Name: 在活细胞中蛋白质聚集的4D成像 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-04-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 学习利用四维显微成像技术实时追踪活细胞内蛋白质错误折叠与聚集的动态过程。该方法通过高时空分辨率成像揭示蛋白质质量控制机制，为研究蛋白质稳态及聚集相关疾病提供重要工具。

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1. 酵母制备
<ol>
	<li>用携带 GAL1-GFP-Y68L (UBC9ts) 盒式结构的质粒转化酵母菌株。</li>
	<li>将酵母在含有 2% 棉子糖的合成培养基中 30 °C、200 rpm 摇床培养 24 小时，随后转接至含 2% 半乳糖的培养基中继续培养 16 小时或过夜（O/N）。</li>
	<li>次日清晨，将待测菌株稀释至 OD600 = 0.2，于 30 °C（200 rpm）振荡培养 4–6 小时，直至菌液 OD600 达到 0.8–1.0。</li>
	<li>为抑制表达（以便仅监测已翻译并正确折叠的 GFP-Ubc9ts 蛋白池），在成像前 30 分钟更换为添加 2% 葡萄糖（SD）的合成培养基。</li>
	<li>处理 —— 将细胞在 37 °C 下热激 20 分钟以诱导蛋白错误折叠，或在显微镜孵育装置中持续观察热激条件下的蛋白聚集情况。注意 —— 若使用高于室温的显微镜温度，需提前约 2 小时预热，以使显微镜机身及物镜温度达到平衡（见下文）。</li>
</ol>
2. 载玻片/培养板的制备
<ol>
	<li>选择合适的培养板。主要考虑因素是在成像过程中能否保持聚焦。以下几点对于4D成像至关重要，而对于2D时间序列或3D成像则无需特别考虑。
	<ol>
		<li>多孔板——不同孔的底部可能不均一（即各孔相对于物镜的高度不同），这将导致在不同x、y位置及时间点之间难以维持聚焦，无论使用何种自动聚焦技术。</li>
		<li>载片材料：玻璃与塑料。玻璃底板在不同孔之间的z轴方向均一性更好，但成本较高。</li>
		<li>培养板底部厚度：我们通常使用盖玻片底板，折射率为1.5，但根据所用物镜，折射率1.0也可接受。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用ConA（0.25 mg/ml）覆盖培养板/载片底部，孵育10分钟。ConA用于使细胞黏附于载片表面，从而实现对单个细胞的长时间追踪。</li>
	<li>移除ConA，并将载片置于化学通风橱中孵育，使多余的ConA挥发。</li>
	<li>向已处理的孔中加入200 μl酵母样品（OD600 = 0.5）。</li>
	<li>孵育15分钟，以使细胞充分贴附于培养板表面。</li>
	<li>吸除培养基，并用新鲜培养基洗涤三次，以获得单层细胞。注意：若计划进行长时间时间序列成像，应稀疏接种细胞，以避免新生的芽体增殖并干扰目标区域。</li>
</ol>
3. 显微镜准备工作
<ol>
	<li>我们使用一台尼康 A1Rsi 共聚焦显微镜，并进行了若干非标准改装。对于酵母成像，我们最多使用 4 种激光器（405 nm，50 mW CUBE 激光器；457–514 nm，65 mW 氩离子激光器；561 nm，50 mW Sapphire 激光器；以及 640 nm，40 mW CUBE 激光器），以及最多 4 个配备滤光片的 PMT 探测器。我们的大部分成像使用绿色滤光片组用于 EGFP，红色滤光片组用于 mCherry 和 tdTomato。GFP 与 mCherry 之间几乎无串色，因此我们通常采用同时扫描模式。然而，当出现串色时，也可使用逐线扫描以避免干扰。我们的共聚焦系统还配备了一个 PInano 压电载物台（MCL），可在 z 方向实现 3 毫秒的步进，从而每秒可采集 2–3 个 z 层堆栈（30–50 层）。该系统还配有光谱探测器、Perfect Focus（激光偏移校正）功能以及两种扫描头——一个为检流计扫描头，另一个为共振扫描头。</li>
	<li>选择合适的物镜。主要考虑因素：
	<ol>
		<li>水镜/油镜/干镜物镜：主要考虑成像介质与样品介质的折射率匹配。
		<ol>
			<li>油镜的优点：
			<ol>
				<li>油镜可具有更高的数值孔径（NA）（油的折射率高于水，因此可使更多光子返回物镜）。油镜的数值孔径最高可达 1.49，而水镜最高为 1.27（但这一差异在实际分辨率上并不显著）。</li>
				<li>油的折射率与玻璃相近，因此光子从样品经盖玻片到达物镜时几乎无损失。（注意：应选择折射率与物镜及盖玻片相匹配的浸油）。</li>
				<li>油不易挥发，便于长时间延时成像。</li>
			</ol>
			油镜的缺点：
			<ol>
				<li>当光线需穿过水性介质（如细胞）时，油镜因高 NA 所带来的更高分辨率会迅速下降。</li>
				<li>图像通常在三维中表现出更多的球面像差和“拉伸”效应。</li>
				<li>油具有黏性，使用不便，且可能对物镜造成污染风险。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>水镜的优点：
			<ol>
				<li>细胞本身为水性环境，因此在 z 方向的畸变更少，且在水性样品深层仍能保持高分辨率。</li>
				<li>使用清洁、操作友好。水镜的缺点：水易快速蒸发，因此若无特殊装置持续向物镜补充水分，则不适合长时间延时成像。</li>
			</ol>
			</li>
			<li>干镜的优点：1. 在多点采集或长时间成像过程中无介质损失或蒸发。2. 使用清洁、操作友好。缺点：分辨率低，信号灵敏度差。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>室温与培养箱温度：温度变化会影响物质性质，在精细系统中会导致焦距偏移。应在选定采集点前调节温度。采集过程中改变温度将干扰成像并导致失焦。我们通常在成像前让显微镜系统在设定温度下平衡 2 小时。</li>
		<li>校正环：许多物镜配有校正环，可针对特定厚度的盖玻片进行调节。我们建议在使用荧光微球观察点扩散函数的同时调节校正环，以确保每个样品的设置正确。</li>
		<li>稳定的样品支架：我们发现大多数市售样品支架是显微镜系统中最薄弱的环节。它们通常不稳定且不平直。这对于高分辨率、多点 4D 成像是灾难性的。我们自行设计的样品支架平直且与载物台紧密贴合，必要时还可通过螺栓固定。</li>
		<li>多点采集：我们的成像系统配备了尼康的“Perfect focus”系统，本质上是一种基于激光的自动对焦机制。然而，在 4D 成像中，自动对焦并非总是必需，特别是当系统漂移较小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 成像
<ol>
	<li>打开系统：激光器、载物台、控制器、相机和计算机软件。</li>
	<li>将培养皿放置于载物台支架上，确保固定稳妥并保持稳定。</li>
	<li>使用目镜测微尺确定酵母的位置和方向。</li>
	<li>使用明场观察细胞形态和质地，评估细胞健康状况和活力。</li>
	<li>根据相关荧光染料开启落射荧光光源（例如 FITC滤光片用于GFP），聚焦于呈现研究目标表型的细胞。在多个波长下均表现出强荧光的细胞可能已死亡，因而具有自发荧光。我们使用与SV40 NLS信号融合的tdTomato荧光蛋白（NLS-TFP）标记细胞核。TFP的分子大小是GFP的两倍，超过核扩散限制，因此非常适合作为核标记物。我们也可同时使用绿色（488 nm）激光激发TFP和GFP，并将绿色和红色发射光分别收集至两个独立的PMT，以实现光谱分辨。</li>
	<li>调整以下设置以减少噪声和过饱和：
	<ol>
		<li>激光功率——应权衡图像亮度与光漂白和光毒性之间的关系。</li>
		<li>增益：影响相机的灵敏度，从而影响信噪比。</li>
		<li>针孔直径——应根据波长较短的激光进行调整。针孔直径决定了所成像光学切片的厚度（高度）。因此，增大针孔可收集更多光线（允许更多光子进入），但会降低Z轴分辨率（共焦性减弱）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>实用提示：
	<ol>
		<li>如果不同的荧光染料发射波长相近，可使用光谱检测器功能，该功能支持选择虚拟滤光片。需注意，光谱检测器的灵敏度低于常规的光电倍增管（PMT）。</li>
		<li>如果不同的荧光染料由同一激光激发，请使用线扫描功能。</li>
		<li>检流计扫描器具有更高的灵敏度，但光漂白风险也更高。共振扫描器能够实现更快的图像采集，从而降低光漂白风险，但灵敏度较低。</li>
		<li>对2到16张图像进行平均，可提高信噪比，但会减慢采集速度，并且当然会增加样本暴露于激光下的时间。</li>
		<li>采集时长——取决于具体的生物学问题（例如 JUNQ 和 IPOD 的形成大约需要 2 小时。我们已使用共振扫描器对酵母进行了长达 30 小时的三维延时成像。</li>
		<li>时间间隔 - 较短的时间间隔可生成更连贯的视频，但可能导致光漂白，从而造成信号丢失。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Gershenson, A., Gierasch, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+folding+in+the+cell%3A+challenges+and+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+structural+biology%22%5BJournal%5D)">Protein folding in the cell: challenges and progress.</a> Current opinion in structural biology. 21, 32-41 (2011).</li>
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</ol>

未声明任何利益冲突。

我们对生物化学过程的直观理解源于在实验台上进行的实验，即在烧杯中让反应物和产物的均匀混合溶液达到平衡状态。在这种情况下，某种特定化学物质的浓度可以用一个单一数值来表示，该数值是分子的摩尔量与宏观体积的比值。我们对蛋白质结构与功能的大部分认识，都来源于反映这种经典整体反应图景的方法：对整群细胞匀浆提取物进行的蛋白质印迹（western blots）、离心以及分光光度测量。
随着我们用于观察细胞的放大技术突飞猛进，越来越清楚的是，大多数生化反应发生的环境条件 体内 与经典的台式实验情境仅有细微相似之处。细胞内部不仅是一个高度密集的环境，其中拥挤效应显著改变了各种反应物的活性，而且也远非均匀混合的状态。这解释了为何经常出现以下情况之间的显著差异 体外 和 体内 多种复杂大分子反应的效率。
古典直觉在以下领域中 体外 生化实验在涉及相关问题时更容易产生误导 体内 蛋白质的折叠、错误折叠与聚集。尽管在体相反应中对蛋白质化学的研究可将特定蛋白质的折叠问题简化为“是”或“否”的二元判断，但任何试图在活细胞中追踪大分子群体动态的研究，都必须能够灵敏地检测多肽链可能采取的各种构象状态的完整分布，尤其是错误折叠与聚集的风险。例如，我们可通过蛋白质印迹法检测某种聚集倾向性蛋白的全细胞裂解液，发现该蛋白主要呈不溶性且未发生泛素化。然而，在活细胞中，可能存在一个离散的亚群，其在特定区室中因局部浓度极高而呈可溶性并发生泛素化，但由于在多细胞平均化检测中难以被识别，该现象可能被忽略。这种情形对细胞存活力的影响，可能比更大比例的体相亚群更为重要。此外，分子伴侣表现出多种多效性行为与功能 体外细胞内，它们的离散功能在空间和时间上受到限制。
在理解生物化学的新兴范式中，浓度成为细胞内每个特定纳米环境的可变属性，而支撑生物过程的分子事件不仅需要在时间维度上进行检测，还需要在空间维度上加以分析。本文介绍的4D成像方法能够对活细胞中蛋白质错误折叠进行高灵敏度的建模，同时该方法也可用于研究多种其他生物过程及其在空间、时间以及环境条件变化下的调控机制。在本研究中，我们采用了Ubc9ts折叠传感器，该传感器能有效展示细胞质中蛋白质聚集起始阶段的各个过程及应对策略。除了揭示聚集质量控制的细胞生物学机制外，该方法还可作为强大工具，用于解析特定干扰或基因突变对蛋白质稳态（proteostasis）的影响（例如，利用Ubc9ts可测量氧化应激、毒性聚集体表达或质量控制通路中基因突变所引发的蛋白质折叠压力）。
4D成像对于准确确定蛋白质的定位或两种不同蛋白质之间的共定位，以及检测可能短暂但重要的现象也至关重要。例如，在酵母等小型球形生物中，某种结构或聚集体似乎具有近核定位，而4D成像则可能揭示这仅仅是观察角度造成的假象。
在本示例实验中，我们展示了利用一种错误折叠的模型蛋白Ubc9ts，在细胞质中随时间和空间动态追踪聚集体质量控制的过程。在允许温度下，Ubc9ts处于正确折叠状态，并分布在细胞核和细胞质中。当受到热诱导发生错误折叠后，该蛋白最初会形成可快速扩散的小型聚集体——应激焦点（Stress Foci），并被靶向蛋白酶体进行降解。当蛋白酶体活性部分受到抑制时，这些应激焦点会在约2小时内逐步转化为JUNQ和IPOD包涵体。如果泛素介导的降解途径无法作为质量控制手段，Ubc9ts会立即被重新定向至IPOD包涵体，进行保护性聚集。这些工具为发现参与聚集体质量控制的新型遗传因子，以及探究其在细胞内的时空调控机制提供了极为宝贵的机会。

<table><tbody><tr><td>MG132</td><td>Mercury</td><td>mbs474790</td><td></td></tr><tr><td>con A</td><td>Sigma</td><td>C2010</td><td></td></tr><tr><td>玻璃底培养板</td><td>ibidi</td><td>ibd81158</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;蛋白质聚集的4D荧光成像&lt;/strong&gt; &lt;br/&gt; 使用配备PInano压电载物台（MCL）的Nikon A1R-si显微镜，结合60倍水镜（NA 1.27），以0.3微米层厚、0.5%激光功率（来自65 mW 488激光器和50 mW 561激光器）采集共聚焦三维动态图像。&lt;em&gt;z&lt;/em&gt;序列每5分钟采集一次，持续90分钟。每个&lt;em&gt;z&lt;/em&gt;序列的步长为0.5微米，共30步。图像处理使用NIS-Elements软件完成。</td></tr></tbody></table>

活细胞中蛋白质聚集的4d成像

4D Imaging of Protein Aggregation in Live Cells

对于任何活细胞而言，关键任务之一是在不断变化的环境条件以及高度密集、黏稠且对蛋白质稳定性不利的细胞内环境中，维持新合成蛋白质的正确折叠1。动态平衡蛋白质的合成、折叠与降解能力依赖于高度特化的质量控制机制，当这些机制发生功能障碍时，其绝对必要性便最为明显地显现出来。肌萎缩侧索硬化症（ALS）、阿尔茨海默病、帕金森病以及某些类型的囊性纤维化均与蛋白质折叠质量控制组分直接相关2，因此，未来治疗手段的开发需要对这些基础过程有基本的理解。我们的实验挑战在于阐明细胞如何整合损伤信号，并启动针对不同情况而定制的应答反应。
蛋白质错误折叠之所以对细胞构成生存威胁，其主要原因在于错误折叠的蛋白质易于聚集，从而扰乱细胞内拥挤而精细的折叠环境1。即使在衰老、应激和氧化损伤的压力下，细胞蛋白质组的折叠稳态（即“蛋白质稳态”）仍由一个复杂的质量控制系统中不同机制单元协同作用来维持3,4。一类特化的分子伴侣机器能够结合非天然构象的多肽链，促进其折叠为天然构象1，将其靶向泛素-蛋白酶体系统进行降解5，或引导其进入具有保护作用的聚集包涵体6-9。
在真核生物中，细胞质内的蛋白质聚集质量控制负荷被分配到两个区室之间8-10：近核质量控制区室（JUNQ）和不溶性蛋白质沉积区室（IPOD）（图1 - 模型）。由蛋白质折叠质量控制系统介导泛素化的蛋白质会被运送至JUNQ，在此处通过蛋白酶体进行降解处理。而未被泛素化的错误折叠蛋白质则被导向IPOD，并在该保护性区室内被主动聚集。
迄今为止，活细胞荧光显微镜的方法学范式主要是标记蛋白质，并在特定时间点追踪其在细胞内的位置，通常局限于二维观察。随着新技术使研究者以前所未有的精度进入活细胞的亚微米尺度，细胞质的动态结构逐渐显现，成为实验表征面临的一个全新而富有挑战性的前沿领域。本文介绍一种可随时间快速监测酵母细胞质中多种荧光标记蛋白质三维空间分布的方法。三维时间序列成像（四维成像）不仅是一项技术挑战，更推动了分析细胞结构所依赖的概念框架发生根本性转变。
我们利用活酵母细胞中的胞质折叠传感器蛋白，通过快速4D荧光成像技术，可视化错误折叠蛋白在细胞聚集体质量控制中的不同命运。Ubc9蛋白的温度敏感突变体10-12（Ubc9ts）在作为细胞蛋白质稳态的传感器以及追踪聚集体质量控制的生理模型方面均表现出极高的有效性。与大多数温度敏感蛋白一样，在允许温度下，由于细胞内分子伴侣的活性作用，Ubc9ts能够完全正确折叠并发挥功能。当温度超过30 °C，或细胞遭遇错误折叠压力时，Ubc9ts会发生错误折叠，其命运与因突变、热变性或氧化损伤而错误折叠的天然球状蛋白相同。通过将其与GFP或其他荧光染料融合，可在三维空间中追踪其形成应激焦点（Stress Foci）的过程，或观察其被定向转运至JUNQ或IPOD的路径。

<img alt="Protein aggregation and degradation diagram; poly-Ub, IPOD, JUNQ pathways in cellular stress." fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50083/50083fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50083/50083fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
 图1. 模型：错误折叠蛋白的亚细胞区室化。 质量控制机制将错误折叠的蛋白质定向分选至具有不同功能的特定区室：被标记为降解的可溶性蛋白质会经历多聚泛素化，并被运送至 朱xta-N核Q质量控制区室（JUNQ）。无法被泛素化的不溶性蛋白将被运送至保护性隔离区室 I不溶性ProteinD包涵体（IPOD），位于液泡附近，在此处发生主动聚集。
<img alt="Cell stress response, confocal microscopy images; protein aggregation at varying temperatures." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50083/50083fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50083/50083fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
 图2. 利用GFP-Ubc9模拟蛋白质错误折叠ts. 在正常条件下，GFP-Ubc9ts （绿色）为天然折叠状态，弥散定位于细胞核和细胞质中。细胞核由NLS-TFP（红色）标记。Ubc9的表达ts 通过添加2%葡萄糖在成像前终止反应，所有实验均采用此步骤。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50083/50083fig2large.jpg" target="_blank"> 单击此处查看大图</a>.
<ol>
	<li>温度升至 37 °C 时，GFP-Ubc9ts（绿色）发生错误折叠并形成细胞质应激小体。细胞核由 NLS-TFP（红色）标记。</li>
	<li>在 23 °C 从热激中恢复后，热变性的 GFP-Ubc9ts 被降解，表现为荧光水平降低。</li>
	<li>温度升至 37 °C 并使用 80 µM MG132 抑制蛋白酶体时，GFP-Ubc9ts 发生错误折叠，并被加工形成 JUNQ 和 IPOD 包涵体。细胞核由 NLS-TFP（红色）标记。</li>
	<li>温度升至 37 °C 并抑制泛素化时，GFP-Ubc9ts 发生错误折叠并被加工形成 IPOD 包涵体。细胞核由 NLS-TFP（红色）标记。通过过表达泛素蛋白酶 4（Ubp4）来阻断 Ubc9ts 的泛素化。</li>
</ol>
<img alt="在37°C下随时间推移的蛋白酶体抑制显微镜图像，显示蛋白质聚集情况。" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50083/50083fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50083/50083fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="图3"> 
 图3. JUNQ与IPOD形成的延时观察。 当温度升至37°C并使用80 µM MG132抑制蛋白酶体后，GFP-Ubc9ts应激焦点被加工形成JUNQ和IPOD包涵体。细胞核由NLS-TFP（红色）标记。三维图像每4分钟采集一次。（另见影片1）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50083/50083fig3large.jpg" target="_blank"> 点击此处查看高清大图</a>。

细胞存活能力依赖于对蛋白质错误折叠的及时且高效管理。本文介绍一种用于观察错误折叠蛋白质不同命运的方法：重折叠、降解或在包涵体中被隔离。我们展示了利用折叠传感器Ubc9ts，结合4D显微镜技术，在活细胞中监测蛋白质稳态及聚集质量控制的过程。

活细胞中蛋白质聚集的4D成像

任何活细胞的关键任务之一是在不断变化的环境条件下维持新合成蛋白质的正确折叠。

该实验系统可在活细胞中获取高分辨率的三维荧光图像，用于监测和分析蛋白质折叠质量控制的时空动态。首先，制备用于研究快速移动蛋白质复合物的细胞。以高Z轴分辨率采集Z层图像序列。然后获取由Zacks组成的序列图像，将得到的图像渲染成三维动画，并对这些图像进行分析。最终，四维成像技术能够在不同条件下追踪细胞内动态且瞬时的现象。相较于现有的宽场显微镜和延时成像等方法，四维成像的主要优势在于，它能够以高分辨率同时可视化细胞内全部蛋白质群体的动力学行为及其空间-时间分布。该方法有助于解答细胞生物学领域中关于蛋白质聚集、质量控制以及蛋白质折叠的关键问题。这些过程具有高度动态性和瞬时性，因此若无高时间分辨率和空间分辨率，其中许多过程将无法被观察到。该方法可为聚集体的质量控制提供深入见解，还可彻底改变对蛋白质相互作用与动态过程的研究。通常，初学者在应用该方法时会遇到困难，因为对内源性标记或低表达蛋白质进行三维成像需要系统的高度稳定性。高灵敏度且低光漂白的检测方法 
将酵母菌株转化含有荧光蛋白（Fluor）与细胞质折叠传感器蛋白（如UBC9的温度敏感突变体）融合蛋白表达质粒。将转化后的酵母在含2%棉子糖的合成培养基中培养24小时，随后转接至含2%半乳糖的培养基中过夜诱导。将待测菌株稀释至OD600约为0.2，继续培养4至6小时，直至菌液OD600达到0.8至1.0。成像前30分钟，使用添加2%葡萄糖的合成培养基抑制表达。此步骤可实现仅对已翻译并正确折叠的表达蛋白群体进行监测。现在将细胞在 37 摄氏度下进行 20 分钟的热激处理。为诱导蛋白错误折叠，选择合适的载物台以在四维成像采集过程中保持聚焦。在培养板底部加入浓度为 0.25 毫克/毫升的刀豆球蛋白 A（con A），覆盖 10 分钟。使用刀豆球蛋白 A 可使细胞贴附于载玻片上，从而实现对单个细胞进行长时间的追踪观察。吸除刀豆球蛋白 A 溶液，用吸管吸取残留液体，并在化学通风橱中将培养板干燥。然后加入 200 µL 酵母样品。孵育 15 分钟，使细胞贴附于培养板。用培养基洗涤三次，以获得用于酵母成像的单层细胞。使用共聚焦显微镜，并根据随文所述进行若干非标准改装。该酵母成像系统最多可使用四根激光器和四个配备滤光片的光电倍增管。我们的大部分成像工作采用绿色滤光片组用于EGFP，以及红色滤光片组用于mCherry和tdTomato。同时为共聚焦显微镜配备 pi nano 压电聚焦载物台完美聚焦系统，并启用 galvano 扫描器和共振扫描器，平衡显微镜系统直至达到所需温度。在成像前，根据成像介质与样品介质的折射率，选择合适的物镜——水镜、油镜或空气镜。根据培养板的厚度调节校正环。使用镜头纸和乙醇清洁物镜。同时清洁承载样品的载玻片。将样品板牢固地放置在载物台固定器上，并检查样品固定器的稳定性，以确保每个样品的设置正确无误。使用荧光微珠并通过目镜观察点扩散函数，同时调节校正环。确定酵母的位置和方向。接着，打开所需的落射荧光光源，聚焦于呈现相关表型的细胞。然后使用明场观察细胞形态和质地，评估细胞健康状况和活力。利用与SV40和LS信号肽融合的TD番茄荧光蛋白标记细胞核。TFP的大小是GFP的两倍。由于其位于细胞核的扩散限制之上，因此非常适合作为细胞核标记物。使用绿色488纳米激光同时激发TFP和GFP，但将绿色和红色发射光分别收集到两个独立的PMT中以实现光谱分辨。为尽量减少噪声和饱和，需根据随附稿件中的详细说明调整激光功率和针孔直径。若不同的光源发出相同的波长，可使用光谱检测器功能，该功能支持选择虚拟滤光片，进而按照实验设计采集延时图像。Misfolded Protein U BBC nine Ts 提供了一个模型系统，用于追踪聚集体质量控制在时间和空间上的动态变化。在允许温度下，UBC nine Ts 在细胞质中处于正确折叠状态并均匀分布；在热诱导发生错误折叠后，其在细胞核和细胞质中均出现。最初会形成在细胞质中快速扩散的小型聚集点，这些聚集点将被进一步加工并进行蛋白酶体降解。当蛋白酶体受到部分抑制时，这些点状结构会在大约两小时内转变为垃圾样包涵体和iPod包涵体。在正常条件下，GFP UBC nine Ts处于天然折叠状态，弥散分布于细胞核和细胞质中，如图中绿色所示。当温度升至37摄氏度后，该融合蛋白发生错误折叠，在热休克后恢复至23摄氏度时形成细胞质内的点状聚集物。热变性的G-F-P-U-B-C nine Ts由于荧光水平降低而显示降解。细胞核被N-L-S-T-F-P标记为红色。当温度升至37摄氏度并同时抑制蛋白酶体时，G-F-P-U-B-C nine Ts发生错误折叠，并被加工形成junk和iPod包涵体。此处过表达泛素蛋白酶四，以阻断泛素化抑制作用，结合温度 shift，导致 G-F-P-U-B-C 九 Ts 加工进入 iPod 包涵体。以四分钟间隔采集的这些延时图像清晰地展示了 junk 和 iPod 形成的动态过程。该技术可用于通过 UBC 九 Ts 作为折叠传感器，随时间监测细胞内的蛋白质稳态。四维成像也可在其他模式系统中进行，例如哺乳动物细胞和秀丽隐杆线虫（C. elegans）。四维成像还能揭示聚集体质量控制中的其他细微事件，例如可溶性聚集体应激焦点的形成与动态变化，以及聚集体向“垃圾”区室和iPod区室的递送过程。

4d-imaging-of-protein-aggregation-in-live-cells

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

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许多内在无序蛋白已被证实参与形成高度动态的生物分子凝聚体，这种行为对多种细胞过程具有重要意义。本文介绍了一种基于单分子成像的方法，用于定量分析蛋白质在活细胞生物分子凝聚体中相互作用的动力学过程。...

生物分子凝聚体中蛋白质相互作用动力学的单分子测量

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活细胞中蛋白质聚集的4D成像

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