Name: 半胱氨酸残基的溶剂可及性分析玉米rayado菲诺病毒烟草 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 了解玉米rayado菲诺病毒衣壳蛋白在烟草中表达后形成病毒样颗粒的半胱氨酸残基溶剂可及性分析方法，通过荧光素标记和NHS-PEG4-马来酰亚胺化学交联技术实现肽段偶联，为植物病毒纳米材料的功能化修饰提供可重复方案。

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1. 病毒接种及从Nicotiana benthamiana植物中纯化病毒样颗粒
<ol>
	<li>使用 Ambion 的 T7-mMessage mMachine 试剂盒，从携带 MRFV 野生型（wt）和半胱氨酸突变型衣壳蛋白（CP）基因的基于Potato virus X（PVX）载体质粒中制备带帽的 T7-RNA 转录本12。</li>
	<li>对每个 T7 转录反应，用 10 μl 反应液接种两片完全展开的N. benthamiana叶片，并将植株置于温室中培养 10 天，培养条件为：光照 16 小时（25,000–30,000 lux），25 °C，相对湿度 60%；黑暗 8 小时，20 °C。</li>
	<li>接种后第 10 天（dpi）收获N. benthamiana病毒感染的叶片，称取植物组织（50 克）并置于冰上。</li>
	<li>在 100 ml 预冷的 0.5 M 柠檬酸钠缓冲液（pH 5.5）中（每克植物组织使用 2 ml 缓冲液），用搅拌器匀浆植物材料。</li>
	<li>将匀浆液通过三层纱布过滤，并在 27,000 × g 条件下离心 30 分钟以澄清；将上清液转移至预冷的量筒中测定体积，再转移至预冷的无菌烧杯中；弃去沉淀。</li>
	<li>向上清液中加入 10% 聚乙二醇 8,000（PEG 8,000），在 4 °C 下搅拌 15 分钟，随后在 4 °C 下继续孵育 45 分钟，以沉淀病毒样颗粒（VLPs）-PEG 复合物。</li>
	<li>在 4 °C 下以 27,000 × g 离心 20 分钟，弃去上清液。</li>
	<li>向沉淀中加入 8 ml 含 2% Triton X-100 的 0.05 M 柠檬酸钠缓冲液（pH 5.5），充分旋涡振荡离心管以充分释放沉淀；将沉淀与缓冲液转移至预冷的无菌烧杯中；立即用 2 ml 相同缓冲液冲洗离心管，并将冲洗液加入烧杯中；在 4 °C 下搅拌悬浮液直至沉淀完全溶解（通常需 1 小时）。</li>
	<li>在 27,000 × g 条件下离心 5 分钟以澄清，弃去沉淀；将上清液在 4 °C 下以 140,000 × g 离心 2 小时。</li>
	<li>将沉淀重悬于 1 ml 0.05 M 柠檬酸钠缓冲液（pH 5.5）中，并将该悬浮液小心铺加到用 0.05 M 柠檬酸钠缓冲液（pH 5.5）配制的 10–40% 蔗糖梯度上。</li>
	<li>在 4 °C 下以 140,000 × g 离心 3 小时。</li>
	<li>用光线照射离心管顶部，收集距管顶约 4 cm 处的光散射上层条带，用 0.05 M 柠檬酸钠缓冲液（pH 5.5）稀释后，在 4 °C 下以 140,000 × g 再次离心 3 小时。</li>
	<li>将最终沉淀重悬于 0.5 ml 无菌水中，于 4 °C 保存，可稳定保存长达六个月。</li>
	<li>通过 Bradford 蛋白质定量法测定 VLPs 浓度；VLPs 产量为每克植物组织 1 至 3 μg。</li>
</ol>
2. VLP 的荧光素-5-马来酰亚胺标记反应
<ol>
	<li>在50 mM磷酸钠缓冲液（pH 7.0；含1 mM EDTA）中配制1 mM的荧光素-5-马来酰亚胺（427.37 g/mol）溶液。使用涡旋振荡器混匀，并确认完全溶解。用铝箔包裹管子以避光。</li>
	<li>将荧光素-5-马来酰亚胺加入第1步制备的VLPs中并混匀。荧光素-5-马来酰亚胺的摩尔量应为巯基摩尔量的25倍。通常，使用浓度为1 μg/μl的VLPs 30 μl和荧光素-5-马来酰亚胺溶液60 μl可获得理想结果。</li>
	<li>在室温下孵育反应2小时，或在4 °C过夜孵育。</li>
	<li>通过加入二硫苏糖醇（DTT）至终浓度为50 mM来终止反应。</li>
	<li>使用脱盐离心柱（Thermo Scientific Inc, Rockford IL）并通过在室温下以1,500 × g离心2分钟去除未反应的荧光素。</li>
	<li>进行SDS-PAGE分析时，向每种反应液10 μl中加入10 μl的2× SDS-PAGE Laemmli上样缓冲液。将标记后的蛋白避光保存于4 °C，可稳定存放一个月，或分装为单次使用 aliquots 后保存于-20 °C，最长可保存3个月。</li>
</ol>
3. 生物素标记反应及掺入率测定
<ol>
	<li>使用脱盐离心柱（Thermo Scientific Inc., Rockford IL）将步骤1中制备的病毒样颗粒（VLPs）从水缓冲液置换至磷酸盐缓冲盐水（PBS, pH 7.0）中。</li>
	<li>在“免称量”型马来酰亚胺-PEG2-生物素（maleimide-PEG2-biotin）中加入190 μl PBS，通过反复吹打混匀，配制20 mM的储备溶液。</li>
	<li>将马来酰亚胺-PEG2-生物素加入VLPs溶液中并混匀。对于浓度≤ 2 mg/ml的VLPs溶液，使用10倍摩尔过量的试剂。</li>
	<li>在室温下孵育反应体系4小时。</li>
	<li>使用脱盐离心柱（Thermo Scientific Inc, Rockford IL）并通过在室温下以1,500 × g离心2分钟，去除未反应的马来酰亚胺-PEG2-生物素。</li>
	<li>使用Pierce生物素定量试剂盒（Thermo Scientific）并按照制造商说明书操作，测定每摩尔VLPs所结合的生物素摩尔数。</li>
</ol>
4. Cys 2-VLPs 与 F 肽的交联
<ol>
	<li>在步骤2中产生可用于交联的游离半胱氨酸残基的VLPs（Cys 2-VLPs）用于后续步骤。通过将10 mg NHS-PEG4-马来酰亚胺交联剂溶解于680 μl二甲基亚砜中，配制新鲜的交联剂储备液（28.63 mM）。</li>
	<li>将一条17个（F）氨基酸长度的肽段（LLPNMOKDKEACAKAPL）溶解于50 μl偶联缓冲液（1 × PBS，pH 7.2；1 mM EDTA）中，终浓度为0.1 mM。</li>
	<li>向50 μl溶解的肽段（protein-NH2）中加入4 μl交联剂，使终浓度为1 mM（相对于0.1 mM肽段溶液为10倍摩尔过量）。</li>
	<li>在4 °C下孵育反应体系2小时。</li>
	<li>使用已用偶联缓冲液（1 × PBS，pH 7.2；1 mM EDTA）平衡的脱盐柱（Thermo Scientific Inc., Rockford IL），在室温下以1,500 × g离心1分钟，纯化交联后的肽段。</li>
	<li>设置反应体系，将VLPs（protein-SH）与交联后的肽段（protein-NH2）按摩尔比混合，该比例由反应中参与的巯基和活化氨基的数量以及VLPs与肽段之间的分子量差异决定。</li>
	<li>在室温下孵育反应混合物2小时，随后在4 °C继续孵育。</li>
	<li>对于Western blot分析，将所得偶联产物与Laemmli缓冲液按1:1体积比混合，煮沸10分钟，然后在预铸的10–20% Tris-甘氨酸凝胶（Invitrogen）上进行SDS-PAGE，接着电转至硝酸纤维素膜（Invitrogen）。用含0.05% Tween-20（PBS-Tween）和5%脱脂奶粉的1 × PBS（pH 7.2）封闭膜，随后用肽段特异性一抗孵育，再使用相应的碱性磷酸酶标记的二抗进行检测。</li>
</ol>

<ol><li>Barnhill, H., Reuther, R., Ferguson, P. L., Dreher, T. W., Wang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Turnip+yellow+mosaic+virus+as+a+chemoaddressable+bionanoparticle%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconj.+Chem%22%5BJournal%5D)">Turnip yellow mosaic virus as a chemoaddressable bionanoparticle.</a> Bioconj. Chem. 18, 852-859 (2007).</li>
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<li>Young, M., Willits, D., Uchida, M., Douglas, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+viruses+as+biotemplates+for+materials+and+their+use+in+nanotechnology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Plant viruses as biotemplates for materials and their use in nanotechnology.</a> Annu. Rev. Phytopathol. 46, 361-384 (2008).</li>
</ol>

本文提及的商业产品名称仅为提供具体信息之目的，并不意味着美国农业部推荐或认可这些产品。

本文介绍的方法能够对植物来源的病毒样颗粒（VLP）表面以及其他蛋白质复合物上存在的反应性半胱氨酸进行高灵敏度且快速的分析。马来酰亚胺类化合物是特异性针对巯基的试剂，可与含游离巯基的分子反应，形成稳定的硫醚键。该方法利用马来酰亚胺对未与其他氨基酸相互作用的巯基基团的高度特异性。在整个操作过程中，维持VLP的天然结构至关重要。在所述应用中，反应在天然条件下、pH 7的环境中进行，以保持VLP的天然构象。在中性pH条件下，马来酰亚胺对游离巯基具有最佳反应活性，从而可将荧光素或生物素标记至暴露且可被修饰的半胱氨酸残基上。
在交联反应中也采用温和的 pH（6.5–7.5）和缓冲条件。病毒样颗粒（VLPs）上功能基团的数量决定了交联剂与 VLPs 之间的适当比例。当存在较多功能基团时，可使用较低的交联剂与蛋白质比例；反之，当可用功能基团较少时，则采用较高的交联剂与蛋白质比例。
空间臂长度、可裂解性、化学组成、分子大小和溶解度等多种因素最终决定了所用交联剂的选择。此外，交联剂的选择还取决于参与偶联的两种蛋白质（在本例中为病毒样颗粒VLPs和...

<table><tbody><tr><td>超薄壁透明管</td><td>Beckman</td><td>344059</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 试剂盒</td><td>Life Tecnologies</td><td>AM1344M</td><td></td></tr><tr><td>荧光素-5-马来酰亚胺</td><td>Thermo Scientific Life Technologies</td><td>46130 F150</td><td>46130 已停用，需替换为 F150</td></tr><tr><td>Pierce 生物素定量试剂盒</td><td>Thermo Scientific</td><td>28005</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link 马来酰亚胺-PEG2-生物素，免称量形式</td><td>Thermo Scientific</td><td>21901</td><td></td></tr><tr><td>SM(PEG)n 交联剂</td><td>Thermo Scientific</td><td>22107</td><td></td></tr><tr><td>10-20% Tris-甘氨酸凝胶</td><td>Invitrogen</td><td>EC61352</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli 缓冲液</td><td>Bio-Rad</td><td>1610737</td><td></td></tr><tr><td>Tris-甘氨酸 SDS 电泳缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>LC2675</td><td></td></tr><tr><td>Tris-甘氨酸转移缓冲液</td><td>Invitrogen</td><td>LC3675</td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜滤纸夹心结构</td><td>Invitrogen</td><td>LC2001</td><td></td></tr><tr><td>碱性磷酸酶标记的亲和纯化兔 IgG 抗体</td><td>Kirkegaard and Perry Laboratories</td><td>0751516</td><td></td></tr><tr><td>NBT/BCIP 磷酸酶底物</td><td>Kirkegaard and Perry Laboratories</td><td>508107</td><td></td></tr></tbody></table>

半胱氨酸残基溶剂可及性的分析maize rayado fino virus病毒样颗粒的制备nicotiana benthamiana植物与多肽至病毒样颗粒的交联

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

模拟并利用病毒的特性及其理化和物理特征，有望为解决全球一些最紧迫的挑战提供方案。病毒种类繁多，类型广泛，加之其独特的性质，为基于病毒的技术应用带来了无限可能。病毒能够自我组装成具有明确形状和大小、对称性特异、多价性以及在广泛温度和pH条件下保持稳定特性的颗粒。鉴于具有如此卓越的多种特性，病毒已被提议用于生物材料9、疫苗14, 15、电子材料、化学工具以及分子电子容器4, 5, 10, 11, 16, 18, 12等领域。
为了在纳米技术中利用病毒，必须对病毒的天然形态进行改造，以赋予其新的功能。这一具有挑战性的过程可通过多种机制实现，包括对病毒基因组进行遗传修饰，以及将外源性或目标分子化学连接到病毒颗粒的反应性基团上8。对病毒进行修饰的能力主要取决于病毒的物理化学和物理特性。此外，遗传或物理化学修饰必须在不损害病毒天然结构和功能的前提下进行。Maize rayado fino virus（MRFV）的衣壳蛋白可在Escherichia coli中自我组装，形成稳定且中空的病毒样颗粒（VLPs），这些颗粒通过蛋白质-蛋白质相互作用得以稳定，可用于基于病毒的技术应用8。在烟草植物中产生的VLPs已被研究作为共价展示多种肽段的支架13。本文中，我们描述了以下两个步骤：1）确定病毒衣壳中哪些溶剂可及的半胱氨酸残基可用于修饰；2）将肽段生物偶联至经修饰的衣壳上。通过利用天然或突变引入的氨基酸残基以及标准偶联技术，已在多种植物病毒表面成功展示多种材料，例如Brome mosaic virus3、Carnation mottle virus12、Cowpea chlorotic mottle virus6、Tobacco mosaic virus17、Turnip yellow mosaic virus1以及MRFV13。

瞬时表达突变型马铃薯卷叶病毒外壳蛋白（CP）基因 N. benthamiana 在基于PVX载体中产生病毒样颗粒的植物中的描述 图1通过PCR扩增修饰的MRFV外壳蛋白基因，然后将其置于基于PVX的载体pP2C2S中重复的亚基因组CP启动子的转录调控之下。 2（由英国诺里奇塞恩斯伯里实验室 D. Baulcombe 惠赠）。 体外 RNA转录产生RNA转录本，随后用于接种 N. benthamiana 植物。在被感染的植物中（图2AMRFV-CP 亚基形成病毒样颗粒（VLPs）图2B）可轻松纯化。随后，将病毒样颗粒（VLPs）与肽段进行交联。
MRFV衣壳蛋白中反应性氨基酸的一个示例如图3所示。若氨基酸位于蛋白表面暴露区域，则所选的每个氨基酸均可用于连接官能团。化学修饰技术包括传统的生物偶联策略，例如赖氨酸氨基的酰化、半胱氨酸巯基的烷基化，以及羧酸残基的活化并与外源胺类偶联...

本文描述了一种分析玉米粗缩病毒（Maize rayado fino virus，MRFV）病毒样颗粒（VLPs）中半胱氨酸残基巯基溶剂可及性，随后进行肽交联反应的方法。该方法利用了VLPs表面存在的多种化学基团，这些基团可作为特异性反应的靶点。

半胱氨酸残基溶剂可及性的分析Maize rayado fino virus病毒样颗粒的制备Nicotiana benthamiana植物与多肽至病毒样颗粒的交联

模拟并利用病毒的特性及其物理化学和物理特征，有望为解决全球某些重大问题提供方案。

本实验的总体目标是对病毒样颗粒（VLP）表面的半胱氨酸残基进行溶剂可及性分析，随后将肽段与病毒样颗粒上的半胱氨酸进行交联。该过程首先将玉米粗缩病毒（Maize rayado fino virus, MRFV）的外壳蛋白克隆至基于马铃薯X病毒的病毒载体中。接着，用改造后的病毒感染本氏烟草（N. benthamiana）植株，并纯化由外壳蛋白自组装形成的MRFV病毒样颗粒。最后，使用氨-PEG4-马来酰亚胺（ammonia-PEG4-maleimide）将病毒样颗粒与肽段进行交联，并通过蛋白质印迹（western blot）检测交联产物。实验结果通过蛋白质印迹分析证实了VLP-肽复合物的成功生成。该技术拓展了如何化学修饰病毒及病毒样颗粒表面以制备新型纳米材料的知识体系。 从携带MRFV野生型和半胱氨酸突变型外壳蛋白基因的马铃薯X病毒载体质粒中体外转录生成带帽的T7-RNA后，取两份各10微升的转录产物分别接种两片本氏烟（N. benthamiana）叶片。将植株置于温室中培养10天，培养条件为60%湿度，16小时光照（25摄氏度）和8小时黑暗（20摄氏度）。培养结束后，采集病毒感染的叶片组织，称量植物组织并置于冰上。按照文本所述方案纯化病毒样颗粒（VLPs）后，配制1毫摩尔的荧光素-5-马来酰亚胺（Fluorescein-5-maleimide）溶液，溶剂为50毫摩尔磷酸钠缓冲液（pH 7.0）含1毫摩尔EDTA。涡旋振荡至完全溶解，并用铝箔包裹避光保存。取约30微升浓度为1微克/微升的VLPs与60微升荧光素-5-马来酰亚胺溶液混合，室温孵育2小时或4摄氏度过夜。通过加入DTT至终浓度50毫摩尔终止反应。使用脱盐离心柱去除未反应的荧光素。为观察具有可用于交联的游离半胱氨酸残基的VLPs，取10微升反应产物加入10微升2×上样缓冲液，进行SDS-PAGE分析。标记后的蛋白样品应避光保存，4摄氏度可保存一个月，或分装为单次使用 aliquots 后于-20摄氏度保存不超过三个月。通过将10毫克NHS-PEG4-马来酰亚胺交联剂溶解于680微升二甲基亚砜中，制备新鲜的交联储备液。将一条长17个（F）氨基酸的多肽溶解于50微升偶联缓冲液中，使其浓度为0.1毫摩尔。向50微升溶解的多肽中加入4微升交联剂，使终浓度为1毫摩尔。在4摄氏度下孵育反应2小时。然后使用脱盐柱纯化反应产物。利用具有可利用的半胱氨酸残基的VLPs与交联多肽，根据反应中涉及的巯基和活化氨基的数量以及VLPs与多肽之间的分子量差异，设定摩尔比配制反应混合物。在室温下孵育反应2小时后，按照文本方案进行SDS-PAGE和Western印迹分析。此处展示了MRFV外壳蛋白中具有反应性的氨基酸示例。所选择的每个氨基酸，只要位于蛋白表面暴露区域，均可用于连接各种功能基团。化学修饰技术包括传统的生物偶联策略，例如赖氨酸的氨基酰化、半胱氨酸的巯基烷基化，以及羧酸残基的活化并与外源胺类分子偶联。此外，酪氨酸和色氨酸的芳香基团可通过重氮化和烷基化反应成为生物偶联的潜在靶点。图中展示了病毒样颗粒（VLPs）中半胱氨酸残基对巯基特异性试剂的溶剂可及性。在天然条件下，纯化的野生型VLPs以及在CP基因第107至111位和第192至194位携带半胱氨酸残基的cys-VLP突变体，均不与巯基特异性试剂发生反应。只有在CP基因第125至129位携带半胱氨酸残基的cys-VLP突变体，才会与荧光素-5-马来酰亚胺反应并产生橙色荧光。该结果表明，第二泳道中的VLPs具有特定的空间几何排列，使得其半胱氨酸残基暴露于溶剂中并形成游离的巯基，而第一泳道和第三泳道样品中的半胱氨酸残基可能在衣壳蛋白折叠过程中参与了二硫键的形成。使用马来酰亚胺-PEG2-生物素进行标记反应，随后进行生物素化检测，是分析cys残基溶剂可及性的另一个示例。由于生物素分子相对较小，可在VLPs上实现多个拷贝的偶联，每个生物素分子均可结合一个亲和素分子，如图所示。生物素化的程度为每摩尔蛋白结合84.74摩尔的生物素，表明了连接到VLPs上的生物素分子数量，从而反映了可在其外表面展示的配体数目。由于VLPs表面存在多个巯基，因此可通过NHS-PEG4-马来酰亚胺交联反应连接多肽。该试剂是一种异双功能交联剂，含有 N-羟基琥珀酰亚胺（NHS-酯）和马来酰亚胺等活性末端基团，可实现含胺基和含巯基分子的共价偶联。在此示例中，NHS 酯与伯胺反应形成酰胺键，而马来酰亚胺则与巯基反应形成稳定的硫酯键。如图所示，交联反应生成了 VLP-肽复合物，该复合物在 Western 印迹中可与特异性抗体发生免疫反应。这一进展向病毒学领域的研究人员展示了如何利用病毒颗粒作为支架，以规则的几何阵列固定多种配体，从而实现多种应用。

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