Name: 实时成像在乳腺癌小鼠模型中的肿瘤微环境对药物的反应 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 了解利用转盘共聚焦显微镜实时成像小鼠乳腺肿瘤的方法，以追踪药物渗透和治疗反应。该技术可在单细胞分辨率下分析细胞死亡及肿瘤微环境变化，为癌症治疗策略提供重要依据。

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感谢 J. Cappellani 和 J. Qiu 提供的技术支持。本研究由美国国家癌症研究所（U01 CA141451）、Starr 癌症联合会、Susan G. Komen for the Cure、长岛抗击乳腺癌两日步行活动、Manhasset 妇女抗癌联盟资助给 M.E. 的经费，以及美国国会指定乳腺癌研究计划向 E.S.N. 提供的博士前奖学金资助。E.S.N. 还获得了冷泉港实验室沃森生物科学学院的 Leslie C. Quick 和 William Randolph Hearst 基金会奖学金。H.A.A. 的研究得到了挪威研究理事会（160698/V40 和 151882）以及挪威东南部地区卫生当局（2007060）的资助。

<ol><li>Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumors+as+organs%3A+complex+tissues+that+interface+with+the+entire+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism.</a> Dev. Cell. 18, 884-901 (2010).</li>
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<li>Tlsty, T. D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+stroma+and+regulation+of+cancer+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Tumor stroma and regulation of cancer development.</a> Annu. Rev. Pathol. 1, 119-150 (2006).</li>
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<li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21, 488-503 (2012).</li>
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<li>Boissonnas, A., Fetler, L., Zeelenberg, I. S., Hugues, S., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+cytotoxic+T+cell+infiltration+and+elimination+of+a+solid+tumor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of cytotoxic T cell infiltration and elimination of a solid tumor.</a> J. Exp. Med. 204, 345-356 (2007).</li>
<li>Breart, B., Lemaître, F., Celli, S., Bousso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+intratumoral+CD8%2B+T+cell+cytotoxic+activity+during+adoptive+T+cell+therapy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of intratumoral CD8+ T cell cytotoxic activity during adoptive T cell therapy in mice.</a> J. Clin. Invest. 118, 1390-1397 (2008).</li>
<li>Engelhardt, J. J., Boldajipour, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marginating+dendritic+cells+of+the+tumor+microenvironment+cross-present+tumor+antigens+and+stably+engage+tumor-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells.</a> Cancer Cell. 21, 402-417 (2012).</li>
<li>Brown, E., McKee, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+collagen+and+its+modulation+in+tumors+in+vivo+using+second-harmonic+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation.</a> Nat. Med. 9, 796-800 (2003).</li>
<li>Wyckoff, J. B., Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+macrophage-assisted+tumor+cell+intravasation+in+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors.</a> Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).</li>
<li>Yuan, F., Salehi, H. A., Boucher, Y., Vasthare, U. S., Tuma, R. F., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+permeability+and+microcirculation+of+gliomas+and+mammary+carcinomas+transplanted+in+rat+and+mouse+cranial+windows%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Vascular permeability and microcirculation of gliomas and mammary carcinomas transplanted in rat and mouse cranial windows.</a> Cancer Res. 54, 4564-4568 (1994).</li>
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<li>Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+stromal+cell+dynamics+in+different+tumor+microenvironments+by+spinning+disk+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy.</a> Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).</li>
<li>Cheng, N., Lambert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+Transplantation+of+Stromal+Cells+and+Carcinoma+Cells+in+C57BL%2F6J%5BTitle%5D)+AND+%22Mice.+J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J.</a> Mice. J. Vis. Exp. (54), ee2716(2011).</li>
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<li>Sounni, N. E., Dehne, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stromal+regulation+of+vessel+stability+by+MMP14+and+TGFbeta%5BTitle%5D)+AND+%22Dis.+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Stromal regulation of vessel stability by MMP14 and TGFbeta.</a> Dis. Model Mech. 3, 317-332 (2010).</li>
<li>Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+reporter+gene+transgenic+mouse+demonstrates+heterogeneity+in+hepatic+fibrogenic+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations.</a> Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).</li>
<li>Motoike, T., Loughna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+GFP+reporter+for+the+study+of+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Universal GFP reporter for the study of vascular development.</a> Genesis. 28, 75-81 (2000).</li>
<li>Fukumura, D., Xavier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+induction+of+VEGF+promoter+activity+in+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor induction of VEGF promoter activity in stromal cells.</a> Cell. 94, 715-725 (1998).</li>
<li>Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+fibroblast+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).</li>
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</ol>

作者声明无利益冲突。所有动物实验均依照 IACUC 批准的方案进行。

肿瘤对全身治疗的 体内 反应可能与癌细胞的 体外 反应显著不同，因为微环境会影响急性反应和复发过程5。阐明 体内 化疗耐药通路的最大障碍之一，是癌细胞与其微环境之间相互作用的复杂性。特别是，由于实体瘤已形成癌细胞与间质细胞之间的平衡，任一组分的扰动（例如抗癌治疗过程中发生的细胞死亡）都可能对组织结构产生显著影响。
本文提供的活体成像技术可实现对活体麻醉小鼠在抗肿瘤药物治疗过程中肿瘤内癌细胞与间质相互作用的直接可视化观察。我们采用转盘共聚焦显微镜，该技术穿透深度相对有限（见17），但本研究所述的手术与标记技术可与其他类型的显微镜联用。通过这些实验获取的动态影像可用于追踪多种生物学过程，包括荧光强度的变化（例如，因标记细胞群体的浸润或细胞死亡的诱导所致）、细胞运动性、注射物质的分布（例如，用于追踪血管渗漏）以及荧光信号的共定位5,12,17,20。
我们 routinely 对小鼠进行超过6小时的成像，也曾进行超过18小时的成像。这需要在如此长的时间内持续维持小鼠处于麻醉状态。在适当的麻醉条件下，超过90%的动物可存活6小时，约80%可存活超过18小时。有关如何实施长期麻醉的详细方法此前已有发表19。根据我们的经验，有五个因素至关重要：避免低体温、避免脱水、维持生理性的血液氧饱和度、使用加湿的异氟烷载气，以及将动物维持在不表现出疼痛体征的最低麻醉水平。为维持体温，我们将小鼠置于加热毯（38 °C）上。为防止脱水，我们在整个成像过程中定期通过腹腔注射（i.p.）给予少量生理盐水。为维持生理性的血液氧饱和度，我们以载气中21%的氧气浓度开始（而非常用的100%）。这使得我们在实验进行数小时后，若发现小鼠血氧饱和度下降，可及时提高吸入氧浓度。根据我们的经验，此时提高吸入氧浓度（例如至30–40%）几乎总能稳定动物状态，从而实现额外数小时的成像。对于大多数小鼠，最佳麻醉水平可通过1–1.5%异氟烷实现，对应呼吸频率为60–65次/分钟，脉搏频率为400–450次/分钟。在我们的成像实验中，主要使用转基因小鼠模型（MMTV-PyMT 和 C3[1]-Tag），这些模型中的肿瘤呈多灶性，可在单次成像过程中于多个 x、y 位置平行观察处于肿瘤进展不同阶段的多个病灶。这降低了在旨在识别阶段依赖性治疗反应的实验中因个体小鼠间差异带来的影响，同时减少了成像所需的动物数量。
MMTV-PyMT 模型（以及其他自发性癌症模型）会经历可识别的渐进性组织病理学阶段，这些阶段可在活体成像过程中被观察到，尽管活体成像期间对肿瘤病变进行的病理分期与组织学切片相比存在差异，且详细程度较低5,17。相比之下，移植模型通常最能反映晚期肿瘤，因为癌细胞通常来源于进展期肿瘤。因此，这类模型更适合研究晚期肿瘤中的肿瘤-间质相互作用，而非不同阶段之间这些相互作用的差异。
我们展示了如何对治疗诱导的细胞死亡后发生的细胞核结构变化进行成像的示例。在未进行抗癌治疗的情况下，该标记策略可用于对细胞分裂进行成像。 原位， 例如，阐明细胞增殖与休眠如何受到微环境的影响。未来，对线粒体组分进行荧光标记可能使成像细胞凋亡过程中发生的线粒体变化成为可能。
在本方案中，我们还展示了如何对治疗后癌细胞与免疫细胞相互作用进行成像的示例，但其他微环境组分也可被可视化并成像。目前已有的用于基质组分的转基因报告基因品系包括成纤维细胞（例如，FSP1-EGFP17，αSMA-RFP21，COL1A1-EGFP21）或血管系统细胞（例如，Tie2-GFP22；VEGF-GFP23）。
活体成像可实现对发生于体内的相互作用与过程进行实时可视化观察 体内 化疗给药后。利用目前可用的技术，我们已在理解髓系细胞如何影响治疗反应方面取得了重大进展；然而，由于肿瘤微环境极为复杂，仍需进一步的重大突破，才能从机制上深入探究环境介导的耐药过程。其中最迫切需要的重要进展之一，是鉴定出更特异的特定细胞群体标志物。这一点在乳腺肿瘤微环境中两种最主要的间质细胞成分——成纤维细胞和免疫细胞——中表现得尤为突出。α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）常被用于鉴定成纤维细胞，但该蛋白也在血管平滑肌细胞和肌上皮细胞中表达。24因此，尽管存在αSMA-GFP报告小鼠，但在活体成像实验中确定所追踪的具体细胞类型仍具有挑战性。同样，在c-fms启动子驱动下表达的单一荧光标记物（如EGFP）通常会标记出多种免疫细胞亚群。12,17因此，尽管理想情况下希望使用单一标记物来鉴定特定细胞类型，但基础生物学的复杂性为采用这种方法带来了重大挑战。
解决这一问题的一种部分方案是使用可注射标记物，以进一步区分表达相同荧光报告基因的不同细胞亚群。例如，荧光葡聚糖可被巨噬细胞摄取，可用于标记由 c-fms-EGFP 和 Fsp1-EGFP 转基因报告小鼠所标记的巨噬细胞亚群17与荧光探针偶联的抗体也已被用于鉴定特定亚群（例如 由c-fms-EGFP报告基因标记的Gr1阳性髓系细胞群体17).
与通过游标卡尺测量生成的肿瘤反应曲线相比，后者无法提供关于肿瘤为何及如何对治疗产生反应的机制性信息，或依赖于在不同时间点采集组织获得的组织学系列，而后者需要大量动物实验群体；我们的技术则能够在小规模动物群体中直接提供细胞死亡动态以及基质细胞与癌细胞相互作用的可量化信息。因此，采用本报告所述方法的优势在于，它能在完整肿瘤微环境的背景下实时提供药物反应的动态信息。此类信息有助于深入理解驱动治疗反应的潜在生物学过程5。

实体瘤主要由两个部分组成：癌细胞以及有助于维持肿瘤生长适宜环境的间质成分（包括细胞和非细胞成分）1。这些间质成分在多种癌症（包括乳腺癌2-5）的发生、发展和转移过程中发挥着关键作用。间质微环境还会影响肿瘤对治疗的反应2,4,5。因此，明确癌细胞在完整微环境背景下对传统和新型疗法的反应，对于深入理解癌症生物学机制并改进现有治疗策略具有重要意义。此外，阐明治疗实施后癌细胞与间质相互作用的变化，对于理解肿瘤复发的生物学机制至关重要。
器官型共培养系统在研究肿瘤-间质相互作用方面具有重要作用6但显而易见的是，目前可用的方法尚无法成功重建完整的肿瘤微环境 体外 特别是关于血管功能以及免疫细胞的募集。事实上，所观察到的癌细胞对治疗的反应 体外 与所观察到的常常有显著差异 体内，其中微环境保持完整5因此， 体内 用于研究肿瘤-间质相互作用及其对治疗反应影响的模型可能更准确地反映临床相关机制7.
研究体内抗癌治疗反应的主要方法一直是通过测量肿瘤大小以及对来自治疗后动物或患者的组织进行组织学评估。in vivo 然而，过去二十年中显微镜技术和荧光报告系统的进步使得能够在活体、麻醉动物中以高分辨率可视化观察细胞间和细胞内的过程（活体成像）8。这些活体显微成像技术已被证明特别适用于在细胞和亚细胞分辨率下，从空间和时间维度解析肿瘤-基质相互作用的in vivo动态过程8,9。
通过活体成像技术揭示的生物学过程包括抗肿瘤T细胞的细胞毒性10,11、T细胞与髓系细胞之间的相互作用12、治疗后胶原成分与结构变化的动力学特征13、巨噬细胞依赖性的肿瘤细胞内渗及转移过程14，以及血管通透性15。
活体成像有三个主要要求：包括对组织进行适当的制备和暴露以供成像，对目标组织成分进行荧光标记，以及配备能够采集图像的显微镜-相机系统。16解决这些需求的最常用策略包括：1）异位制备（例如，耳部或眼眶接种），永久性成像窗口，或外置化制备例如，背侧皮肤瓣）；2）转基因荧光报告基因及荧光注射标记物用于标记组织组分；3）分别配备光电倍增管或电荷耦合器件（CCD）相机的多光子或共聚焦显微镜系统9我们采用外科手术制备的皮肤瓣模型，暴露表达荧光报告基因的麻醉动物腹股沟乳腺组织，用于成像。通过增强型CCD（ICCD）相机与四激光转盘共聚焦显微镜系统联用，持续采集12至40小时的图像。17以这种方式成像使我们能够研究诸如 体内 药物分布、阶段依赖性化疗反应、化疗诱导的细胞死亡类型以及髓系细胞行为5.
我们提供了一种在乳腺癌小鼠模型中进行活体成像的实验方案，用于观察癌细胞对抗癌治疗的反应以及肿瘤与间质之间的相互作用。该方案可用于在单次成像过程中长达40小时的时间内，利用多种转基因和可注射的荧光标记物，对转基因模型和移植模型中的癌细胞及间质成分的行为和死亡过程进行动态追踪。

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;试剂&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>MMTV-PyMT 小鼠</td><td>Jackson Laboratory</td><td>2374</td><td></td></tr><tr><td>C3(1)-Tag 小鼠</td><td>Jackson Laboratory</td><td>13591</td><td></td></tr><tr><td>ACTB-ECFP 小鼠</td><td>Jackson Laboratory</td><td>3773</td><td></td></tr><tr><td>ACTB-H2B-EGFP 小鼠</td><td>Jackson Laboratory</td><td>5418</td><td></td></tr><tr><td>1 × PBS</td><td>实验室自制</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 MD 葡聚糖，荧光素标记</td><td>Invitrogen</td><td>D-7137</td><td>用 dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 重悬至 4 mg/mL（-20 &amp;deg;C 保存）；使用前用 1 × PBS 稀释至 1 mg/mL</td></tr><tr><td>10 kD 葡聚糖，Alexa Fluor 647 标记</td><td>Invitrogen</td><td>D-22914</td><td>用 dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 重悬至 4 mg/mL（-20 &amp;deg;C 保存）；使用前用 1 × PBS 稀释至 1 mg/mL</td></tr><tr><td>盐酸多柔比星</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44583</td><td>用 dH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 溶解并 4 &amp;deg;C 保存；使用前用 1 × PBS 稀释</td></tr><tr><td>异氟烷（Isothesia）</td><td>Butler Animal Health Supply</td><td>029450</td><td>250 ml</td></tr><tr><td>碘化丙啶</td><td>Invitrogen</td><td>P3566</td><td>1 mg/mL；用 1 × PBS 稀释 1:15</td></tr><tr><td>氮气</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氧气</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>18G × 1&amp;frac12;&quot; 标准斜面针头</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>&amp;mu;Manager</td><td>Vale Lab, UCSF</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.micro-manager.org&quot; target=&quot;_blank">www.micro-manager.org&lt;/a&gt;</td><td>开源软件</td></tr><tr><td>酒精棉片</td><td>BD</td><td>326895</td><td>70% 异丙醇棉片</td></tr><tr><td>麻醉系统</td><td>Molecular Imaging Products, Co.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>Corning</td><td>2940-245</td><td>No. 1&amp;#189;，24×50 mm；使用 70% 异丙醇擦拭消毒</td></tr><tr><td>Curity 纱布海绵（无菌）</td><td>Kendall</td><td>6939</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>Corning</td><td>2948-75x25</td><td>预清洁；若未预清洁，使用 70% 异丙醇擦拭消毒</td></tr><tr><td>硬化精细剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-11</td><td>2 把；不锈钢，尖-尖头，直头，26 mm 刃长，11 cm 总长</td></tr><tr><td>加热毯</td><td>Gaymar Industries</td><td></td><td></td></tr><tr><td>热珠灭菌器</td><td>Fine Science Tools</td><td>18000-45</td><td>使用前约 30 分钟开启；在 &amp;gt;200 &amp;deg;C 下灭菌 30 秒</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.bitplane.com&quot; target=&quot;_blank">www.bitplane.com&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Krazy Glue</td><td>Elmer&amp;#8217;s Products</td><td>KG484</td><td></td></tr><tr><td>实验室胶带（&amp;frac12;&quot;）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>实验室胶带（1&quot;）</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>泡沫聚苯乙烯运输箱的盖子</td><td></td><td></td><td>将用作手术平台</td></tr><tr><td>显微解剖镊</td><td>Roboz</td><td>RS-5153</td><td>1×2 齿，轻微弯曲，0.8 mm 尖端宽度，4&quot; 长</td></tr><tr><td>显微解剖镊</td><td>Roboz</td><td>RS-5135</td><td>带齿，轻微弯曲，0.8 mm 尖端宽度，4&quot; 长</td></tr><tr><td>显微镜</td><td></td><td></td><td>转盘共聚焦显微镜，XYZ 压电载物台，具备落射荧光功能&lt;sup&gt;17,25&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>显微镜载物台插件</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td></td><td>定制加工，带两个圆形成像窗口</td></tr><tr><td>MouseOx 血氧仪、软件及传感器</td><td>STARR Life Sciences</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.starrlifesciences.com&quot; target=&quot;_blank">www.starrlifesciences.com&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Super Versi-Dry 实验室吸水垫</td><td>Thermo Scientific</td><td>74218-00</td><td>切成四等份，用于铺垫手术平台</td></tr><tr><td>雾化器</td><td>Salter Labs</td><td>8901</td><td>用于加湿气体；防止肺组织刺激</td></tr><tr><td>滑动式一次性结核菌素注射器（1 ml）</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>带翼输液套件（Surflo）</td><td>Terumo</td><td>SV-23BLK</td><td>23G × &amp;#190;&quot; 超细针头，12&quot; 管路</td></tr><tr><td>聚维酮碘喷雾剂</td><td>Purdue Pharma</td><td>BASP3H</td><td></td></tr></tbody></table>

小鼠乳腺癌模型中肿瘤微环境对药物反应的活体成像

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

肿瘤微环境在肿瘤的发生、发展、转移以及对抗癌治疗的反应中起着关键作用。三维共培养系统常用于阐明肿瘤与间质之间的相互作用，包括它们在药物反应中的角色。然而，在完整微环境中的许多 体内 相互作用无法在这些 体外 系统中完全重现。因此，实时直接观察这些过程已成为理解肿瘤对治疗反应及识别可能影响这些反应的癌细胞与间质相互作用的重要工具。本文提供了一种利用旋转盘共聚焦显微镜对活体麻醉小鼠进行成像的方法，以直接观察在乳腺癌模型中给予全身治疗后药物的分布、癌细胞的反应以及肿瘤-间质相互作用的变化。我们描述了标记不同肿瘤组分、处理动物以观察治疗反应，以及暴露肿瘤组织进行长达40小时成像的手术操作步骤。通过本方案获得的结果为延时电影图像，其中药物渗透、癌细胞死亡和间质细胞迁移等过程可通过图像分析软件进行评估。

我们描述了一种用于成像抗肿瘤治疗反应的方法 体内 并在单细胞分辨率下。

肿瘤微环境在肿瘤的发生、发展、转移以及对抗癌治疗的反应中发挥着关键作用。三维……

本实验的总体目标是实时追踪药物渗透情况以及对治疗性药物给药后的治疗反应。首先对动物给予药物处理，随后通过制作皮瓣暴露含有肿瘤的腹股沟乳腺组织，从而实现上述目标。然后将小鼠转移至显微镜载物台上，测量血氧饱和度和脉搏率，并插入留置导管用于液体、药物或染料的给药。最后，采集延时图像以供后续分析。最终，可通过活体小鼠乳腺肿瘤的旋转盘共聚焦显微镜观察，获得药物处理下细胞死亡或肿瘤间质相互作用变化的结果。该方法有助于解答肿瘤微环境领域中的关键问题，例如肿瘤中各种间质成分如何影响治疗反应。开始实验前，请参阅书面实验方案中关于药物给药和成像的典型时间安排。打开玻璃珠灭菌器，并使其升温至至少 200 摄氏度。将手术器械（包括有齿镊、锯齿状镊子和两把剪刀）用肥皂和水清洗后，使用热珠灭菌器对它们进行灭菌，至少持续30秒。然后让其冷却。将实验室浸泡垫放置在将用作手术平台的泡沫塑料盖顶部。使用实验室胶带将带有刻线的麻醉系统鼻罩固定在实验浸泡装置上，并将两根18号规格、一又二分之一英寸长的针头通过胶带插入鼻罩两侧的泡沫盖中，以确保鼻罩牢固固定。另备碘伏无菌纱布、两张70%异丙醇擦拭巾、一张载玻片、万能胶以及四段半英寸宽的实验室胶带。将动物在诱导室中麻醉后，当其呼吸变得深而缓慢时，将小鼠转移至手术平台，腹侧朝上。为避免压力过高，先打开通向手术平台的麻醉气体管路，然后关闭通向诱导室的麻醉气体管路。将异氟烷浓度从4%降低至2.5%。通过足垫夹捏测试确认麻醉深度是否达到手术要求。如果动物无反应，使用四块实验室胶带将其四肢固定在手术台上，并使用电动剃刀去除腹部表面的毛发。用70%异丙醇擦拭，然后用浸有碘伏的无菌纱布对动物腹部表面进行消毒，操作时使用带齿的剪刀和镊子。从尿道上方约三毫米处至剑突，沿腹中线做一皮下切口。使用剪刀和有齿镊时需小心，避免刺破或切穿腹膜。用含有待成像肿瘤的腹股沟乳腺组织将皮肤轻轻从腹腔分离，保持肿瘤仍与组织相连。将一块玻璃显微镜载玻片紧贴皮瓣放置，以便当小鼠置于载物台上时，肿瘤主体能够平放，且不被后肢遮挡。将显微镜载玻片正确放置后，使用超级胶水将载玻片粘附到皮肤的外表面上。移除固定动物四肢的实验室胶带。打开通往显微镜载物台的麻醉气体管路，然后关闭通往手术平台的麻醉气体管路。迅速将动物转移到显微镜载物台上。转移动物后，调整并固定麻醉管路和鼻罩，确保小鼠保持麻醉状态且体位舒适。将异氟烷浓度降低至1.5%。暴露肿瘤，使其位于显微镜载物台玻璃覆盖成像孔的顶部中央位置。将带有蝶形输液装置的留置腹腔导管连接至含有无菌PBS生理盐水或含碘化丙啶生理盐水的一毫升注射器，并插入体内。插入腹腔导管后，向动物注射含碘化丙啶的生理盐水100微升，并在成像过程结束前每小时追加注射含碘化丙啶的生理盐水50微升。通过目镜确认肿瘤位置正确，并轻轻用胶带将显微镜载玻片和腹腔导管固定。固定载玻片时应松紧适度，确保组织血流不受阻碍。固定载玻片有助于最大限度减少动物呼吸造成的成像伪影，从而获得延时图像。使用开源软件 MicroManager，并利用 IRIS 或其他图像分析软件对原始数据进行编译和分析。荧光标记的 DExT 链可作为药物递送至组织的替代标志物。图中显示的是将与fitzy偶联的两兆道尔顿葡聚糖IV注射到乳腺癌细胞表达蓝色荧光蛋白的小鼠体内后，药物到达肿瘤部位的情况。在药物进入肿瘤后，可对药物的血管外渗和扩散过程进行成像，以测定其血管内半衰期及药物分布情况。此处展示的是将与LOR偶联的10千道尔顿葡聚糖IV注射到乳腺癌细胞表达蓝色荧光蛋白、髓系细胞表达绿色荧光蛋白的小鼠体内后，药物的外渗及分布情况。成像技术可提供有关癌细胞所经历的细胞死亡类型的资讯。此处观察到表达绿色荧光蛋白与组蛋白 H2B 融合蛋白的小鼠体内，细胞核的结构变化提示了坏死或凋亡的发生。经阿霉素治疗后，化疗诱导的癌细胞死亡常导致免疫细胞被募集至肿瘤中产生反应性应答。以下是在小鼠中表达蓝色和绿色荧光蛋白的乳腺癌细胞和髓系细胞对阿霉素急性处理产生基质反应的一个示例。除了可视化化疗对基质的整体反应外，此处还可观察到特化的基质反应。邻近细胞对坏死细胞物质的吞噬作用在掌握后即可清晰显示。该技术可在30至60分钟内完成，若操作得当，可对动物进行12至40小时的成像观察。

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Medicine

医学

实时成像在乳腺癌小鼠模型中的肿瘤微环境对药物的反应

卵巢癌的原位动物模型能更好地模拟人类疾病，因此有助于加深对癌症进展及肿瘤治疗反应的理解。小鼠模型通过包膜内注射表达荧光素酶的卵巢肿瘤细胞建立。治疗通过口服灌胃给药。肿瘤生长通过生物发光成像进行监测。 体内...

体内成像与卵巢癌小鼠原位模型中的治疗处理

通过心内注射表达荧光素酶的乳腺肿瘤细胞，建立小鼠骨转移实验模型。利用生物发光成像和微型CT对肿瘤的发展及其导致的溶骨性病变进行纵向监测。...

监测肿瘤转移和溶骨性病变的生物发光与微型CT成像技术

在乳腺癌脑转移小鼠模型中，利用生物发光成像技术监测缺氧诱导因子-1α活性，以观察颅内肿瘤缺氧的发展过程。...

in vivo 生物发光成像技术在小鼠模型中对乳腺癌脑转移瘤缺氧动态的观察

我们开发了三维共培养模型，可用于实时活细胞成像，以观察乳腺肿瘤细胞与其微环境中其他细胞之间的相互作用，这些相互作用影响着向侵袭性表型的进展。这些模型可作为临床前筛选工具，用于靶向筛选影响侵袭性的旁分泌诱导的蛋白水解、趋化因子/细胞因子及激酶通路的药物。...

用于肿瘤的4D活细胞成像的MAME模型：影响恶性进展的微环境相互作用

来源：Marina Arantes Radicchi1, Victor Carlos Mello1, Victória Paz Machado1, Márcia Cristina Oliveira da Rocha1, Jaqueline Vaz de Oliveira1, Luana Cristina Camargo1,2, Luís Alexandre Muehlmann1, Ricardo Bentes Azevedo1, Sônia Nair Bao1, João Paulo Figueiró...

生物发光成像观察雌性小鼠模型中乳腺肿瘤的进展

本文描述了一种原位乳腺癌原发肿瘤模型，以及通过手术切除原发肿瘤以延长小鼠生存期从而产生自发性转移的方法。肿瘤的生长和进展通过荧光素酶成像进行监测和定量。...

一种自发性乳腺癌转移的原位小鼠模型

本方案描述了利用多光子显微镜对多细胞相互作用进行长时间实时延时成像的方法。 体内...

延长时程活体成像技术用于实时观察肿瘤微环境中多细胞动态变化

本研究提出了一种先进的方案，通过检测绿色荧光蛋白和生物发光信号，并结合定量分子检测技术，精确评估肿瘤负荷。...

利用原位乳腺癌模型研究三阴性乳腺癌

本文介绍了一种非侵入性监测方法，该方法涉及在多种乳腺癌细胞系中表达荧光素酶和绿色荧光蛋白。本方案提供了一种在小鼠体内实时监测肿瘤形成和转移定植的技术。...

利用生物发光技术监测小鼠体内乳腺癌生长及转移灶形成

该论文描述了一种方法，用于建立原位注射乳腺肿瘤后自发性肺转移模型，并对转移级联各阶段进行纵向生长监测，适用于干预转移过程的各个阶段。...

体内成像检测原位注射乳腺肿瘤细胞的自发性肺转移

本文描述了在动物模型中将携带RNA寡核苷酸的磁性氧化铁纳米颗粒递送至转移性乳腺癌的体内给药方案，为癌性核酸的治疗性沉默提供了一种具有临床可行性的方法。...

监测纳米药物在小鼠乳腺癌转移灶中的蓄积

了解利用转盘共聚焦显微镜实时成像小鼠乳腺肿瘤的方法，以追踪药物渗透和治疗反应。该技术可在单细胞分辨率下分析细胞死亡及肿瘤微环境变化，为癌症治疗策略提供重要依据。

小鼠乳腺癌模型中肿瘤微环境对药物反应的活体成像

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