以人血红蛋白作为铁源培养Staphylococcus aureus

本实验检测金黄色葡萄球菌利用人血红蛋白作为唯一铁源的能力。首先，从新鲜的人血中分离红细胞。通过高效液相色谱法纯化血红蛋白，以确保血红蛋白的完整性。

接下来，将血红蛋白加入去铁培养基中，以血红蛋白形式提供铁元素，随后在含有血红蛋白的条件下培养 S. reus，检测其利用血红蛋白作为铁源的能力。

结果表明，金黄色葡萄球菌在以血红蛋白作为唯一铁源的条件下能够增殖。该方法有助于解答微生物学领域的一些关键问题，例如病原体是否能够利用宿主蛋白作为铁源，以及在此过程中所需的作用机制。因此，该方法可为金黄色葡萄球菌从血红蛋白中获取铁的机制提供深入见解。

该方法也可用于研究其他细菌及其如何利用宿主含铁蛋白。本实验技术将由我实验室的GLA Ani和Catherine Haley进行演示。首先，获取新鲜分离的人类血液，加入抗凝剂，并全程在4°C条件下保存。通过离心（15,000 ×g，20分钟）沉淀红细胞。小心吸除上清液，将沉淀物轻柔地重悬于冰冻的0.9%氯化钠溶液中。经三次洗涤后，将沉淀物重悬于一体积的冰冻10毫摩尔Tris-HCl缓冲液中，利用渗透压裂解红细胞。

然后加入甲苯至终体积的20%，并在4°C下于旋转仪中孵育过夜。接着进行离心，以20,000 × g离心1小时。

收集中间的溶血液组分，保留上层甲苯层和沉淀物不受干扰。将溶血液通过0.44微米的注射器滤器过滤。如果溶液中含有颗粒物而无法通过滤器，则重复高速离心。

现在使用高效液相色谱阴离子交换柱纯化血红蛋白。采用10毫摩尔的三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）作为流动相A，采用含0.5摩尔氯化钠的10毫摩尔三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）作为流动相B。在2毫升/分钟的流速下，于2分钟内运行0%至100%的溶剂B梯度。

根据410纳米和280纳米处的吸收值监测洗脱过程。收集呈现鲜红色且具有明显吸收峰的组分。将洗脱液在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中透析约16小时。

为样本进行灭菌，需将其通过0.22微米的注射器滤器，以测定血红蛋白浓度。在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制HP标准溶液。随后，在96孔板中将标准溶液或样本溶液与两倍稀释的xra kins试剂按1:1比例混合，孵育15分钟后，在540纳米处测定吸光度。

绘制标准曲线并确定样品中血红蛋白（HP）浓度为每毫升5至15毫克。通常取15至20微克纯化的血红蛋白样品，在两块15% STS聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。将其中一块凝胶染色，另一块凝胶中的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上，用于血红蛋白的免疫印迹分析。将分离得到的血红蛋白以每毫升为一份分装，于液氮中冷冻保存。从冻存的金黄色葡萄球菌（S. aureus）菌种中，在胰酪大豆胨琼脂培养基（triptych soy agar）上划线接种，并在37°C下培养20至24小时。

将单菌落接种至含有E-D-D-H-A的5毫升RPMI培养基中，37摄氏度、180 RPM条件下振荡培养过夜。在7,500 G下离心5分钟，收集菌体。然后将细菌重悬于含有0.5毫摩尔E-D-D-H-A的RPMI培养基中，并调整浓度至OD600约为3。接着，配制含有2.5微克/毫升HB以及0.1至1毫摩尔E-D-D-H-A的N-R-P-M-I培养基，以螯合游离铁。

现在将10微升细菌悬液转接到含有E-DDH-A和HP的1毫升N-R-P-M-I培养基中，在37摄氏度下振荡培养最多48小时，每6至12小时以180 rpm振摇一次。取50微升培养物，与195微升PBS混合于96孔板中，测定OD600值。在此从溶血液中通过HPLC纯化人血红蛋白的过程中，检测洗脱液在280纳米和410纳米波长处的吸光度，其中第五组分含有血红蛋白。

通常，每次制备可获得每毫升5至15毫克的血红蛋白产量。纯化的血红蛋白通过SDS-PAGE进行重复分析，凝胶或用于蛋白质染色，或转至硝酸纤维素膜上进行免疫印迹。随后，检测纯化的人血红蛋白是否能够支持野生型 asus 及缺乏血红蛋白受体（该受体是获取血红蛋白来源铁所必需的）的 ASUS 的生长能力。

随着时间推移，培养物光学密度的增加表明，在添加了N-R-P-M-I、E-D-D-H-A和血红蛋白（hb）的培养基中，野生型ASUS能够增殖，而突变株则不能。相比之下，野生型和突变株利用外源游离铁的能力相同，且在缺乏铁源的情况下均无法增殖。在比较添加了从新鲜血液中纯化的血红蛋白与冻干血红蛋白的培养基时，只有从血液中纯化的血红蛋白需要ISDB才能支持细菌生长。

虽然冻干血红蛋白能够促进ISDB突变体的增殖，但一旦掌握正确方法，血红蛋白的纯化过程可在数小时内完成。请记住，献血者可能是血液传播病原体的潜在携带者，因此应将人血视为生物危害材料进行处理。