Name: 金黄色葡萄球菌生长使用人血红蛋白作为铁源 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-07T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: 了解金黄色葡萄球菌利用人血红蛋白作为唯一铁源的生长实验方法。通过高效液相色谱纯化血红蛋白，建立铁耗竭培养基，研究细菌铁获取机制，为开发抗感染治疗策略提供依据。

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本研究由美国国家过敏与传染病研究所（National Institute of Allergy and Infectious Diseases）提供的美国公共卫生服务基金 AI69233 和 AI073843 资助。E.P.S. 是传染病发病机制领域的伯纳姆基金会研究员（Burroughs Wellcome Fellow）。K.P.H. 受细胞与分子微生物学培训项目基金 5 T32 A107611-10 资助。

1. 从新鲜血液中纯化血红蛋白
<ol>
	<li>采集添加抗凝剂的新鲜人血。在整个纯化过程中将血液置于冰上或 4 °C 保存。</li>
	<li>在 1,500 × g 条件下离心血液 20 分钟。红细胞（RBCs）将沉淀于管底。小心吸除上清液，并用冰预冷的 0.9%（w/v）NaCl 溶液轻柔重悬沉淀。重复离心和洗涤 3 次。</li>
	<li>将沉淀重悬于 1 体积的冰预冷 10 mM Tris-HCl（pH 8.0）溶液中。由于渗透压作用，这将导致红细胞裂解。加入甲苯至终浓度约 20%（v/v）。</li>
	<li>在 4 °C 下旋转孵育过夜。</li>
	<li>在 20,000 × g 条件下离心裂解液 1 小时。收集中间的溶血液组分，保留顶部的甲苯层和底部沉淀不扰动。使用长颈移液管收集中间层。</li>
	<li>通过 0.44 μm 注射式滤器过滤。若溶液含有颗粒物而无法过滤，则重复步骤 1.5。</li>
	<li>使用高效液相色谱阴离子交换柱（Varian, PL-SAX 1,000 Å 8 μm, 150 mm × 4.6 mm）纯化血红蛋白（Hb）。流动相 A 为 10 mM Tris-HCl（pH 8.0），流动相 B 为 10 mM Tris-HCl（pH 8.0）+ 0.5 M NaCl。以 2.0 ml/min 流速在 2 分钟内执行 0%–100% 的 B 相梯度洗脱。通过吸收度（λ：410 nm 和 280 nm）监测洗脱过程。仅收集呈鲜红色且具有显著吸收峰的组分（图 1）。</li>
	<li>将洗脱液在磷酸盐缓冲液（PBS）中透析过夜，随后再继续透析数小时。通过 0.22 μm 注射式滤器过滤以实现无菌处理。</li>
	<li>为测定 Hb 浓度，使用 PBS 配制已知浓度的标准 Hb 溶液。通过将标准溶液（参见所用试剂表格）或样品溶液与 2× Drabkin 试剂（由粉末配制）按 1:1 比例混合来测定样品中 Hb 浓度。例如，在 96 孔板中混合 100 μl Hb 溶液与 100 μl 2× Drabkin 试剂。孵育 15 分钟后，在 540 nm 处测定吸光度。绘制标准曲线并据此确定样品中 Hb 浓度。典型产量为 5–15 mg/ml。</li>
	<li>取 15–20 μg 纯化的血红蛋白，在 15% SDS-PAGE 凝胶上进行双份电泳。染色其中一块凝胶；将另一块凝胶中的蛋白质转移至硝酸纤维素膜，并进行血红蛋白免疫印迹检测（图 2）。</li>
	<li>将 1 ml 血红蛋白分装液在液氮中速冻并储存。</li>
</ol>
2. 铁耗尽培养基的制备
<ol>
	<li>通过将RPMI粉末溶解于水中，按制造商建议加入碳酸氢钠和1%（w/v）的酪蛋白氨基酸（CA），配制RPMI培养基。使用0.2 μm滤器过滤除菌，冷藏保存。</li>
	<li>通过加入7%（w/v）Chelex 100并置于搅拌器上过夜混合，制备去金属RPMI（NRPMI）。用0.2 μm滤器过滤去除Chelex 100，冷藏保存。补充培养基中必需的非铁金属：预先配制无菌1,000倍浓缩液，包括25 μM ZnCl2、25 μM MnCl2、100 mM CaCl2和1 mM MgCl2。此步骤使用一次性塑料容器，以避免可重复使用器皿带来的铁污染。</li>
</ol>
3. 以血红蛋白作为唯一铁源培养Staphylococcus aureus
<ol>
	<li>从冻存菌种中将S. aureus划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）平板进行分离培养。在37 °C下孵育20-24小时。</li>
	<li>将乙二胺-N,N'-双(2-羟基苯基乙酸)（EDDHA）重悬于无水乙醇中，配制成100 mM溶液。EDDHA不会完全溶解，但可通过乙醇实现灭菌。</li>
	<li>将EDDHA加入RPMI培养基中，使其终浓度为0.5 mM。在进行下一步操作前，需让EDDHA至少溶解30分钟。由于不同批次之间存在差异，可能需要将EDDHA终浓度降低至0.25 mM，以允许细菌正常生长。</li>
	<li>挑取单个S. aureus菌落接种至含有EDDHA的5 ml RPMI培养基中，置于15 ml螺口锥形管内。在37 °C、180转/分钟（rpm）振荡条件下孵育16-20小时。</li>
	<li>将过夜培养物在7,500 × g条件下离心5分钟，弃上清后用含0.5 mM EDDHA的NRPMI培养基重悬菌体沉淀。调节菌液OD600至约3。</li>
	<li>配制含有每毫升2.5 μg血红蛋白（Hb）和0.1-1.0 mM EDDHA的NRPMI培养基。由于不同批次间的差异，螯合NRPMI中游离铁所需的EDDHA浓度可能会有所变化。</li>
	<li>取第3.5步中的细菌悬液10 μl，转接至含EDDHA和Hb的1 ml NRPMI培养基中，置于15 ml螺口锥形管内。</li>
	<li>将培养物在37 °C下孵育最多48小时，同时以180 rpm振荡或使用滚轴仪进行培养。</li>
	<li>每隔6-12小时，取50 μl培养物与150 μl PBS混合于96孔板中，测定OD600值。</li>
</ol>

<ol><li>Mazmanian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passage+of+heme-iron+across+the+envelope+of+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Passage of heme-iron across the envelope of Staphylococcus aureus.</a> Science. 299, 906-909 (2003).</li>
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<li>Neilands, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+envelope+proteins+related+to+iron%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbial envelope proteins related to iron.</a> Annual review of microbiology. 36, 285-309 (1982).</li>
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</ol>

我们无任何利益冲突需要披露。

铁是所有生命领域生物体所需的一种必需营养素15在脊椎动物中，铁元素会被隔离以避免其毒性作用。这种隔离作用还会在一种称为营养免疫的过程中，使入侵的微生物无法获取铁元素。16作为应对，病原体已进化出多种策略以规避营养免疫。其中一种机制依赖于血红蛋白，后者是宿主内最丰富的铁来源。17血红蛋白存在于红细胞内。红细胞受损后释放的血红蛋白会被宿主结合珠蛋白（haptoglobin）结合，形成的结合珠蛋白-血红蛋白复合物可被巨噬细胞迅速清除。18为了获得血红蛋白， S. aureus 表达溶血素，可裂解红细胞19血红蛋白结合珠蛋白诱导的血红蛋白清除作用被细胞表面受体对血红蛋白的高亲和力结合所抵消 金黄色葡萄球菌。S. aureus 从血红蛋白的肽组分中提取血红素，并通过细胞壁蛋白向膜蛋白传递的方式将血红素转运至细胞质。在细胞质中，血红素被加氧酶降解以释放游离铁，或作为完整分子被用于电子传递链20.
大量研究已证实 Isd 系统在感...

<table><tbody><tr><td>高效液相色谱阴离子交换柱</td><td>Varian</td><td>PL1551-3802</td><td></td></tr><tr><td>Drabkin 试剂</td><td>Sigma</td><td>D5941-6VL</td><td></td></tr><tr><td>血红蛋白标准品</td><td>Pointe Scientific</td><td>H7506-STD</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 培养基</td><td>HyClone</td><td>SH30011.02</td><td></td></tr><tr><td>Chelex 100 钠型</td><td>Sigma</td><td>C7901</td><td></td></tr><tr><td>EDDHA</td><td>LGC Standards GmbH</td><td>ANC 001</td><td></td></tr><tr><td>血红蛋白 a 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc</td><td>SC-21005</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨大豆琼脂</td><td>BD</td><td>236920</td><td></td></tr></tbody></table>

以人血红蛋白作为铁源培养staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus Growth using Human Hemoglobin as an Iron Source

S. aureus 是一种致病性细菌，需要铁来执行重要的代谢功能并引发疾病。人体宿主内最丰富的铁储存形式是血红素，它是血红蛋白的辅因子。为了从血红蛋白中获取铁， S. aureus 利用一种称为铁调控表面决定簇（Isd）系统的复杂机制1Isd 系统组分首先结合宿主血红蛋白，随后提取并导入血红素，最终在细菌胞质中将铁从血红素中释放出来2,3。该通路已通过大量研究被解析 体外 研究4-9此外，Isd系统在感染中的作用已在小鼠模型中多次得到证实。8,10-14建立 Isd 系统在血红蛋白来源铁获取及细菌生长中所起作用的研究已被证明更具挑战性。以血红蛋白作为唯一铁源的生长实验常受到市售血红蛋白不稳定、培养基中游离铁污染以及铁螯合剂相关毒性的干扰。本文介绍一种可克服上述局限性的方法。高质量血红蛋白由新鲜血液制备，并储存于液氮中。纯化的血红蛋白被添加至去铁培养基中，以模拟病原体在脊椎动物宿主体内所遭遇的贫铁环境。通过铁饥饿处理 S. aureus 通过提供游离铁并补充一种经最小程度修饰的血红蛋白形式，我们诱导细菌生长，该生长完全依赖于细菌结合血红蛋白、提取血红素、将血红素穿过细菌细胞包膜并在细胞质中降解血红素的能力。该检测方法将有助于研究人员阐明细菌从血红蛋白/血红素获取铁的机制 S. aureus 以及可能的其他细菌病原体。

我们通过高效液相色谱法（HPLC）从溶血液中纯化了人血红蛋白（实验方案步骤 1.7）。图 1 显示了洗脱液在 280 nm 和 410 nm 波长下的吸光度记录。收集第 5 馏分，其余馏分弃去。通常每毫升洗脱液可获得 5 至 15 毫克的血红蛋白产量。纯化的血红蛋白进行了重复的 SDS-PAGE 分析，凝胶或用蛋白质染色，或转至硝酸纤维素膜并进行免疫印迹分析（实验方案步骤 1.10，图 2）。
我们评估了纯化的人血红蛋白支持野生型S. aureus及缺失Isd系统IsdB组分的S. aureus（ΔisdB）生长的能力。IsdB是一种血红蛋白受体，对血红蛋白来源的铁获取至关重要12。根据方案第3节所述，在添加人血红蛋白的缺铁培养基（NRPMI + EDDHA + Hb）中培养野生型和ΔisdB菌株。在NRPMI + EDDHA + Hb培养条件下，野生型菌株能够增殖，表现为培养物随时间推移光密度升高，而ΔisdB<...

本文介绍了一种利用血红蛋白作为唯一可利用铁营养来源的Staphylococcus aureus生长实验方法。该实验可确定细菌因子在血红蛋白来源铁获取过程中的作用。

以人血红蛋白作为铁源培养Staphylococcus aureus

金黄色葡萄球菌（S. aureus）是一种致病性细菌，需要铁来执行重要的代谢功能并引发疾病。铁最丰富的储存库……

本实验检测金黄色葡萄球菌利用人血红蛋白作为唯一铁源的能力。首先，从新鲜的人血中分离红细胞。通过高效液相色谱法纯化血红蛋白，以确保血红蛋白的完整性。接下来，将血红蛋白加入去铁培养基中，以血红蛋白形式提供铁元素，随后在含有血红蛋白的条件下培养 S. reus，检测其利用血红蛋白作为铁源的能力。结果表明，金黄色葡萄球菌在以血红蛋白作为唯一铁源的条件下能够增殖。该方法有助于解答微生物学领域的一些关键问题，例如病原体是否能够利用宿主蛋白作为铁源，以及在此过程中所需的作用机制。因此，该方法可为金黄色葡萄球菌从血红蛋白中获取铁的机制提供深入见解。该方法也可用于研究其他细菌及其如何利用宿主含铁蛋白。本实验技术将由我实验室的GLA Ani和Catherine Haley进行演示。首先，获取新鲜分离的人类血液，加入抗凝剂，并全程在4°C条件下保存。通过离心（15,000 ×g，20分钟）沉淀红细胞。小心吸除上清液，将沉淀物轻柔地重悬于冰冻的0.9%氯化钠溶液中。经三次洗涤后，将沉淀物重悬于一体积的冰冻10毫摩尔Tris-HCl缓冲液中，利用渗透压裂解红细胞。然后加入甲苯至终体积的20%，并在4°C下于旋转仪中孵育过夜。接着进行离心，以20,000 × g离心1小时。收集中间的溶血液组分，保留上层甲苯层和沉淀物不受干扰。将溶血液通过0.44微米的注射器滤器过滤。如果溶液中含有颗粒物而无法通过滤器，则重复高速离心。现在使用高效液相色谱阴离子交换柱纯化血红蛋白。采用10毫摩尔的三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）作为流动相A，采用含0.5摩尔氯化钠的10毫摩尔三（羟甲基）氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）作为流动相B。在2毫升/分钟的流速下，于2分钟内运行0%至100%的溶剂B梯度。根据410纳米和280纳米处的吸收值监测洗脱过程。收集呈现鲜红色且具有明显吸收峰的组分。将洗脱液在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中透析约16小时。为样本进行灭菌，需将其通过0.22微米的注射器滤器，以测定血红蛋白浓度。在磷酸盐缓冲液（PBS）中配制HP标准溶液。随后，在96孔板中将标准溶液或样本溶液与两倍稀释的xra kins试剂按1:1比例混合，孵育15分钟后，在540纳米处测定吸光度。绘制标准曲线并确定样品中血红蛋白（HP）浓度为每毫升5至15毫克。通常取15至20微克纯化的血红蛋白样品，在两块15% STS聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。将其中一块凝胶染色，另一块凝胶中的蛋白质转移至硝酸纤维素膜上，用于血红蛋白的免疫印迹分析。将分离得到的血红蛋白以每毫升为一份分装，于液氮中冷冻保存。从冻存的金黄色葡萄球菌（S. aureus）菌种中，在胰酪大豆胨琼脂培养基（triptych soy agar）上划线接种，并在37°C下培养20至24小时。将单菌落接种至含有E-D-D-H-A的5毫升RPMI培养基中，37摄氏度、180 RPM条件下振荡培养过夜。在7,500 G下离心5分钟，收集菌体。然后将细菌重悬于含有0.5毫摩尔E-D-D-H-A的RPMI培养基中，并调整浓度至OD600约为3。接着，配制含有2.5微克/毫升HB以及0.1至1毫摩尔E-D-D-H-A的N-R-P-M-I培养基，以螯合游离铁。现在将10微升细菌悬液转接到含有E-DDH-A和HP的1毫升N-R-P-M-I培养基中，在37摄氏度下振荡培养最多48小时，每6至12小时以180 rpm振摇一次。取50微升培养物，与195微升PBS混合于96孔板中，测定OD600值。在此从溶血液中通过HPLC纯化人血红蛋白的过程中，检测洗脱液在280纳米和410纳米波长处的吸光度，其中第五组分含有血红蛋白。通常，每次制备可获得每毫升5至15毫克的血红蛋白产量。纯化的血红蛋白通过SDS-PAGE进行重复分析，凝胶或用于蛋白质染色，或转至硝酸纤维素膜上进行免疫印迹。随后，检测纯化的人血红蛋白是否能够支持野生型 asus 及缺乏血红蛋白受体（该受体是获取血红蛋白来源铁所必需的）的 ASUS 的生长能力。随着时间推移，培养物光学密度的增加表明，在添加了N-R-P-M-I、E-D-D-H-A和血红蛋白（hb）的培养基中，野生型ASUS能够增殖，而突变株则不能。相比之下，野生型和突变株利用外源游离铁的能力相同，且在缺乏铁源的情况下均无法增殖。在比较添加了从新鲜血液中纯化的血红蛋白与冻干血红蛋白的培养基时，只有从血液中纯化的血红蛋白需要ISDB才能支持细菌生长。虽然冻干血红蛋白能够促进ISDB突变体的增殖，但一旦掌握正确方法，血红蛋白的纯化过程可在数小时内完成。请记住，献血者可能是血液传播病原体的潜在携带者，因此应将人血视为生物危害材料进行处理。

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