Name: 结合免疫荧光和三维保存的间期核荧光原位杂交DNA研究在3D核组织的变化 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 55 s
Description: 学习结合免疫荧光与DNA FISH技术，利用三维共聚焦显微镜同时检测组蛋白修饰和DNA序列，研究染色质动态变化与核内基因组位点的空间组织关系。

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我们感谢Skok实验室的成员，特别是Susannah Hewitt，对本研究的讨论和意见。本工作由美国国立卫生研究院基金R01GM086852和RC1CA145746（J.A.S.）资助。J.A.S. 是白血病与淋巴瘤学会学者。J.C. 是癌症研究所Irvington研究所研究员。M.M. 获得美国国家科学基金会综合研究生教育与研究培训项目基金（NSF IGERT 0333389）的支持。

1. 使用荧光染料标记DNA探针：缺口平移法（约6小时）
<ol>
 <li>可用于标记的模板包括：通过大量提取制备的BAC DNA、质粒或PCR产物，均需用H2O重悬。注意：为获得较强的FISH信号，探针应至少跨越10 kb。</li>
 <li>在RNase A中37 °C孵育30分钟（所有试剂见表1）。</li>
 <li>在16 °C下进行缺口平移反应2小时（见表2和表3）。也可采用其他直接标记方法（例如：FISH Tag，Invitrogen）。</li>
 <li>在-80 °C下灭活反应1小时，或在-20 °C下过夜。</li>
 <li>在2%琼脂糖凝胶上测定探针大小。条带应分布在100至1,000 bp之间，主要集中在约300–500 bp（注意：Cy5标记的探针条带不可见）。若DNA消化不足，可向反应体系中补充更多DNA聚合酶I和DNase I，并在16 °C下再孵育2小时。</li>
 <li>将探针置于装有H2O的两升烧杯中，使用0.025 mm滤膜在避光条件下纯化2小时。</li>
 <li>向探针中加入封闭因子，具体如下：每10 μg DNA探针加入10 μg Cot-1 DNA、10 μg Hybloc DNA和100 μg鲑精DNA。DNA探针储存于-20 °C。</li>
</ol>
2. 探针沉淀/变性/预退火（3-4 小时）
<ol>
 <li>每个盖玻片使用 0.3 μg 至 1 μg 的 DNA 探针。将探针与 0.1 体积的 3M NaAc（pH 5.2）和 2.5 体积的 100% 乙醇混合，在 -80 °C 下孵育 1 小时或在 -20 °C 下过夜，随后在 4 °C 下以 13,000 rpm 离心 30 分钟。注意，DNA 探针的用量可根据 DNA 质量和杂交的核区域进行调整。采用其他直接标记方法可能允许减少探针用量。在同一张载玻片上检测多个 DNA FISH 信号时，不同探针可共同沉淀（不应预先退火的探针除外，例如重复序列）。同时进行的多个实验所用探针也可共同沉淀。沉淀物的颜色应根据所用荧光染料呈浅色（若探针量较少，沉淀可能不可见）。</li>
 <li>将沉淀物干燥，并在避光条件下，于 37–45 °C 下使用 15 μl 杂交缓冲液（见表 4）每盖玻片重悬，轻轻振荡（使用 Eppendorf Thermomixer）约 20 分钟。</li>
 <li>在 75–95 °C 下使探针变性 5 分钟。</li>
 <li>在 37 °C 下预退火 30–60 分钟。预退火时间可根据探针的复杂性和质量进行调整。</li>
 <li>将探针加入盖玻片，进行过夜杂交（见第 3 节）。</li>
</ol>
3. 三维 DNA FISH——第一天（约 3 小时）
<ol>
 <li>将非贴壁细胞浓缩于少量1×PBS中（每张盖玻片约2×105个细胞，体积为5–10 μl 1×PBS），滴加至经多聚-L-赖氨酸包被的盖玻片中心。贴壁细胞应培养于盖玻片上至少24小时（约70%融合度）（盖玻片可用0.1%明胶包被）。将18×18至24×24 mm的方形盖玻片置于6孔板中，整个实验过程中每孔使用2 ml溶液（也可使用直径1.5 mm的圆形盖玻片，置于12/24孔板中）。</li>
 <li>用含2%多聚甲醛的1×PBS（pH 7–7.4）在室温下固定细胞10分钟（4%多聚甲醛储备液可分装后于-20 °C保存）。多聚甲醛可购买现成溶液（16%），也可由粉末或颗粒配制成4%储备液。将多聚甲醛粉末溶于1×PBS中，温度需高于&gt;60 °C（可将pH调至8–9以促进溶解），冰上冷却后调节pH至7–7.4，过滤，分装至离心管中，于-20 °C可保存数周。</li>
 <li>用1×PBS洗涤三次后，在冰上用含0.4% Triton X-100的1×PBS冰浴处理5分钟以通透细胞。通透时间可根据细胞类型进行调整。注意：若DNA FISH与免疫荧光联合进行，应在本步骤进行免疫染色（见第4节）。</li>
 <li>用1×PBS洗涤三次后，加入含0.1 μg/μl RNase A的1×PBS溶液，37 °C孵育1小时。将盖玻片细胞面向下置于涂有100 μl溶液的Parafilm或载玻片上，放入湿盒中。随后用镊子小心取下盖玻片。若遇阻力，应先用1×PBS浸润盖玻片，避免损伤细胞。</li>
 <li>用1×PBS洗涤三次后，在冰上用含0.7% Triton X-100的0.1 M HCl冰浴处理10分钟以进一步通透细胞。</li>
 <li>用1×PBS洗涤三次后，在室温下用1.9 M HCl处理30分钟以变性细胞DNA。或者，也可在50%甲酰胺/2×SSC溶液中75–80 °C处理至少30分钟进行变性。注意：杂交时间（及温度）可根据细胞类型进行优化。</li>
 <li>用预冷的1×PBS洗涤三次后，在避光湿盒中，将盖玻片细胞面向下置于载玻片上15 μl探针液滴中，37 °C过夜杂交，并用橡胶胶水密封。</li>
</ol>
4. 三维免疫荧光原位杂交 - 第一天（约 6-7 小时）
<ol>
 <li>对于联合免疫荧光与DNA FISH实验，免疫染色应在使用0.4% Triton-X-100进行透化处理后进行（步骤 3.3）。</li>
 <li>在封闭液中室温孵育细胞30分钟（2.5% 牛血清白蛋白（BSA）、10% 正常山羊血清、0.1% Tween-20）。封闭液经过滤后分装至1.5 ml Eppendorf管中，可在-20 °C下保存数月。</li>
 <li>将针对目标蛋白或组蛋白修饰的一抗用封闭液稀释后，在湿盒中室温孵育1小时。此处以抗H2AX丝氨酸-139磷酸化抗体（γ-H2AX，Millipore；详见表5）为例。将载玻片细胞面向下置于Parafilm或载玻片上100 μl溶液液滴中。随后用镊子小心取下载玻片（必要时可用1x PBS淹没）。注意：一抗的稀释比例和孵育时间可根据抗体质量和细胞类型进行调整。</li>
 <li>用含0.2% BSA / 0.1% Tween-20 / 1x PBS的溶液在室温下振荡洗涤细胞，每次5分钟，共洗三次。</li>
 <li>将合适的荧光标记二抗用封闭液稀释后，在避光湿盒中室温孵育1小时。此处以山羊抗小鼠二抗（Alexa Fluor 488 或 555，Invitrogen；详见表5）为例进行检测。也可使用半抗原标记的二抗（如生物素、地高辛等）。若使用此类二抗，可在过夜DNA-FISH杂交前后增加相应的检测步骤（如链霉亲和素、抗地高辛抗体等）。</li>
 <li>在避光条件下，用含0.1% Tween-20 / 1x PBS的溶液在室温下振荡洗涤细胞，每次5分钟，共洗三次。</li>
 <li>用含2% 甲醛/1x PBS的固定液在避光条件下室温固定细胞10分钟。</li>
 <li>从RNase A孵育步骤开始继续进行DNA FISH操作（步骤 3.4）。</li>
</ol>
5. 三维DNA荧光原位杂交/免疫荧光原位杂交——第二天（约2小时）
<ol>
 <li>小心去除橡胶胶水，用2x SSC淹没盖玻片，用镊子小心取下，并将其放入含有洗涤液的孔中。</li>
 <li>在37 °C避光振荡条件下，用2x SSC洗涤细胞30分钟。</li>
 <li>在室温避光振荡条件下，用2x SSC洗涤细胞30分钟。</li>
 <li>在室温避光振荡条件下，用1x SSC洗涤细胞30分钟。注意：若使用甲酰胺进行变性，则应将洗涤步骤替换为以下操作：在50%甲酰胺/2x SSC中洗涤3次，在2x SSC中洗涤3次，每次5分钟，37 °C。</li>
 <li>将细胞封片于含1.5 μg/ml DAPI（4,6-二脒基-2-苯基吲哚）的ProLong Gold封片剂中，用于总DNA的复染。将盖玻片细胞面朝下置于载玻片上10–15 μl封片剂液滴中，并用指甲油封固。载玻片可在-20 °C保存数月。</li>
</ol>
6. 三维显微成像与分析
<ol>
 <li>可以使用不同的显微镜系统获取三维图像。在我们的实验中，使用徕卡SP5 AOBS共聚焦系统（声光束分离器）采集光学切片，切片间距为0.3 μm。请注意，光学层面之间的间距可根据分析类型进行调整。</li>
 <li>可以使用不同的软件和工具分析三维图像堆栈。我们使用Image J软件测量感兴趣位点之间的距离，并分析感兴趣位点与核内亚区室或蛋白质之间的不同类型的关联。</li>
 <li>所有统计分析均用于比较两种（或多种）不同的生物学条件，并进行成对显著性评估：不同细胞类型或阶段之间的比较，不同感兴趣位点之间的比较。在所有统计检验中，P值 ≤ 5.00E-2（a = 0.05）被认为具有显著性（1.00E-2 ≤ P ≤ 5.00E-2 * 显著；1.00E-3 ≤ P ≤ 1.00E-2 ** 极显著；P &lt; 1.00E-3 *** 高度显著）。</li>
</ol>
两个等位基因间距离分布的统计学分析。我们首先在整个测得的等位基因间距离范围内构建累积分布频率曲线。为了评估实测等位基因间距离分布差异的显著性，我们采用非参数双样本 Kolmogorov-Smirnov（KS）检验13,14。
使用最优距离截断值对两个等位基因的紧密关联（即配对）进行统计分析。 为确定两个等位基因或位点间距离差异最显著的范围，我们采用一系列双尾 Fisher 精确检验。 15 即，在每个测量距离处，我们检验某一条件在两个样本间的较短距离上是否显著富集。该分布中的最小值 P-数值表示应被视为紧密关联距离阈值的范围（即 两个等位基因配对）的显著性。随后，采用双尾Fisher精确检验在确定的截断值处评估两个等位基因配对的显著性15对执行的 Fisher 检验总数进行多重检验校正 16.
目标位点与核内亚结构区室或蛋白质关联性的统计分析。采用双尾 Fisher 精确检验来分析目标位点与不同区室或蛋白质之间关联性的显著性15。

<ol><li>Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-chromosome+inactivation+in+mouse+embryonic+stem+cells%3A+analysis+of+histone+modifications+and+transcriptional+activity+using+immunofluorescence+and+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH.</a> Methods in enzymology. , 376-405 (2004).</li>
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<li>Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H2AX%3A+the+histone+guardian+of+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+repair%22%5BJournal%5D)">H2AX: the histone guardian of the genome.</a> DNA repair. 3, 959-967 (2004).</li>
<li>Croft, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+localization+and+morphology+of+chromosomes+in+the+human+nucleus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus.</a> The Journal of cell biology. 145, 1119-1131 (1999).</li>
<li>Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., Heard, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+role+for+Xist+RNA+in+the+formation+of+a+repressive+nuclear+compartment+into+which+genes+are+recruited+when+silenced%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced.</a> Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).</li>
<li>Walter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+many+colors+in+FISH+on+3D-preserved+interphase+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenetic+and+genome+research%22%5BJournal%5D)">Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei.</a> Cytogenetic and genome research. 114, 367-378 (2006).</li>
<li>Toomre, D., Bewersdorf, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+wave+of+cellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+cell+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">A new wave of cellular imaging.</a> Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).</li>
<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).</li>
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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

上述技术已在本实验室用于分析发育中淋巴细胞中免疫球蛋白和Tcra/d位点V(D)J重组的调控机制30,31。我们确信该技术可经适当调整后用于检测不同细胞类型中的多种核蛋白、核区室及基因位点。实验方案可能需要进行优化，此时应重点关注以下几个主要步骤：首先，透化时间可根据细胞类型进行调整；其次，一抗孵育时间也可根据抗体质量和目标蛋白的丰度进行调整（例如，在某些情况下，可在4 °C下孵育过夜）。重要的是，变性步骤可进行调整，盐酸（HCl）处理可替换为甲酰胺3,4,34或氢氧化钠（NaOH）用于DNA FISH20。此外，仅针对DNA FISH，可在固定和透化后对细胞施加多次液氮冻融循环4,34。最后，尽管已有研究成功利用该方法检测多种组蛋白修饰、RNA聚合酶II及其共因子30,35，但针对其他核蛋白的免疫染色可在DNA FISH杂交后进行4。
三维图像分析可能涉及使用不同类型的显微镜，包括宽场落射荧光显微镜（结合去卷积技术...

表观遗传机制可触发发育过程及特定细胞类型中转录谱的建立与遗传。在某一层面，该机制涉及染色质包装的调控，从而界定基因组的活跃或沉默区域。在更大尺度上，基因组的全局三维结构以及细胞核架构也在转录模式的调控中发挥重要作用。因此，解析这些表观基因组特征对于全面理解基因调控机制至关重要6-11。
免疫荧光与三维DNA荧光原位杂交（3D DNA FISH）相结合，为评估细胞核内DNA序列和/或蛋白质之间的特异性相互作用/关联提供了独特的机会，可补充分子与生化分析。此外，尽管染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）或染色体构象捕获结合深度测序（4C-seq、5C、Hi-C）等全基因组高通量技术可提供细胞群体的全局数据12，免疫荧光/DNA FISH技术则能够在单细胞水平上进行分析。
本文介绍一种通过免疫荧光联合DNA FISH技术，结合三维显微镜成像与分析（三维免疫-FISH）同时检测组蛋白修饰和DNA序列的实验方案。该方案的优势在于能够联合可视化DNA并保持蛋白质结构的完整性。我们在该领域的研究经验使我们得以改进并简化了现有的实验流程。尽管我们已将此方法用于检测正在进行重组的淋巴细胞中的DNA双链断裂，但该技术同样适用于其他蛋白质及其他细胞类型。

<table><tbody><tr><td>H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>费舍尔</td><td># BP2470</td><td></td></tr><tr><td>RNase A</td><td>西格玛</td><td># R4642</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>西格玛</td><td># DNTP100</td><td></td></tr><tr><td>Alexa dUTP</td><td>英维特罗根</td><td># C11397 至 C-11401</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 或 Cy5 dUTP</td><td>费舍尔</td><td># 45-001-xxx</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>罗氏</td><td># 04536282001</td><td></td></tr><tr><td>DNA Pol I</td><td>新英格兰生物实验室</td><td># M0209</td><td></td></tr><tr><td>0.025 &amp;mu;m 滤膜</td><td>密理博</td><td># VSWP02500</td><td></td></tr><tr><td>Cot-1 DNA 1 mg/ml</td><td>英维特罗根</td><td># 18440</td><td></td></tr><tr><td>Hybloc DNA 1 mg/ml</td><td>应用遗传学</td><td># MHB</td><td></td></tr><tr><td>鲑鱼精DNA</td><td>西格玛</td><td># D1626</td><td>粉末，需用 H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 溶解至 10 mg/ml</td></tr><tr><td>NaAc（醋酸钠，pH 5.2，缓冲液）</td><td>西格玛</td><td># S7899</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll 400（分子生物学级）</td><td>费舍尔</td><td># 525</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯吡咯烷酮（分子生物学级）</td><td>费舍尔</td><td># BP431</td><td></td></tr><tr><td>硫酸葡聚糖粉末</td><td>西格玛</td><td># D8906</td><td></td></tr><tr><td>SSPE（氯化钠-磷酸钠-EDTA）20× 溶液</td><td>费舍尔</td><td># BP1328</td><td></td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>费舍尔</td><td># BP227</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>费舍尔</td><td># 12-548-B</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>费舍尔</td><td># 12-550</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>费舍尔</td><td># 0720080</td><td></td></tr><tr><td>PBS，10×</td><td>费舍尔</td><td># MT-46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>聚-L-赖氨酸溶液</td><td>西格玛</td><td># P8920</td><td></td></tr><tr><td>多聚甲醛微粒，95%</td><td>西格玛</td><td># 441244</td><td></td></tr><tr><td>曲拉通 X-100，分子生物学级</td><td>西格玛</td><td># T8787</td><td></td></tr><tr><td>BSA（牛血清白蛋白）第五组分</td><td>费舍尔</td><td># BP 1600</td><td></td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Vector Labs</td><td># S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20，分子生物学级</td><td>西格玛</td><td># P9416</td><td></td></tr><tr><td>SSC（柠檬酸钠-氯化钠）20× 溶液</td><td>费舍尔</td><td># BP1325</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 抗荧光淬灭封片剂</td><td>英维特罗根</td><td># P36930</td><td></td></tr><tr><td>DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）</td><td>西格玛</td><td># D9542</td><td></td></tr><tr><td>Best test 一次性涂层橡胶胶水</td><td>美术或办公用品商店</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;表 1. 特定试剂与小型设备&lt;/strong&gt;</td></tr></tbody></table>

结合免疫荧光与dna fish技术对三维保存的间期细胞核进行分析以研究三维核结构的变化

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

利用 DNA 探针在三维保存的细胞核中进行荧光原位杂交，随后进行三维共聚焦显微镜观察（3D DNA FISH），是可视化单个细胞中基因位点、染色体亚区或整个染色体区域位置的最直接方法。此类分析可揭示细胞核的整体结构，以及特定基因组位点和区域在核空间内的行为。另一方面，免疫荧光技术可用于检测核蛋白（修饰组蛋白、组蛋白变体及其修饰酶、转录机器及因子、核亚区室等）。将免疫荧光与 3D DNA FISH 相结合的主要挑战在于：一方面需保持抗体所识别表位的完整性以及细胞核的三维结构，另一方面需允许 DNA 探针充分渗透以检测基因位点或染色体区域1-5。本文提供了一种将染色质修饰与基因组位点在三维保存的细胞核中同时可视化的实验方案。

DNA 和免疫荧光原位杂交（immuno-FISH）被 Skok 实验室用于研究 B 细胞和 T 淋巴细胞发育过程中，抗原受体基因座 V(D)J 重组过程所伴随的细胞核内结构组织变化。上述技术使我们能够：i）测量基因座两端之间的距离（收缩程度）；ii）测量等位基因或基因座之间的距离（配对情况）；iii）分析基因座内部发生的 DNA 损伤；iv）评估等位基因和基因座相对于细胞核亚区室的位置关系（在本研究中为抑制性着丝粒周围异染色质）；以及 v）评估核蛋白在等位基因和基因座上的结合情况（在本研究中为磷酸化组蛋白 γ-H2AX 的结合）。特别是，我们分析了基因座动态变化在发育中 B 细胞免疫球蛋白基因座 V(D)J 重组调控中的作用17-30，以及在 CD4+ 与 CD8+ T 细胞谱系命运决定中的调控作用14。我们还评估了携带重组酶蛋白 RAG2 突变体的发育中 T 细胞内 T 细胞受体基因座之一 Tcra/d 上的 DNA 损伤情况31。
<p class="jove_content" ...

本文介绍了一种同时检测组蛋白修饰和DNA序列的实验方案，该方法结合免疫荧光、DNA荧光原位杂交（DNA FISH），并进行三维显微成像与分析（3D 免疫-DNA FISH）。

结合免疫荧光与DNA FISH技术对三维保存的间期细胞核进行分析以研究三维核结构的变化

使用DNA探针在三维保存的细胞核上进行荧光原位杂交，随后进行三维共聚焦显微镜观察（3D DNA FISH）代表了……

本实验的总体目标是利用三维共聚焦显微镜同时检测染色质修饰和DNA序列。首先制备特异性的DNA探针，同时对实验细胞进行固定、通透和免疫染色，以标记目标组蛋白标记物。随后对细胞进行变性处理，并在细胞内进行过夜荧光杂交。使用一种或多种DNA探针进行荧光原位杂交（FISH）。最后，对细胞进行洗涤并封片，用于三维荧光观察。对所得图像的显微镜分析揭示了目的位点的核定位及其与特定组蛋白修饰的关联。该技术的主要优势在于，它能够结合可视化核内蛋白质（包括组蛋白）与基因组位点在三维保留细胞核中的空间关系，有助于解答染色质表观遗传核结构或基因调控领域中的关键科学问题。在本实验流程中，可使用质粒或PCR产物进行标记。应按照随附文本所述方法进行制备。需要注意的是，为了获得强健的鱼类信号，探针长度应至少为10千碱基对。开始此操作时，先将1微克DNA与0.17微克RNAs A加入一个微量离心管中混合。在37摄氏度下孵育30分钟。孵育结束后，立即将RNAs A置于冰上短暂失活，并加入适量的缺口平移（Nick translation）试剂。混合后，在4摄氏度的冷藏水浴或冷块中于16摄氏度孵育两小时，以终止反应。将试管置于负80摄氏度下1小时，或置于负20摄氏度下过夜。接着，在2%琼脂糖凝胶上测定探针大小。电泳条带应介于101,000个碱基对之间，主要条带集中在约300至500个碱基对。请注意，科幻探针的涂抹痕迹不可见。确定大小后，通过在装有水的两升烧杯中使用 0.02 微米过滤器进行透析来纯化探针。用移液器将200微克探针轻轻加到每张漂浮滤膜的中心，然后在避光条件下孵育两小时。孵育结束后，用移液器将探针从滤膜上轻轻转移至新的微量离心管中。接下来，按如下方法向探针中加入封闭因子。1微克CO 1D NA。每1微克DNA探针使用1微克高阻断DNA和10微克鲑鱼精子DNA，混合后将DNA探针保存于-20摄氏度。在进行杂交实验当天，将探针沉淀并准备使用。请注意，本视频此部分所述步骤应与下一节中的步骤并行操作。为沉淀探针，请按以下步骤操作：加入探针体积0.1倍的pH 5.2的三摩尔醋酸钠溶液和2.5倍体积的100%乙醇，于负80摄氏度孵育一小时。孵育结束后，在4摄氏度下以16,000 × g离心30分钟，使探针沉淀。离心后，弃去上清液，并在避光条件下将沉淀晾干。根据探针的用量和颜色，沉淀可能可见也可能不可见。每种测试条件使用15 µL杂交缓冲液重悬沉淀，并在37至45°C避光条件下，使用einor thermo mixer振荡约20分钟。接下来，为使探针变性，将其在75至95°C孵育5分钟。然后对预杂交探针在37摄氏度的恒温混匀仪中孵育30至60分钟。孵育结束后，立即按照视频下一节所述方法将探针加至载玻片上的细胞样本。请注意，在后续步骤中，应根据所使用的抗体和细胞类型，对孵育时间进行相应调整。视频中本节所述步骤应与 accompanying text 中描述的上一节步骤同时进行。将未贴壁的细胞滴加到六孔板孔内经多聚赖氨酸包被的盖玻片上，静置五分钟使其贴壁。随后，轻轻加入两毫升含2%多聚甲醛的PBS溶液，在室温下孵育10分钟。孵育结束后，用 PBS 每孔冲洗 3 次，然后加入 2 毫升预冷的含 0.4% Triton X-100 的 PBS，冰上孵育 5 分钟以通透细胞。吸除通透液后，若需将 DNA FISH 与免疫荧光结合，按以下步骤操作：首先，在湿盒中向盖玻片上滴加 100 微升封闭液。将盖玻片细胞面朝下置于封闭液中，室温孵育30分钟。随后，将盖玻片转移至含有用封闭液稀释的一抗溶液的100 µL液滴中。此处所用抗体可识别叙利亚仓鼠 H2A X 的第 39 位丝氨酸磷酸化产物，即 γH2A X。将切片置于湿盒中，室温孵育 1 小时。孵育结束后，用镊子小心移除盖玻片。如果盖玻片难以拾取，可用 PBS 浸润后再次尝试。将每张载玻片转移至六孔板中的一个孔内，孔中预先加入含有 0.2% BSA 和 0.1% Tween 20 的 PBS 溶液 2 毫升，室温下振荡洗涤盖玻片三次，每次五分钟。随后在避光、湿润的孵育盒中，用封闭液稀释的相应荧光标记二抗室温孵育细胞一小时。同前，孵育后，在室温避光条件下，用含 0.1% Tween 20 的 PBS 洗涤细胞三次，每次五分钟，以对细胞进行后固定；将细胞浸入 2 毫升含 2% 甲醛的 PBS 溶液中，室温避光孵育 10 分钟。待细胞染色完成后，或若细胞未染色，则继续进行 DNA FISH 实验：将盖玻片用 PBS 洗涤三次，随后将盖玻片细胞面朝下置于 100 微升、浓度为 0.1 毫克/毫升的液滴上。将载玻片置于湿化孵育盒中，在37摄氏度下孵育一小时。孵育结束后，用PBS冲洗盖玻片三次，然后在冰上避光条件下，用含0.7% Triton X-100的0.1摩尔盐酸溶液对细胞进行透化处理10分钟。PBS冲洗三次后，在室温避光条件下用1.9摩尔盐酸溶液变性细胞30分钟，再用冰预冷的PBS洗涤三次，随后进行细胞与探针的杂交。将盖玻片细胞面朝下放置在载玻片上预先制备的15 µL探针液滴中（探针制备见本视频前一章节），用橡胶胶水密封载玻片，于37°C避光湿盒中孵育过夜。次日，用镊子小心去除载玻片上的橡胶胶水，随后用2× SSC缓冲液冲洗盖玻片，并用镊子小心取下带有细胞的盖玻片。然后将它们放入含有洗涤液的孔中。接下来，在避光条件下振荡洗涤：在37摄氏度下用2×SSC溶液洗涤30分钟，随后在室温下用2×SSC溶液洗涤30分钟，再用1×SSC溶液在室温下洗涤30分钟。为封片，将盖玻片细胞面朝下覆盖在含有1.5毫克/毫升DPI并添加封片剂的10至15微升滴液上，用指甲油密封。载玻片可在负20摄氏度下保存数月。载玻片制备完成后，采集光学切片间距为 0.3 微米的三维图像，并按照随附文档所述方法进行分析，以确定抗原受体基因座两个等位基因之间的关联变化是否与淋巴细胞发育过程中 VDJ 重组的调控相关。实验中使用了野生型细胞以及缺乏重组酶蛋白 RAG1 的突变型细胞，通过 DNA FISH 探针检测目标基因座，该探针来源于一个跨度约为 200 千碱基对、覆盖基因组区域的片段。等位基因之间的距离通过三维图像堆栈中每个 BAC 信号的质量中心进行测量（虚线圆圈标示），并勾勒出细胞核的轮廓。图中所示比例尺为 1 微米，随后生成累积频率分布曲线，以展示在野生型和突变型细胞中测得的两个等位基因间距离的完整范围。随后采用非参数双样本KS检验来评估两个分布之间差异的显著性。通过一系列由蓝色圆点表示的双尾Fisher精确检验，评估了等位基因间距离差异最稳健的范围。最高的圆点所指示的最稳健P值出现在约一微米的距离处。因此，两个等位基因紧密关联或配对的截断值设定为1微米。此处展示的累积频率曲线表明，在两种不同的生物学条件下，两个等位基因紧密关联的距离范围为0至1.5微米。采用双尾Fisher精确检验在1微米截断值下评估两个等位基因配对的显著性。该图显示，在突变条件下，两个等位基因不像野生型那样高频关联。因此，缺失的蛋白 Rag1 参与了同源配对。观看本视频后，您应能充分理解如何结合免疫荧光与 DNA FISH 技术。该技术为研究人员揭示了核结构的全局性变化、特定基因组位点及区域在核空间内的行为，以及特定核蛋白在这些区域内的分布情况，从而奠定了研究基础。此外，通过该方法有助于理解不同疾病发生发展的相关机制。其他方法，如全基因组高通量技术，包括染色质免疫沉淀（ChIP）或结合深度测序的染色体构象捕获技术（如 5C 或 Hi-C），也可用于获取细胞群体的全局性数据。

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生物学

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学习结合免疫荧光与DNA FISH技术，利用三维共聚焦显微镜同时检测组蛋白修饰和DNA序列，研究染色质动态变化与核内基因组位点的空间组织关系。

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