小鼠乳腺癌模型中肿瘤微环境对药物反应的活体成像

本实验的总体目标是实时追踪药物渗透情况以及对治疗性药物给药后的治疗反应。首先对动物给予药物处理，随后通过制作皮瓣暴露含有肿瘤的腹股沟乳腺组织，从而实现上述目标。

然后将小鼠转移至显微镜载物台上，测量血氧饱和度和脉搏率，并插入留置导管用于液体、药物或染料的给药。最后，采集延时图像以供后续分析。最终，可通过活体小鼠乳腺肿瘤的旋转盘共聚焦显微镜观察，获得药物处理下细胞死亡或肿瘤间质相互作用变化的结果。

该方法有助于解答肿瘤微环境领域中的关键问题，例如肿瘤中各种间质成分如何影响治疗反应。开始实验前，请参阅书面实验方案中关于药物给药和成像的典型时间安排。打开玻璃珠灭菌器，并使其升温至至少 200 摄氏度。

将手术器械（包括有齿镊、锯齿状镊子和两把剪刀）用肥皂和水清洗后，使用热珠灭菌器对它们进行灭菌，至少持续30秒。然后让其冷却。将实验室浸泡垫放置在将用作手术平台的泡沫塑料盖顶部。

使用实验室胶带将带有刻线的麻醉系统鼻罩固定在实验浸泡装置上，并将两根18号规格、一又二分之一英寸长的针头通过胶带插入鼻罩两侧的泡沫盖中，以确保鼻罩牢固固定。另备碘伏无菌纱布、两张70%异丙醇擦拭巾、一张载玻片、万能胶以及四段半英寸宽的实验室胶带。

将动物在诱导室中麻醉后，当其呼吸变得深而缓慢时，将小鼠转移至手术平台，腹侧朝上。为避免压力过高，先打开通向手术平台的麻醉气体管路，然后关闭通向诱导室的麻醉气体管路。将异氟烷浓度从4%降低至2.5%。通过足垫夹捏测试确认麻醉深度是否达到手术要求。

如果动物无反应，使用四块实验室胶带将其四肢固定在手术台上，并使用电动剃刀去除腹部表面的毛发。用70%异丙醇擦拭，然后用浸有碘伏的无菌纱布对动物腹部表面进行消毒，操作时使用带齿的剪刀和镊子。从尿道上方约三毫米处至剑突，沿腹中线做一皮下切口。

使用剪刀和有齿镊时需小心，避免刺破或切穿腹膜。用含有待成像肿瘤的腹股沟乳腺组织将皮肤轻轻从腹腔分离，保持肿瘤仍与组织相连。将一块玻璃显微镜载玻片紧贴皮瓣放置，以便当小鼠置于载物台上时，肿瘤主体能够平放，且不被后肢遮挡。

将显微镜载玻片正确放置后，使用超级胶水将载玻片粘附到皮肤的外表面上。移除固定动物四肢的实验室胶带。打开通往显微镜载物台的麻醉气体管路，然后关闭通往手术平台的麻醉气体管路。

迅速将动物转移到显微镜载物台上。转移动物后，调整并固定麻醉管路和鼻罩，确保小鼠保持麻醉状态且体位舒适。将异氟烷浓度降低至1.5%。暴露肿瘤，使其位于显微镜载物台玻璃覆盖成像孔的顶部中央位置。将带有蝶形输液装置的留置腹腔导管连接至含有无菌PBS生理盐水或含碘化丙啶生理盐水的一毫升注射器，并插入体内。

插入腹腔导管后，向动物注射含碘化丙啶的生理盐水100微升，并在成像过程结束前每小时追加注射含碘化丙啶的生理盐水50微升。通过目镜确认肿瘤位置正确，并轻轻用胶带将显微镜载玻片和腹腔导管固定。固定载玻片时应松紧适度，确保组织血流不受阻碍。

固定载玻片有助于最大限度减少动物呼吸造成的成像伪影，从而获得延时图像。使用开源软件 MicroManager，并利用 IRIS 或其他图像分析软件对原始数据进行编译和分析。荧光标记的 DExT 链可作为药物递送至组织的替代标志物。

图中显示的是将与fitzy偶联的两兆道尔顿葡聚糖IV注射到乳腺癌细胞表达蓝色荧光蛋白的小鼠体内后，药物到达肿瘤部位的情况。在药物进入肿瘤后，可对药物的血管外渗和扩散过程进行成像，以测定其血管内半衰期及药物分布情况。此处展示的是将与LOR偶联的10千道尔顿葡聚糖IV注射到乳腺癌细胞表达蓝色荧光蛋白、髓系细胞表达绿色荧光蛋白的小鼠体内后，药物的外渗及分布情况。

成像技术可提供有关癌细胞所经历的细胞死亡类型的资讯。此处观察到表达绿色荧光蛋白与组蛋白 H2B 融合蛋白的小鼠体内，细胞核的结构变化提示了坏死或凋亡的发生。经阿霉素治疗后，化疗诱导的癌细胞死亡常导致免疫细胞被募集至肿瘤中产生反应性应答。

以下是在小鼠中表达蓝色和绿色荧光蛋白的乳腺癌细胞和髓系细胞对阿霉素急性处理产生基质反应的一个示例。除了可视化化疗对基质的整体反应外，此处还可观察到特化的基质反应。邻近细胞对坏死细胞物质的吞噬作用在掌握后即可清晰显示。

该技术可在30至60分钟内完成，若操作得当，可对动物进行12至40小时的成像观察。