结合免疫荧光与DNA FISH技术对三维保存的间期细胞核进行分析以研究三维核结构的变化

本实验的总体目标是利用三维共聚焦显微镜同时检测染色质修饰和DNA序列。首先制备特异性的DNA探针，同时对实验细胞进行固定、通透和免疫染色，以标记目标组蛋白标记物。

随后对细胞进行变性处理，并在细胞内进行过夜荧光杂交。使用一种或多种DNA探针进行荧光原位杂交（FISH）。最后，对细胞进行洗涤并封片，用于三维荧光观察。

对所得图像的显微镜分析揭示了目的位点的核定位及其与特定组蛋白修饰的关联。该技术的主要优势在于，它能够结合可视化核内蛋白质（包括组蛋白）与基因组位点在三维保留细胞核中的空间关系，有助于解答染色质表观遗传核结构或基因调控领域中的关键科学问题。在本实验流程中，可使用质粒或PCR产物进行标记。

应按照随附文本所述方法进行制备。需要注意的是，为了获得强健的鱼类信号，探针长度应至少为10千碱基对。开始此操作时，先将1微克DNA与0.17微克RNAs A加入一个微量离心管中混合。

在37摄氏度下孵育30分钟。孵育结束后，立即将RNAs A置于冰上短暂失活，并加入适量的缺口平移（Nick translation）试剂。混合后，在4摄氏度的冷藏水浴或冷块中于16摄氏度孵育两小时，以终止反应。

将试管置于负80摄氏度下1小时，或置于负20摄氏度下过夜。接着，在2%琼脂糖凝胶上测定探针大小。电泳条带应介于101,000个碱基对之间，主要条带集中在约300至500个碱基对。

请注意，科幻探针的涂抹痕迹不可见。确定大小后，通过在装有水的两升烧杯中使用 0.02 微米过滤器进行透析来纯化探针。

用移液器将200微克探针轻轻加到每张漂浮滤膜的中心，然后在避光条件下孵育两小时。孵育结束后，用移液器将探针从滤膜上轻轻转移至新的微量离心管中。接下来，按如下方法向探针中加入封闭因子。

1微克CO 1D NA。每1微克DNA探针使用1微克高阻断DNA和10微克鲑鱼精子DNA，混合后将DNA探针保存于-20摄氏度。在进行杂交实验当天，将探针沉淀并准备使用。请注意，本视频此部分所述步骤应与下一节中的步骤并行操作。

为沉淀探针，请按以下步骤操作：加入探针体积0.1倍的pH 5.2的三摩尔醋酸钠溶液和2.5倍体积的100%乙醇，于负80摄氏度孵育一小时。孵育结束后，在4摄氏度下以16,000 × g离心30分钟，使探针沉淀。离心后，弃去上清液，并在避光条件下将沉淀晾干。

根据探针的用量和颜色，沉淀可能可见也可能不可见。每种测试条件使用15 µL杂交缓冲液重悬沉淀，并在37至45°C避光条件下，使用einor thermo mixer振荡约20分钟。接下来，为使探针变性，将其在75至95°C孵育5分钟。

然后对预杂交探针在37摄氏度的恒温混匀仪中孵育30至60分钟。孵育结束后，立即按照视频下一节所述方法将探针加至载玻片上的细胞样本。请注意，在后续步骤中，应根据所使用的抗体和细胞类型，对孵育时间进行相应调整。

视频中本节所述步骤应与 accompanying text 中描述的上一节步骤同时进行。将未贴壁的细胞滴加到六孔板孔内经多聚赖氨酸包被的盖玻片上，静置五分钟使其贴壁。随后，轻轻加入两毫升含2%多聚甲醛的PBS溶液，在室温下孵育10分钟。孵育结束后，

用 PBS 每孔冲洗 3 次，然后加入 2 毫升预冷的含 0.4% Triton X-100 的 PBS，冰上孵育 5 分钟以通透细胞。吸除通透液后，若需将 DNA FISH 与免疫荧光结合，按以下步骤操作：首先，在湿盒中向盖玻片上滴加 100 微升封闭液。

将盖玻片细胞面朝下置于封闭液中，室温孵育30分钟。随后，将盖玻片转移至含有用封闭液稀释的一抗溶液的100 µL液滴中。

此处所用抗体可识别叙利亚仓鼠 H2A X 的第 39 位丝氨酸磷酸化产物，即 γH2A X。将切片置于湿盒中，室温孵育 1 小时。孵育结束后，用镊子小心移除盖玻片。

如果盖玻片难以拾取，可用 PBS 浸润后再次尝试。将每张载玻片转移至六孔板中的一个孔内，孔中预先加入含有 0.2% BSA 和 0.1% Tween 20 的 PBS 溶液 2 毫升，室温下振荡洗涤盖玻片三次，每次五分钟。随后在避光、湿润的孵育盒中，用封闭液稀释的相应荧光标记二抗室温孵育细胞一小时。

同前，孵育后，在室温避光条件下，用含 0.1% Tween 20 的 PBS 洗涤细胞三次，每次五分钟，以对细胞进行后固定；将细胞浸入 2 毫升含 2% 甲醛的 PBS 溶液中，室温避光孵育 10 分钟。待细胞染色完成后，或若细胞未染色，则继续进行 DNA FISH 实验：将盖玻片用 PBS 洗涤三次，随后将盖玻片细胞面朝下置于 100 微升、浓度为 0.1 毫克/毫升的液滴上。

将载玻片置于湿化孵育盒中，在37摄氏度下孵育一小时。孵育结束后，用PBS冲洗盖玻片三次，然后在冰上避光条件下，用含0.7% Triton X-100的0.1摩尔盐酸溶液对细胞进行透化处理10分钟。PBS冲洗三次后，在室温避光条件下用1.9摩尔盐酸溶液变性细胞30分钟，再用冰预冷的PBS洗涤三次，随后进行细胞与探针的杂交。

将盖玻片细胞面朝下放置在载玻片上预先制备的15 µL探针液滴中（探针制备见本视频前一章节），用橡胶胶水密封载玻片，于37°C避光湿盒中孵育过夜。次日，用镊子小心去除载玻片上的橡胶胶水，随后用2× SSC缓冲液冲洗盖玻片，并用镊子小心取下带有细胞的盖玻片。

然后将它们放入含有洗涤液的孔中。接下来，在避光条件下振荡洗涤：在37摄氏度下用2×SSC溶液洗涤30分钟，随后在室温下用2×SSC溶液洗涤30分钟，再用1×SSC溶液在室温下洗涤30分钟。为封片，将盖玻片细胞面朝下覆盖在含有1.5毫克/毫升DPI并添加封片剂的10至15微升滴液上，用指甲油密封。载玻片可在负20摄氏度下保存数月。

载玻片制备完成后，采集光学切片间距为 0.3 微米的三维图像，并按照随附文档所述方法进行分析，以确定抗原受体基因座两个等位基因之间的关联变化是否与淋巴细胞发育过程中 VDJ 重组的调控相关。实验中使用了野生型细胞以及缺乏重组酶蛋白 RAG1 的突变型细胞，通过 DNA FISH 探针检测目标基因座，该探针来源于一个跨度约为 200 千碱基对、覆盖基因组区域的片段。等位基因之间的距离通过三维图像堆栈中每个 BAC 信号的质量中心进行测量（虚线圆圈标示），并勾勒出细胞核的轮廓。图中所示比例尺为 1 微米，随后生成累积频率分布曲线，以展示在野生型和突变型细胞中测得的两个等位基因间距离的完整范围。

随后采用非参数双样本KS检验来评估两个分布之间差异的显著性。通过一系列由蓝色圆点表示的双尾Fisher精确检验，评估了等位基因间距离差异最稳健的范围。最高的圆点所指示的最稳健P值出现在约一微米的距离处。

因此，两个等位基因紧密关联或配对的截断值设定为1微米。此处展示的累积频率曲线表明，在两种不同的生物学条件下，两个等位基因紧密关联的距离范围为0至1.5微米。采用双尾Fisher精确检验在1微米截断值下评估两个等位基因配对的显著性。

该图显示，在突变条件下，两个等位基因不像野生型那样高频关联。因此，缺失的蛋白 Rag1 参与了同源配对。观看本视频后，您应能充分理解如何结合免疫荧光与 DNA FISH 技术。

该技术为研究人员揭示了核结构的全局性变化、特定基因组位点及区域在核空间内的行为，以及特定核蛋白在这些区域内的分布情况，从而奠定了研究基础。此外，通过该方法有助于理解不同疾病发生发展的相关机制。其他方法，如全基因组高通量技术，包括染色质免疫沉淀（ChIP）或结合深度测序的染色体构象捕获技术（如 5C 或 Hi-C），也可用于获取细胞群体的全局性数据。