血压和自身免疫性疾病）均存在血管通透性增加的现象6,7,8。血管通透性增加已被证实由剪切应力、血管内皮生长因子和成纤维细胞生长因子等生长因子，以及5-羟色胺、组胺和缓激肽等炎症介质介导9。水和小分子的外渗被认为通过内皮细胞之间的微小间隙进行。细胞间连接的强度由分子间的相互作用严格调控10。
在生理条件下，内皮对水和离子具有通透性，而对蛋白质则不透。因此，在无炎症刺激的情况下，白蛋白被限制在血液中，不会进入细胞外液。通过注射可与白蛋白结合的染料伊文思蓝，我们可以监测蛋白质从血液渗漏至间质组织的程度。
该检测方法的一种改进版本使用了荧光标记的微球。通过采用不同尺寸的微球或不同分子量的荧光标记葡聚糖（4–70 kDa），可更准确地评估内皮细胞损伤的程度。然而，这种方法失去了直接观察的便利性，需要对组织进行固定，并通过荧光显微镜成像，或使用荧光酶标仪进行检测。
<p class="jov...

选择性通透屏障的形成与维持对于器官的正常发育和功能至关重要 1,2内皮细胞排列在血管腔表面，形成半透性屏障，在血液与所有器官间质空间之间的选择性物质运输中起关键作用。通过生长因子、细胞因子及其他应激相关分子的严格调控，细胞间紧密连接维持了适当的通透性屏障。 3内皮细胞屏障的破坏可导致通透性增加和血管渗漏。这些效应出现在多种疾病状态下，对其潜在分子信号机制的理解需要采用多学科方法。 4,5在本文中，我们描述了一种 体内 利用小鼠模型测量血管通透性的方法
我们所描述的实验，又称 Miles 实验，是一种用于检测血管通透性的成熟方法 体内该检测基于以下事实：在基础生理条件下，白蛋白不会穿过内皮屏障。将一种对白蛋白具有高亲和力的偶氮染料——伊文思蓝注入实验动物的血液循环中，在生理条件下，其应被限制在血管内部。当施加血管通透性刺激物（无论是局部还是全身给药）时，血管开始渗漏蛋白质，从而导致与白蛋白结合的伊文思蓝也随之渗出。这会使具有通透性血管的组织迅速呈现蓝色着色。
小鼠尾侧静脉染料注射的成功对于实验的良好结果至关重要。尾静脉注射技术需要大量练习，应在开始实验前熟练掌握。
 血管通透性高度依赖于动物的年龄和体重，因此在比较不同小鼠品系时，必须确保小鼠或其他实验动物的出生日期和体重尽可能一致。影响内皮屏障通透性的其他因素包括环境条件，如温度、湿度，以及非常重要的小鼠操作过程中的应激。由于多种因素可能影响实验结果，建议实验至少重复三次，并进行统计学分析。 
该实验可用于比较经基因修饰的小鼠以及具有不同遗传背景的小鼠的血管通透性。根据所调控基因的功能，可在有或无刺激物的条件下评估通透性。该实验也可用于检测不同化合物对血管通透性的影响。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>伊文思蓝（EVANS BLUE）</td><td>SIGMA</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺（FORMAMIDE）</td><td>INVITROGEN</td><td>15515-026</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>0.2 M 磷酸盐缓冲液&lt;br/&gt; 1.5 M NaCl&lt;br/&gt; pH 7.4</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>分光光度计（SPECTROPHOTOMETER）</td><td>EPPENDORF</td><td>952000006</td><td></td></tr><tr><td>小鼠固定装置（MOUSE RESTRAINT DEVICE）</td><td>HARVARD APPARATUS</td><td>340012</td><td></td></tr><tr><td>注射器（SYRINGE）</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>针头（NEEDLES）</td><td>BD</td><td>305106</td><td>针头的规格取决于动物的大小。</td></tr><tr><td>天平（BALANCE）</td><td>DENVER INSTRUMENT</td><td>TP-64</td><td></td></tr></tbody></table>

一个 体内 检测血管通透性的实验方法

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

该方法基于在小鼠这一实验动物模型中进行伊文思蓝的静脉注射。伊文思蓝是一种可与白蛋白结合的染料。在生理条件下，血管内皮对白蛋白具有不透性，因此与白蛋白结合的伊文思蓝被限制在血管内部。在某些促进血管通透性增加的病理条件下，内皮细胞部分失去紧密连接，导致内皮层对白蛋白等小分子蛋白质变得可透。这种情况使得伊文思蓝渗出至周围组织。健康的内皮可防止染料向邻近血管化组织的外渗。与内皮完整的器官相比，通透性升高的器官会表现出显著增强的蓝色着色。血管通透性水平可通过肉眼观察，或通过定量测定对照组与实验组动物/组织每毫克组织中所摄取染料的量来进行评估。该检测方法的两个显著优势在于其操作简便性和可定量性。可通过将特定质量的组织在甲酰胺中孵育，从而将伊文思蓝从组织中提取出来。伊文思蓝的吸收峰最大值位于620 nm，最小值位于740 nm。利用伊文思蓝的标准曲线，可将光密度测量值转换为每毫克组织所捕获的染料毫克数。应采用统计学分析来评估血管通透性之间的显著差异。

我们采用体内通透性实验检测8至12周龄小鼠的血管渗漏情况。该实验适用于比较不同遗传背景动物之间，或经不同处理后同一品系小鼠的血管通透性差异。我们的结果显示，我们在实验室中构建的一种基因修饰小鼠品系，其内皮通透性高于野生型小鼠。这些变化在多种器官中均能在宏观水平上观察到（图1）。
我们能够通过分光光度法测定每克组织中捕获的伊文思蓝量，从而量化不同器官中血管通透性的差异。如图2所示，不同器官对通透性诱导信号的反应不同，因此表现出不同的染料蓄积情况。这也与不同组织中血管化程度的高低有关。
<img src="/files/ftp_upload/50062/50062fig1.jpg" alt="小鼠伊文思蓝外渗比较；WT 与 KO，胸主动脉环，血管通透性。" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50062/500...

我们正在介绍一种用于检测血管通透性的体内实验方法。该方法基于静脉注射染料，随后观察其向间质空间的扩散情况。

该方法基于在小鼠这一实验动物模型中进行伊文思蓝的静脉注射。伊文思蓝是一种可与白蛋白结合的染料。在……

本视频介绍了一种用于检测血管通透性的活体实验方法。在小鼠体内，内皮细胞排列于血管内壁，形成一层半透性屏障。在生理条件下，内皮层对大多数蛋白质具有不透性，从而将这些蛋白质限制在血流中。在促进血管通透性增加的病理条件下，内皮细胞部分失去彼此间的接触。内皮层对白蛋白等小分子蛋白质变得通透。在本实验中，我们在内皮通透性增加的条件下，通过静脉注射一种可与白蛋白结合的蓝色染料。D穿过内皮屏障并扩散到间质空间。最终在实验开始前导致受累组织呈现蓝色。准备所有所需材料、移液管和无菌吸头。伊文思蓝、无菌刮勺、无菌PBS、无菌注射器及针头。小鼠、小鼠固定器、解剖器械、解剖板和大头针。天平，用于55摄氏度水浴的加热块。使用C.Vet分光光度计称量伊文思蓝粉末，并转移至无菌管中。加入无菌PBS，配制成0.5%的工作浓度。用注射器缓慢吸取200微升伊文思蓝溶液。避免产生任何气泡，并清除注射器中残留的气泡。将小鼠放入固定装置中，使其身体不能自由移动，但尾巴可被操作。将固定装置侧放，使小鼠尾部侧面的静脉清晰可见并朝向上方。用非优势手的拇指和食指夹住尾巴。在尾巴根部施加压力，使其起到止血带的作用。以10度角插入针头。斜面向上，推进进入静脉。保持针头和注射器与尾巴平行。不要施加回拉压力以确认针头在静脉内的正确位置。由于这可能会导致血管塌陷，因此应缓慢向尾部注射200微升伊文思蓝溶液。观察注射器活塞推进的顺畅程度，这可作为针头正确进入血管的证据。如果针头位置正确，拔出针头后会出现少量血液滴出。在排出部位施加压力，直至出血停止。将小鼠放回笼中，观察30分钟。处死小鼠后，将其固定于白板上。本视频中，我们展示了一只对照小鼠和一只经过基因改造、缺失调控内皮完整性的基因的小鼠。打开腹腔和胸腔以暴露器官，收集感兴趣的器官并放入EP管中，然后在丢弃小鼠尸体前完成操作。确保获取所有目标器官的代表性图片。标记一套新管子，称量一支空管的质量，将天平归零，然后将组织样本转移至管中并称重。所有样品均重复上述步骤。向每支试管中加入 500 µL 螨虫样本。将所有试管转移至 55 °C 的加热块或水浴中。孵育24至48小时，以从所有组织中提取伊文思蓝，并在600纳米波长处测定吸光度。使用500微升IDE作为空白对照。测定每个样品的光密度。在此步骤中，可轻松观察到血管通透性的显著差异。计算每毫克组织中渗出的伊文思蓝纳克数。将所有数据绘制成图表。他们在实验开始前用于检测小鼠血管通透性的方法，也称为 M 检测法。尾静脉注射技术应熟练掌握，因为该技术需要大量练习。结果应以静态图像和定量测量两种形式记录，并始终伴随分子分析。血管通透性高度依赖于动物的年龄、体重以及环境条件。因此，实验应至少重复三次，并进行统计学分析。

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已修改 体内 用于血管生成研究的基质凝胶栓塞实验

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