Name: 单个肌纤维和成人骨骼肌卫星细胞的分离和培养 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: 学习从成年小鼠EDL肌肉中分离和培养单个肌纤维及其卫星细胞的方法。该技术保留肌纤维与干细胞的生理关联，可用于研究卫星细胞的激活、增殖和分化机制，为肌肉再生和干细胞生物学研究提供重要工具。

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我们感谢 Sarah Dick 提供了关键的审阅和意见。M.A.R. 担任加拿大分子遗传学研究讲席，并且是霍华德·休斯医学研究所的国际研究学者。本工作获得了美国国立卫生研究院、霍华德·休斯医学研究所、加拿大卫生研究院、肌肉萎缩协会以及加拿大研究讲席计划对 MAR 提供的资助支持。

所有实验均按照渥太华大学动物护理与使用管理条例进行操作。
有关该方案的概述，请参见表 1。
1. 开始分离前的准备
<ol>
 <li>准备以下溶液： 
 0.2% I型胶原酶溶于DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基；高糖，含L-谷氨酰胺及110 mg/ml丙酮酸钠）。分离两块EDL肌肉需准备2 ml含0.2%胶原酶的DMEM。通过0.22 μm滤器过滤溶液。分离前10分钟，在37 °C水浴中预热。未稀释的胶原酶可分装后于-20 °C保存以备后续使用。 
 注意：整个操作过程中均应使用含丙酮酸钠的DMEM。在不含丙酮酸钠的培养基中，肌纤维无法存活。
 <ul>
 <li>洗涤液（用于所有洗涤步骤）。在DMEM中添加1%青霉素/链霉素。使用前经0.22 μm滤器过滤。</li>
 <li>肌纤维培养液。在DMEM中添加20%胎牛血清（FBS）、1%鸡胚提取物和1%青霉素/链霉素。使用前经0.22 μm滤器过滤。</li>
 <li>Matrigel包被培养皿。为长期培养肌纤维，建议使用Matrigel作为包被基质。制备Matrigel包被培养皿时，于4 °C过夜解冻Matrigel分装液。次日，将Matrigel按1:10比例用DMEM稀释。全程保持Matrigel处于4 °C，避免温度骤变，否则会导致溶液内形成微小晶体，造成包被不均。将待包被的培养皿置于冰上。加入适量Matrigel溶液以完全覆盖表面，静置1分钟。彻底移除残留Matrigel。包被后的培养皿在37 °C干燥至少3小时或过夜，方可使用。</li>
 </ul>
 
 注意：若储存于4 °C，稀释后的Matrigel分装液可多次重复用于包被。
 </li>
 <li>最后，务必使用70%乙醇清洁显微镜操作台及解剖工具。</li>
 <li>为进行两次EDL肌肉分离（一只小鼠），准备五个塑料培养皿（60*15 mm），具体如下：
 <ul>
 <li>四个用于分离过程的培养皿（1个用于肌肉解离，3个用于连续洗涤）。所有培养皿必须用马血清（HS）包被，以防止肌纤维黏附于塑料表面。包被方法：向每个培养皿中加入3 ml马血清，轻轻旋转使液体均匀覆盖皿底，随后吸除马血清，并静置干燥至少30分钟。向每个培养皿中加入4 ml DMEM。使用前将培养皿置于37 °C、5% CO2培养箱中保存。</li>
 </ul>
 
 注意：若保持无菌，马血清可多次重复使用。也可使用含10% HS的DMEM溶液进行包被。在整个实验流程及肌纤维悬浮培养过程中，均应使用经HS包被的培养皿。
 <ul>
 <li>一个培养皿用于分离后肌纤维的培养。最终肌纤维培养可依据下游应用选择不同尺寸或规格的培养皿，但我们不建议使用大于60*15 mm的培养皿。肌纤维在悬浮状态下最长可维持96小时，超过此时间将发生过度收缩。如需更长时间培养，建议使用Matrigel包被的培养皿或培养板。</li>
 </ul>
 </li>
 <li>为一次肌纤维分离（2块EDL肌肉），准备两支无菌巴斯德吸管：一支粗口吸管用于肌肉操作，一支细口吸管用于单根肌纤维操作。使用金刚石笔将每支玻璃吸管切割至所需长度，并通过火焰抛光使边缘平滑。再用火焰将细口吸管尖端弯曲，有助于单根肌纤维的操作。使用火焰灭菌。使用前每支吸管均需用HS包被。</li>
</ol>
2. 肌肉组织的分离与消化
<ol>
 <li>本实验使用8周龄的SV129、Pax7 CreERCklr;Rosa26TdTomato（Pax7Cre-TdTomato）和Myf5-Cre;Rosa26YFP小鼠。</li>
 <li>用70%乙醇喷洒后肢。将动物仰面固定在支撑板上，以便在操作过程中更好地控制后肢。</li>
 <li>使用剪刀沿肢体全长剪开，暴露下方肌肉。去除皮肤以及任何毛发或皮毛（图1A）。</li>
 <li>用精细剪刀剪开薄层筋膜，注意不要损伤下方肌肉。肉眼定位趾长伸肌（EDL）。EDL位于后肢前侧肌室，位于胫前肌（TA）下方。</li>
 <li>借助两把镊子，暴露远端肌腱。</li>
 <li>用锋利的Cohann-Vannas弹簧剪刀剪断远端肌腱（包括TA和EDL的肌腱）。</li>
 <li>用镊子夹住TA和EDL肌肉的肌腱，轻柔地将肌肉向近端提起。此时应能清楚看到EDL肌肉位于TA肌肉下方。接着，通过将两个肌腱向相反方向牵拉，将EDL与TA肌肉分离（图1B）。操作过程中避免拉伸EDL肌肉，以免损伤肌纤维。</li>
 <li>暴露EDL肌腱。为更清晰地观察近端肌腱，此时可考虑去除TA肌肉。此外，切除膝关节周围部分结缔组织也可能有助于观察（图1C）。</li>
 <li>剪断近端肌腱，轻柔取出EDL肌肉（图1D）。</li>
 <li>通过肌腱夹持肌肉，将其转移至2 ml预先配制的胶原酶溶液中。在37 °C水浴中孵育。 
 注意：为成功分离单根肌纤维，必须从肌腱到肌腱完整分离EDL，以维持肌纤维的完整性。步骤2.3至2.9可在解剖显微镜下进行。也可使用放大镜以获得更清晰的肌肉视野。</li>
 <li>重复步骤2.3至2.9以分离第二侧EDL。将第二侧EDL转移至同一离心管中。为避免消化不均，第二侧EDL的分离应在第一侧完成后不超过5分钟内完成。 
 注意1：孵育时间可能需根据胶原酶活性进行调整。根据肌肉大小、年龄和/或肌肉状态（例如，纤维化肌肉需要更长的消化时间），可能需要延长或缩短孵育时间。 
 注意2：若需在静息条件下观察卫星细胞行为，肌肉消化过程中的震荡可能激活卫星细胞10。</li>
 <li>在消化过程中，应定期检查肌肉，防止过度消化。当肌肉开始松散且可见肌纤维时，即停止消化。停止消化的方法是将两块肌肉小心转移至含有4 ml预热DMEM的培养皿中（分离皿）。此操作应使用大孔径移液器进行。 
 注意：避免肌肉过度消化，否则不可避免地会导致分离出高度收缩的肌纤维。</li>
</ol>
3. 单肌纤维分离与培养
<ol>
 <li>使用大口径玻璃移液管用温热培养基冲洗肌肉，直至肌纤维自然释放。切勿吹打肌肉，以免不可避免地损伤纤维。此步骤及后续操作均应在解剖显微镜下进行。</li>
 <li>继续释放肌纤维，直至达到所需数量。若培养皿在室温下放置超过10分钟，则需在37 °C、5% CO₂条件下孵育至少5分钟。2 重新平衡培养基。 
 注意： 如果培养基长时间处于低于生理温度（37 °C）的条件下，肌纤维将死亡。</li>
 <li>使用小口径移液管将活的单根肌纤维转移至一个新的预热培养皿中（连续三次洗涤中的第一次）。应逐根处理肌纤维，而非一次性批量转移多根肌纤维。如有需要，于37 °C、5% CO₂条件下孵育2 10-15 分钟以重新平衡培养基。</li>
 <li>重复步骤 3.3 两次以上，或直至所有坏死的肌纤维和碎片均被清除。我们建议至少连续清洗三次，以确保充分清洁。 
 注意： 死亡的肌纤维在显微镜下呈现为短而高度收缩的形态。</li>
 <li>在37 °C、5% CO₂条件下孵育单个肌纤维2 在更换为培养基之前，于最后一道洗涤用培养皿（仅含DMEM）中孵育至少1小时。这一步骤可使肌纤维适应环境 体外 无血清条件下。我们发现，在富含血清的培养基中立即培养肌纤维会增加纤维收缩。</li>
 <li>1 小时后，根据后续实验应用，将肌纤维转移至新的预热培养皿或相应的培养装置中。使用高血清培养基培养纤维，以促进卫星细胞活化。 alternatively，也可使用不同浓度的血清或鸡胚提取物。每隔一天更换一次培养基。</li>
</ol>
4. 下游应用
<ol>
 <li>免疫染色。活体肌纤维可在分离过程中的任意时间点进行固定和染色。免疫荧光染色既可用于悬浮状态的肌纤维，也可用于贴附于基质的肌纤维。若对悬浮肌纤维进行染色，应使用细口玻璃移液管将肌纤维从一种溶液转移至另一种溶液。或者，也可在整个操作过程中将肌纤维保留在同一孔中，通过玻璃移液管添加或移除溶液。避免使用常规抽吸法，否则会导致肌纤维被一并移除。简而言之，首先完全移除培养基；将肌纤维置于预热的4%多聚甲醛（PFA）中固定5分钟。随后用PBS多次彻底清洗。将肌纤维在含1%甘氨酸的PBS或其他标准淬灭溶液中孵育，以减少PFA引起的背景染色。如有必要，用含0.1% Triton X-100的PBS对肌纤维进行透化处理10分钟，随后用PBS清洗5分钟。将肌纤维在封闭液（10%马血清、0.1% Triton X-100、1% NaN₃）中于室温孵育1小时，或更优选择是在4 °C下过夜孵育。根据所用抗体的不同，也可采用其他封闭液。用PBS清洗一次，每次5分钟。加入适当稀释于封闭液中的特异性一抗，在室温孵育1小时或4 °C过夜。用PBS洗涤3次，每次5分钟，以去除未结合的一抗。加入适当的荧光标记二抗，在室温孵育45分钟至1小时。再用PBS洗涤3次，每次5分钟。用1 mg/ml DAPI对细胞核进行复染。若对悬浮纤维染色，需将每根纤维转移至适合显微镜观察的载玻片上。去除多余的PBS或培养基。加入封片剂后加盖盖玻片。随后在荧光显微镜下观察肌纤维。代表性EDL肌纤维免疫荧光染色结果见图4。使用更强固定剂的替代染色方案详见Verma, M. et al. 11 和 Wosniak, A.C. et al. 12。</li>
 <li>寡核苷酸或质粒瞬时转染。活体肌纤维可通过质粒或siRNA对特定目标基因进行转染。当使用siRNA时，建议进行两次转染以实现高效的基因敲低。我们建议在分离后8小时进行首次转染。转染6小时后更换为新鲜培养基。对于siRNA转染，建议初始终浓度为50 nM。基因表达的敲低效果可通过RNA提取分析，或更优选择是通过免疫染色进行评估。</li>
 <li>病毒感染。虽然可对活体肌纤维进行病毒感染，但其细胞死亡率高于寡核苷酸转染，且感染效率可能因肌肉状态和年龄而异。例如，完整的成年肌纤维由于基底膜的存在而对病毒感染特别不敏感，已有研究表明基底膜可作为抵御宿主感染的保护屏障13, 14。相较于逆转录病毒载体，慢病毒载体更受青睐，因其能够感染静息状态（非分裂）的细胞。进行病毒感染时，建议将肌纤维培养在Matrigel包被的培养皿或板上，并在最初24小时内让肌纤维适应培养基条件。</li>
 <li>活细胞成像。肌纤维的活细胞成像过程特别耗时，需配备37 °C、5% CO2培养环境的显微镜系统。该技术在评估单个卫星细胞行为方面非常有用。利用此技术开展的研究对于揭示卫星细胞异质性以及研究其在肌纤维上的行为起到了关键作用（15 和 16）。</li>
</ol>

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<li>Siegel, A. L., Atchison, K., Fisher, K. E., Davis, G. E., Cornelison, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+timelapse+analysis+of+muscle+satellite+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">3D timelapse analysis of muscle satellite cell motility.</a> Stem Cells. 27 (10), 2527-2538 (2009).</li>
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<li>Zammit, P., Golding, J. P., Nagata, Y., Hudon, V., Partridge, T. A., Beauchamp, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+satellite+cells+adopt+divergent+fates%3A+a+mechanism+for+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle satellite cells adopt divergent fates: a mechanism for self-renewal.</a> J. Cell Biol. 166 (3), 347-357 (2004).</li>
</ol>

不存在利益冲突。

完整肌肉中单个肌纤维的分离与培养提供了极佳的 体外 用于研究肌肉再生过程的模型。该系统的一个独特特征是能够在其生理环境——基底膜下方——保留卫星细胞。最重要的是，该技术可用于研究肌肉干细胞在静息状态和激活状态下的行为。在过去的20年中，肌纤维培养系统在揭示卫星细胞群体的生物学特性方面提供了重要见解，涵盖了内在和外在决定因素。通过培养单根肌纤维，研究人员已针对卫星细胞在肌纤维、肌肉类型或再生潜能方面的异质性开展了深入研究。 15通过单根培养肌纤维的活体成像进行的深入研究，使人们获得了有关卫星细胞迁移模式的信息 16定量数据的获取也是可行的。尽管耗时较长，但该方法可提供有关特定事件（如干细胞不对称分裂、增殖与分化比例等）分布与发生情况的重要信息。结合前述应用，还可从单根肌纤维中提取蛋白质或RNA，不过通过FACS或其他方法分离出纯度较高的卫星细胞群体，可能更适合作为在分子水平上研究蛋白质或基因表达变化的平台。根据我们的经验，成功分离肌纤维最关键的步骤是“肌腱到肌腱”的完整分离（方案文本中的步骤2.5至2.9）。该操作可确保在肌肉消化后，肌纤维从趾长伸肌（EDL）中释放时几乎无损伤或损伤极小，从而提高其在后续步骤中的表现。

<table><tbody><tr><td>胶原酶</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130-1g</td><td>为获得最佳效果，每次均需新鲜配制。未稀释的胶原酶可分装后于 -20 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>高糖 DMEM 培养基（含丙酮酸钠）</td><td>Invitrogen</td><td>11995073</td><td>需添加青霉素-链霉素（Pen/Strep），以减少空气污染风险</td></tr><tr><td>经鉴定的胎牛血清</td><td>Hyclone</td><td>SH30396.03</td><td>批号 #KUJ35152</td></tr><tr><td>马血清</td><td>Hyclone</td><td>SH300.74.03</td><td>批号 #AVJ82494</td></tr><tr><td>鸡胚提取物</td><td>Accurate Chemical</td><td>CE-650-T, 批次 B7035010</td><td>避免反复冻融。</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD</td><td></td><td>分装后于 -20 &amp;deg;C 保存。避免反复冻融。稀释后的分装样品应于 4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;仪器&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Cohann-Vannas 弹簧剪，6 mm 刀头，直型，锐利</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-02</td><td></td></tr><tr><td>超薄虹膜剪，10.5 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14088-10</td><td></td></tr><tr><td>Moria 虹膜镊，弯型</td><td>Fine Science Tools</td><td>11373-12</td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td>14672-200</td></tr><tr><td>玻璃划线笔</td><td>VWR</td><td>52865-005</td><td></td></tr><tr><td>60×15 mm 培养皿</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc 0.22 &amp;mu;m 滤器</td><td>VWR</td><td>CA28-145-477</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜 StemiV6</td><td>Zeiss</td><td></td><td>可能需要额外光源以获得更清晰的聚焦视野</td></tr></tbody></table>

分离与培养成年骨骼肌单个肌纤维及其卫星细胞

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

成年个体中的肌肉再生由一种称为卫星细胞的组织驻留干细胞完成。卫星细胞的定义特征是其位于每条肌纤维基底膜与肌膜之间的解剖位置。目前对卫星细胞行为的研究在很大程度上依赖于单根肌纤维分离技术。1985年，Bischoff描述了一种从成年大鼠趾短屈肌（FDB）中分离单根活肌纤维的实验方案，旨在建立一个 体外 肌纤维与其干细胞之间物理关联得以保留的系统 11995年，Rosenblatt 对 Bischoff 方案进行了修改，使肌纤维在胶原酶消化后被单根挑取并分别处理，而不是通过重力沉降法进行分离。 2, 3. Rosenblatt 或 Bischoff 方案此后已被应用于不同的肌肉、年龄或条件下 3-6单根肌纤维分离技术因其独特优势而成为不可或缺的工具。首先，在单根肌纤维分离方案中，卫星细胞保留在基底膜下方，这是该方案的独特之处；而其他技术（如荧光激活细胞分选）则需要通过化学和机械方法对组织进行解离。 7尽管肌纤维培养系统无法替代 体内 研究中，它为探讨肌肉干细胞的相关生物学特性提供了一个极佳的平台。单根肌纤维可在标准贴壁条件下或悬浮条件下培养。悬浮状态下的肌纤维上卫星细胞几乎仅受到肌纤维自身微环境的影响，而不受其他外界因素干扰。已有研究表明，基质刚度及包被条件会影响卫星细胞的肌肉再生能力 8, 9 因此，能够独立控制这些因素中的每一个，有助于区分微环境依赖性和非依赖性反应。不同浓度的血清也被证明会影响细胞从静息状态向激活状态的转变。为了维持与肌纤维相关联的卫星细胞的静息状态，应将肌纤维保存在低血清培养基中。 1-3这对于研究参与静息状态的基因尤其有用。在富含血清的培养基中，卫星细胞会迅速激活、增殖、迁移并分化，从而模拟这一过程 体内 再生过程 1-3该系统可用于执行多种检测，例如化学抑制剂测试、通过病毒递送实现基因的异位表达、基于寡核苷酸的基因敲低或活体成像。本文视频描述了我们实验室目前用于从成年小鼠（6–8 周龄）趾长伸肌（EDL）中分离单个肌纤维的实验方案。

本文描述了从小鼠成年EDL肌肉中分离单个肌纤维的方法。成功获得肌纤维的产量取决于多个因素，例如胶原酶活性、肌肉状态或动物年龄。最重要的是，将肌肉从一端肌腱到另一端肌腱完整分离，可获得来自EDL肌肉的长而完整的单根肌纤维。图1以逐步图示方式展示了“从肌腱到肌腱”的分离方法。当肌肉完全消化后，通过轻柔挤压肌肉即可释放出肌纤维。图2A显示了一次典型的肌纤维分离实验在首次洗涤后的结果。此时培养物中包含多种成分：成束的单根肌纤维，表现为细长且有光泽的管状结构；过度收缩的肌纤维，表现为短而暗的结构；以及消化过程中产生的碎片。经过至少三次连续洗涤后，培养皿中应仅剩存活的单根肌纤维，可用于后续培养或分析（图2B）。图2C展示了一根长而存活的肌纤维，与一根过度收缩的纤维（C'）相对比。在分离时，卫星细胞表现为肌纤维表面微小的突起结构（图3A）。若将其维持在富含血清的培养基中，卫星细胞将被激活，增殖、迁移，并最终融合形成肌管（B）。培养15天后，所有肌管均表达Myf5报告基因YFP（C），表明成年个体中的肌肉再生是由那些在发育过程中曾表达过成肌决定因子Myf5的细胞完成的。所有卫星细胞均表达配对盒转录因子Pax717。利用报告小鼠品系Pax7Cre-TdTomato，可通过TdTomato荧光信号的表达来追踪卫星细胞（图3D和E）。图4展示了一幅典型的双阳性Pax7+/Myod卫星细胞的免疫荧光图像。传统上，双阳性Pax7+/Myod+卫星细胞被认为是具有增殖能力并已定向分化的肌肉前体细胞，它们可通过下调Pax7同时维持Myod表达而完成分化程序，或通过下调Myod同时维持Pax7表达而返回静息状态18
<img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig1.jpg" alt="显示小鼠后肢EDL和TA肌肉解剖过程的示意图，突出近端和远端方向。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图1"> 
 图1. 小鼠后肢EDL肌肉的分离。A. 一只8周龄成年小鼠的后肢。箭头指示远端（膝部）肌腱和近端（足部）肌腱。B. 胫前肌（Tibialis Anterior, TA）与趾长伸肌（Extensor Digitorum Longus, EDL）的解剖位置。C. 通过夹住EDL的近端肌腱，将肌肉向膝部方向牵拉，以暴露远端肌腱。D. 切断远端肌腱并释放EDL肌肉。
<img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig2.jpg" alt="肌纤维分析，显微镜图像显示活纤维、过度收缩纤维和碎片。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图2"> 
 图2. 单根肌纤维分离实验的代表性结果。A . 肌纤维分离实验在第一次洗涤步骤时的明场图像。红色箭头指示活肌纤维，白色箭头指示过度收缩的肌纤维，黄色箭头指示细胞、肌纤维或细胞外基质碎片。B. 在DMEM中连续洗涤后，仅剩活肌纤维。C 和 C'. 图像显示一根长而完整的活肌纤维（C）和一根短的过度收缩肌纤维（C'）。标尺：10 μm。图像使用配备AxioCam HR相机的Zeiss Axio Observer Z1显微镜拍摄。
<img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig3.jpg" alt="显微镜图像系列，突出显示细胞结构、组织纤维和荧光标记。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
 图3. 单根肌纤维培养实验的代表性结果。A . 分离后立即拍摄的单根活体肌纤维的明场图像，可见其附着的卫星细胞（箭头所示）（0时间点）。B. 将单根肌纤维接种于Matrigel上，并在富含血清的培养基中培养15天。白色箭头指示分化形成的肌管，与单个细胞（黄色箭头）相对比。C. 来自Myf5Cre;RosaYFP小鼠的单根肌纤维按B中条件进行培养。箭头指示由Myf5谱系来源的肌管。D和E. 来自Pax7Cre;TdTomato小鼠的单根肌纤维在分离后立即固定。箭头指示Pax7阳性的静息态卫星细胞（E，红色）。细胞核用DAPI复染（D）。标尺：50 μm。图像使用配备AxioCam HR相机的Zeiss Axio Observer Z1显微镜拍摄。
<img src="/files/ftp_upload/50074/50074fig4.jpg" alt="荧光显微镜图像，显示肌肉组织中的DAPI、Pax7、Myod染色；细胞鉴定。" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图4"> 
 图4. 肌纤维上卫星细胞免疫荧光染色示例。 单根肌纤维被分离后，在悬浮条件下培养72小时。利用卫星细胞特异性标志物Pax7（B，红色）和成肌调节因子Myod（C，绿色）对肌纤维上的卫星细胞进行染色。细胞核用DAPI复染（A）。标尺：50 μm。图像使用配备AxioCam HR相机的Zeiss Axio Observer Z1显微镜拍摄。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
 <tbody>
 <tr>
 <td>肌肉解剖（每块肌肉 5 分钟）</td>
 <td><ul>
 <li>从肌腱到肌腱的完整分离</li>
 <li>使用锋利的工具</li>
 <li>尽量减少肌肉损伤</li>
 </ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>肌肉消化（30–45 分钟）</td>
 <td><ul>
 <li>对温度敏感</li>
 <li>避免过度消化</li>
 </ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>肌纤维分离</td>
 <td><ul>
 <li>避免对肌纤维过度操作</li>
 <li>通过多次洗涤去除碎片</li>
 </ul></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>肌纤维培养（最长可达 3–4 周）</td>
 <td><ul>
 <li>培养格式：任意</li>
 <li>包被试剂：马血清、Matrigel</li>
 <li>培养基：基础培养基或高血清培养基</li>
 </ul></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>
表1. 肌纤维分离方案概述。肌纤维分离方案包含4个主要步骤。针对每个步骤，本文讨论了大致所需时间及主要关键点。有关各步骤的详细说明，请参阅方案正文。

肌纤维的分离与培养是金标准 体外 研究卫星细胞从静息、活化到分化转变过程的系统。重要的是，单根肌纤维培养系统保留了肌纤维与干细胞之间的关联，这是肌肉干细胞微环境的关键组成部分。

成年个体中的肌肉再生由一种称为卫星细胞的组织驻留干细胞完成。卫星细胞的特征在于其位于……

本实验的总体目标是从成年小鼠的趾长伸肌（EDL）中分离并培养单根活肌纤维及其相关的干细胞。首先采用肌腱到肌腱的解剖方法完整取出EDL肌肉，该方法可避免损伤肌纤维。随后通过肌肉消化处理使肌纤维分散，同时保留肌纤维与干细胞之间的关联结构，这是本实验方案的独特步骤。在最后一步中，通过连续洗涤去除碎片或过度收缩的纤维，同时轻柔地将单个肌纤维彼此分离。最终，通过该技术分离的肌纤维可保持在最低激活刺激的半静息状态，也可在高血清培养基中培养，以研究卫星细胞的激活与分化。近年来，培养肌纤维已被广泛用作一种极为有效的研究方法，用于在具有生理相关性的微环境中研究卫星细胞的激活、增殖及分化过程。这种方法确实使我们在分子和细胞水平上深入理解这些细胞的功能方面取得了重大进展。对于每只分离EDL的实验小鼠，准备五个塑料60毫米培养皿，用马血清进行包被：将4毫升马血清用移液管加入培养皿中，轻轻旋转以实现均匀覆盖；随后吸除多余血清，并将培养皿静置干燥至少30分钟。半小时后，向四个培养皿中各加入 4 毫升洗涤液。将这些培养皿分别标记为：消化后肌肉组织、洗涤一、洗涤二和洗涤三。向剩余的肌纤维培养皿中加入 4 毫升肌纤维培养基。使用前将培养皿置于37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中。接下来，为单根肌纤维的分离，在显微镜下准备两支无菌移液管。使用金刚石笔切割细孔移液管，制作一支粗孔移液管，使其开口足够大，可让整块肌肉顺利通过。第二个移液器是用于操作 MyFi 的小口径移液器。现在使用火焰弧对移液器进行灼烧，以使边缘光滑并实现灭菌，特别灼烧小口径移液器的尖端。这将有助于在分离过程中操作单根纤维。然后用马血清包被两支移液管。最后，务必用70%乙醇清洁显微镜操作台和解剖工具。本演示实验使用八周龄的转基因SV 1 29小鼠。处死动物。用70%乙醇喷洒后肢。然后将动物仰面固定在支撑板上。此步骤有助于更好地观察后肢。接下来，沿肢体全长进行切割，暴露其下方的肌肉。同时去除皮肤以及任何毛发或绒毛。使用精细剪刀剪开包裹肌肉的薄层筋膜，注意不要损伤下方组织。使用锐利的科汉万能剪刀暴露胫骨前肌（TA）和趾长伸肌（EDL）的远端肌腱。切断趾长伸肌（EDL）和胫骨前肌（TA）的远端肌腱。接着，用镊子夹住TA和EDL肌肉的肌腱，轻轻将肌肉向近端提起。此时，你应该能够清楚地看到位于TA肌肉下方的EDL肌肉。现在通过将两条肌腱向相反方向拉动，使趾长伸肌（EDL）与胫骨前肌（TA）分离。操作时避免拉伸EDL肌肉，以免损伤肌纤维。暴露趾长伸肌（EDL）肌腱。此时，可去除胫前肌（TA）以更好地观察近端肌腱。也可剪除膝关节周围的部分结缔组织，以利于操作。当肌腱清晰可见后，使用锋利的Cohan Venus Spring剪刀将EDL肌肉游离。若操作正确，EDL肌肉在从肢体取出后应能保持其细长形态。通过肌腱夹持EDL肌肉，将其转移至预热的2毫升胶原酶溶液中，并在37摄氏度水浴中孵育。重复该过程以分离第二侧EDL肌肉，并将其转移至同一管胶原酶溶液中，以实现不均匀消化。第二条EDL的分离应在第一条EDL分离后五分钟内完成。第一次EDL孵育时间可能需要根据胶原酶活性、肌肉大小、动物年龄或肌肉状态进行调整。例如，含有较多纤维化组织的肌肉可能需要更长的孵育时间。此外，请注意，此期间的振荡已被证明会激活 S 细胞。在消化过程中应定期检查肌肉，以避免过度消化。当肌肉开始松散且肌纤维变得可见时，停止消化。使用大孔径移液管，小心地将两块肌肉转移至预热的培养皿中。消化过程中应避免使用超过4毫升的洗涤培养基，否则会导致肌纤维过度收缩。为释放肌纤维，使用大孔径玻璃移液管用温热培养基冲洗肌肉组织，直至肌纤维自然开始释放。切勿反复吹打肌肉组织，因为这不可避免地会损伤肌纤维。继续释放肌纤维，直至达到所需数量。不要将培养皿在室温下放置超过10分钟。若需继续操作，应先将其放回培养箱中平衡5分钟。目前培养物中含有活的单个肌纤维（呈长而发亮的管状结构）、过度收缩的纤维（短而暗）以及碎片的混合物。现在使用小口径移液管，将活的单个MYOP纤维转移至新的预温育培养皿中。需逐个操作每根肌纤维。如果需要，不要一次性转移全部的肌纤维，而是将培养皿放回培养箱中孵育10至15分钟，以重新平衡培养基。通过至少三次连续的洗涤步骤，将单个活肌纤维再转移两次，以彻底去除所有死亡的肌纤维和碎片。最终，培养皿中仅应保留用于培养或后续分析的单个活肌纤维。活纤维具有较长的形态，而过度收缩的纤维则较短且更粗。现在，将分离的肌纤维在洗涤培养基中孵育至少一小时，然后再更换为培养基。在新的预热培养皿中，高浓度的中等培养基将有助于长期培养中卫星细胞的活化。无论选择何种培养基，Matrigel 均可适用。在分离操作时每隔一天更换一次培养基。在光学显微镜下观察，每个MyFi上的卫星细胞表现为肌纤维表面微小的突起。若将肌纤维在富含血清的培养基中长期培养，则培养物中主要可见完全分化的肌管。报告基因小鼠品系（如MIFF five Cree Rosa YFP品系）是研究肌肉再生过程的理想工具。源自Miff五Cree Rosa YFP肌纤维培养的肌管表达了MIFF五报告基因YFP。这表明肌肉再生需要Miff五的激活。PAX七Cree TD番茄小鼠品系是另一种报告基因小鼠品系。TD 番茄荧光信号仅在卫星细胞中被检测到，而肌纤维核明显呈阴性。这表明转录因子 PAX7 特异性表达于肌肉干细胞，而不表达于其分化的子代细胞。肌纤维及其相关的卫星细胞可进行固定，用于后续实验。免疫荧光显示PAC7阳性且MyoD阳性的卫星细胞通常被认为是具有增殖能力的定向肌肉前体细胞。这些细胞可通过下调PAC7同时维持MyoD表达来完成分化程序，或通过下调MyoD并维持PAC7表达而返回静息状态。单根肌纤维分离技术的独特优势在于能够保持生理性肌纤维-卫星细胞之间的关联结构。该操作最关键的步骤是从肌腱到肌腱分离EDL肌肉。尽量减少对肌纤维的操作有助于保持肌纤维的完整性和活性。成功分离单个肌纤维取决于多种因素，例如胶原酶活性、肌肉状态或动物年龄。最重要的是，将肌肉从肌腱到肌腱完整分离有助于维持肌纤维的完整性。此外，在整个操作过程中尽量减少对肌纤维的机械损伤，可提高细胞存活率。

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